カブトガニを使用して、カブトガニポリフェムス、

こんにちは。ボストン大学バイオメディカルエンジニアリング学科の視覚情報処理研究室でディレクターを務めております、クリス・パグリアです。こんにちは、パグリア博士の研究室で博士課程に在籍しているジャック・リュウです。私たちの研究室では、動物が視覚を得ることを可能にする神経計算の解明に取り組んでいます。

本研究では、地球上で最も古くから生きている生物の一つであるアメリカカブトガニを使用します。これらの動物は生きた化石である可能性がありますが、現在でも生物医学研究において不可欠な役割を果たし続けています。

彼らの血液には、科学者が医薬品中の細菌毒素を検出するために利用する特殊な細胞が含まれているだけでなく、その目には、私たちの視覚システムがどのように機能しているかについて多くの洞察を与えてくれた神経ネットワークが存在します。明順応や側方抑制といったプロセスの細胞学的基盤は、この動物の複眼側眼の研究によって初めて明らかにされ、この先駆的な研究により、Keffer Hartline博士は1967年にノーベル賞を受賞しました。カブトガニは、無脊椎動物としては体が大きく丈夫であり、また網膜ニューロンが大きくアクセスしやすいため、視覚研究において引き続き魅力的なモデルとなっています。

カブトガニの視覚系はコンパクトで広範に研究されており、その視覚行動は明確に定義されています。さらに、目の構造と機能は、動物の脳内にある概日時計によって日々調節されています。要するに、カブトガニの視覚系は、理解できるほど単純でありながら、興味を惹かれるほど複雑であると言えます。

このビデオでは、この古典的な動物モデルを用いて生体内で実施できる、視覚の神経基盤を調査するための3つの実験パラダイムについて解説します。視覚研究に用いられるのは、網膜電図記録、視神経記録、および網膜内記録です。カブトガニは、光・暗サイクルが調節された室内の、エアレーションを施した塩水タンクで飼育されています。

これらの記録手法を開始する前に、動物を氷入りバケツで約10分間冷却し、その後、pro somaに2本、EPIs somaに2本のステンレス製ネジを打ち込んで木製プラットフォームに固定します。プラットフォームの下部には、水に沈むように花崗岩の重りを置きます。網膜電図（ERG）を用いて、時間の経過に伴う目の感度をモニタリングします。

これは、眼球内のすべての細胞の総電気反応を測定するものです。光フラッシュを用いるこの手順に必要なツールには、ドライバー、 पेट्रोलियम ジェリー、リンガー液、ピペット、LED、記録室、ステンレス製ネジ、および綿棒が含まれます。ERGの測定には、自作の記録室を使用します。

本体は、眼球に接するように生理食塩水リザーバーを保持するように設計されています。蓋には、導電性溶液をアンプに接続するための塩化銀線と、装着前にLEDを収めるための適切なサイズの小孔が開いています。チャンバーの底面には、 पेट्रोलियमジェリー（ワセリン）が塗布されています。

次に、2本のネジでカブトガニの眼の上に固定したチャンバーに生理食塩水を満たし、キャップで密閉します。個体は、鰓が浸るように海水で満たした水槽内の遮光ケージに入れます。LEDケーブルをチャンバーの蓋に挿入します。

信号リードをチャンバーワイヤーに、リファレンスリードを埋め込みネジのいずれかにクリップで固定し、両方のリードを高インピーダンス差動アンプのヘッドステージに接続して、信号の増幅とノイズフィルタリングを行います。次に、ケージを閉じて動物に室内の光が当たらないようにします。ADステージをアンプに接続し、アンプのフィルターを約 10 hertz 以下の周波数を通過させるように設定します。

そこから信号は、視覚的な確認のためにオシロスコープへ、またコンピュータによる解析および保存のためにデータ収集ボードへと送られます。LEDからの光刺激の提示およびERG信号の記録には、LabVIEWで作成したカスタムプログラムを使用します。LEDは10分ごとに、5 V、100 millisecondのパルスでトリガーされます。左側には各光フラッシュに対するERG波形が表示され、右側には時間の経過に伴う眼の感度変化を追跡するため、連続するフラッシュ波形のpeak-to-peak振幅がプロットされています。

ERG記録を用いることで、明順応や概日リズムによる神経調節の影響を研究することができます。眼は視覚情報を脳へと伝達し、その視神経線維はスパイク応答を示します。これらの符号化された情報は、単一神経線維から細胞外記録を行うことで解析することが可能です。

この手法を用いて、眼にフィードバックされる概日時計の信号を研究することも可能です。本手順に必要な器具は、ドライバー、溶液、ハサミ、記録室、曲がりピンセット、微細針プローブ、鈍いメス、外科用ハサミ、および断面電極です。神経を収容するための舌状構造を備えた記録室を設計し、16ゲージの針を蝶形筋と心臓の間に挿入することで、馬またはカニから20 millilitersの血液を排出させることができます。

放血は必須ではありませんが、動物をプラットフォームに固定した状態で視神経の解剖を行う際、操作が容易になります。視神経の位置は、外眼と内眼の間のカルパス上にわずかに湾曲した線を描くことで推定します。その後、リフィンを用いてカルパスに円形の穴を開けます。

穴の直径はチャンバー底面と同じにします。穴の中心は、外眼から前方に約2 cm、および神経がチャンバーの腹側に沿って走行するように、ラインよりわずかに背側に配置します。神経の全長が見えるまで、結合組織に覆われた部分を除去し、露出した神経を周囲および下層の組織から剥離させます。糸を神経に回し、底面の半円形の開口部からチャンバー内に引き込みます。

同じ開口部を通して、糸を引くことで神経を慎重にチャンバー内へ誘導します。神経がチャンバーに入る際に、神経への伸展を最小限に抑えるため、チャンバーの底部を穴に押し込みます。その後、2本のネジでチャンバーを固定し、リンガー液を満たします。

チャンバーを装着した後、動物を海水で鰓（えら）まで満たしたタンク内の軽量タイドケージに入れます。ステレオ顕微鏡下でチャンバー内部を確認し、血液の流入およびリンゲル液の流出を防ぐため、底部開口部の周囲に綿を詰め込みます。その後、チャンバーに新鮮なリンゲル液を再充填します。

微細な弯曲剪刀とピンセットを用いて、残留組織を除去します。神経を包む鞘に小さな切開を加え、微細な針状プローブで神経を鞘から分離させます。神経の長さに沿って切開しながら、鞘を徐々にほどいて取り除きます。

次に、プローブを用いて神経から微小な神経線維束を分離し、求心性線維の記録を行う場合は眼から最も遠い端を、遠心性線維の記録を行う場合は眼に最も近い端を切断します。記録には、Springer溶液を満たしたAMシステムセクション電極を使用し、吸引用にギルマンシリンジとチューブで接続します。電極の先端は、直径1 mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーの末端を火炎研磨して作製します。信号リードとリファレンスリードはBおよびC接続によって提供され、ノイズを低減するために電極には塩化銀線が巻き付けられています。

電極チップを記録室内に配置し、吸引によって神経束の切端をガラスチップ内に引き込みます。信号リードと参照リードを差動増幅器のヘッドステージに接続し、信号の増幅とノイズ除去を行います。増幅器の出力は、観察用のオシロスコープおよびコンピュータでの解析と保存用のデータ収集カードへと送られます。

光刺激の制御にはLabVIEWで作成したカスタムプログラムを、スパイク列の記録にはデジタルスパイクディスクリミネータを使用します。単一細胞の照明には光ファイバーライトパイプを用い、パターン刺激にはコンピュータ制御のビデオディスプレイを使用します。視神経記録を用いることで、眼と脳の間の信号伝達を網膜内で研究することが可能です。記録の手順としては、眼内の細胞にマイクロ電極を直接挿入し、光によって誘起される細胞内電位の変動を記録します。

本手順に必要な器具には、ドライバー、L字型の透明プラットフォームが含まれます。ガラス電極を覆うためのマイクロ電極用ネジ穴、ステンレス製ネジ、ピンセット、および精密メスを用意します。カニを十分に固定した後、木製プラットフォームおよびネジ穴が設定された透明プレートを、側面2か所と上部1か所の計3本のネジで手節（carpus）に固定します。

動物を、鰓（えら）まで海水で満たされた水槽内の遮光ケージに入れます。電動マイクロポジショナーをネジでブレードに固定し、ポジショナーアームを眼の上に合わせます。外径1 mmのシリケートガラスからガラスマイクロピペットを作成し、毛細管現象によってチップ内部を満たします。

ピペットを3 Mの塩化カリウム溶液が入ったバイアルに数分間浸した後、ピペットの残りの部分を手動で塩化カリウム溶液で満たし、気泡の形成を防ぐためにあらかじめ溶液で満たしたマイクロ電極ホルダーに挿入します。次に、電極ホルダーをマイクロポジショナーに取り付けられた細胞内増幅器のヘッドステージに挿入します。背側の角膜のごく小さな正方形の部分を慎重に切り取り、網膜の一部分を露出させます。

メスを用いて、露出した組織が乾燥するのを防ぐためにリンゲル液を1滴滴下し、マイクロピペットを網膜に向かって進めます。ピペットの先端が溶液に触れると、細胞内増幅器の電流注入モードを起動し、電極インピーダンスを測定します。インピーダンスが 20 から 70 mega ohms の範囲外であるマイクロピペットは廃棄します。この範囲内のピペットを、マイクロメートル単位のステップで網膜内へ進め、先端を電子的に振動させて細胞に刺入します。光刺激は、光ファイバーパイプまたはビデオディスプレイを用いて、刺入する細胞に与えます。

カブトガニの眼には、ユラー細胞、偏心細胞、色素細胞の3種類の細胞が存在します。ユラー細胞は光に対して大きな脱分極反応を示し、偏心細胞は脱分極反応に乗った一連の活動電位を示しますが、色素細胞は光反応を全く示しません。この反応は網膜内記録を用いてオシロスコープで観察し、コンピュータに記録します。これにより、視覚の細胞レベルでの基盤を研究することができます。

結論として、カブトガニを用いてin vivoでの網膜電図記録、視神経記録、および網膜内記録を行う方法を示しました。これらの手法は広く利用されており、カブトガニにおける視覚情報処理の神経メカニズムに関する独自の知見を提供します。これらの方法は、研究室で容易に適用できるだけでなく、視覚神経生理学の教育実習にも簡単に組み込むことができます。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。