大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部のスティーブン・ヘルム研究室のマーカス・トゥです。今日は、大規模なインサート環境ライブラリの構築手順をお見せします。今日の手順で私を補佐するのは、図書館の宿主である大腸菌のファージパッケージングと感染を行うSan Leeと、コロニーピッキングを行うElise HawleyとChin Yangです。

私たちの研究室では、海洋および陸域環境における微生物群集の構造と代謝を研究するために、この手順を行っています。それでは始めましょう。fo smid DNAライブラリーを作成するためのこのプロトコルは、記事の添付Joで詳述されているバイオマスサンプル手順からのゲノムDNAの単離とせん断に続いて開始されます。

次のいくつかのステップでは、SMIDベクターPCCへのライゲーションのためにSHEDNAを準備します。最初のステップは、DNAのSHE断片の末端を修復し、リン酸化することです。5つの主要な端は、このステップに必要なすべての試薬は、震源地からPCC 1つのSMIDライブラリ生産キットに含まれており、エンド修復反応を設定し、氷上のすべての試薬を解凍し、エンドリペアバッファーDNTPを組み合わせ、最大20マイクログラムのTPを混合し、彼女はマイクロリットルあたり0.5マイクログラムのDNAを挿入します酵素ミックスと水80マイクロリットルに達するには、チューブを短時間遠心分離してすべての液体を底。

末端修復反応を室温で45分から1時間インキュベートします。その後、加熱し、摂氏70度で酵素を10分間不活性化します。エンドリペアインキュベーション中に、次のステップのためにゲルを調製できます。

パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)は、30〜60のDNA分子を単離することを目標としています。Kilobases PFGEは、標準的な電気泳動中に一緒に実行されるこれらの大きなフラグメントを分離するための電気泳動法です。まず、150ミリリットルのXTAEランニングバッファーに低融点のarosを使用して1%ゲルを調製します。

80マイクロリットルの末端修復DNAサンプル全体に加えて、バッファーを1つまたは2つのウェルにロードできるコームを選択してください。ゲルの取り扱いは特に低融点のアグロスゲルとして注意してください。ゲルが固化している間、非常に簡単に壊れます。

電気泳動チャンバーを準備します。2.2リットルの1つのXTAEをチャンバーに追加し、機械の電源を入れてランニングバッファーを循環させます。冷却装置を摂氏14度に設定し、ポンプを70RPMに設定します。

NEBのミッドレンジ1つのPFGマーカーを含めます。ゲルを高く切らないようにするには、ゲルシリンジからアロスを押し出し、メスで端から小さなプラグをスライスします。プラグをウェルの前面に置き、溶融したアロスで密封します。

ゲルをセットする前に、ランニングバッファーが摂氏14度に冷却されていることを確認してください。最初の井戸では、ニューイングランドバイオラボラムダヒンディー語3ダイジェストの5マイクロリットルをロードします。2番目の井戸では、10マイクロリットルの滅菌水で希釈したSmidコントロールサイズマーカー1マイクロリットルとローディングバッファーをロードします。

次に、修理した端をロードし、不活性化ミックスとローディングバッファーをロードします。蓋を閉めて、マシンをプログラムします。ジェルは一晩または12時間持続します。

ゲルのランニングが完了したら、サイバーゴールド染色を使用してDNAを視覚化し、サイバーゴールドを希釈します。1つのXTAEの250ミリリットルで、溶液にゲルを入れ、暗いサイバーゴールドで1時間染色します サイバーゴールドは光に敏感です ゲルが染色されている間。摂氏70度の水浴と摂氏45度の水浴を1つ準備し、次のゲル抽出ステップを行います。

次のステップは、切除とゲル化です。30〜60キロベースの希望のサイズ範囲でDNAを精製します。染色したゲルを、破れてラベル付けされた空のマイクロサブフュージチューブと滅菌メスと一緒に青色光トランスルミネーターに持って行きます。

トランスルミネーターをラップで裏打ちして、ゲルが交差汚染しないようにします。ビューインググラスを夜明けにし、青いライトをオンにします。これで、末端が修復されたゲノムDNAとFOスミッドコントロールサイズマーカーを見ることができますメスを使用して、スミッドコントロールサイズマーカーの少し上に移動した幅5〜7ミリメートルのゲルスライスを切除します。

PFG マーカーをスライスの上限として使用します。スライスを引き裂いたチューブに移します。スライスは摂氏マイナス20度で最大1年間保存できます。

さあ、ゲル化する時が来ました。スライスからDNAを精製します。ゲルスライスが入ったチューブの重量を量り、引き裂き重量を差し引いてスライスの重量を計算します。

次に、スライスを摂氏70度のウォーターバスで10〜15分間溶かします。ジェルスライスが完全に溶けたら、チューブを45°Cのウォーターバスにすばやく移します。1ミリグラムの固体ゲルは、溶融後の体積が1マイクロリットルであることを念頭に置いてください。

溶融したarosの100マイクロリットルあたり1ユニットまたは1マイクロリットルのJase酵素製剤を追加します。.摂氏45度で1時間インキュベートします。次に、さらに2〜4マイクロリットルのlesを追加し、摂氏45度でさらに1時間加熱してインキュベートします。

加熱後10分間、摂氏70度でゲルを不活化します。酵素を不活性化し、チューブを氷上に10分間置き、最高速度で遠心分離する。13 、 000 RPM で 15 分間、不溶性粒子をペレット化します。

ペレットを乱さないように注意してください。精製したDNAを含む上清を取り除き、15ミリリットルのファルコンチューブに移します。次に、DNAを洗浄して濃縮するために、次に3ミリリットルの滅菌水でそれをデュートします。

15ミリリットルのファルコンチューブから溶液をウルトラセル10メンブレンを備えたAncon Ultra 4遠心フィルターユニットに移します。アダプターとして50ミリリットルのファルコンチューブを使用してスイングバケットローターにフィルターユニットを置き、4、000GSで6〜8分間回転させます。約100〜500マイクロリットルの溶液になるまで遠心分離します。

フィルターに留まり、流れを捨てます。次に、空のファルコンチューブにさらに3ミリリットルの滅菌水を追加します。溶液をAmonチューブに移し、遠心分離ステップを繰り返します。

ファルコンチューブを3回目に洗い、フィルターに集められた最終容量を50〜100マイクロリットルに減らします。サンプルを紛失する心配はありません。フィルターは、長時間の遠心分離後も50マイクロリットルの液体を保持します。

AmConチューブから残ったDNA溶液を洗浄済みのMicroCon YM 50遠心フィルターユニットに移し、さらに50マイクロリットルの滅菌水でAmonチューブをすすぎ、すべてのDNA遠心分離機を回収します。MicroCon YM 50遠心フィルターユニットは、フィルターがまだわずかに液体で覆われるまで、10、000 GSのマイクロ遠心分離機にあります。毎分チェックしてください。

フィルターに少量の液体しか残っていない場合。フィルターを逆さまにし、1000 GSで3分間、新しいマイクロ遠心チューブで2回目の遠心分離ステップでDNA溶液を回収します。結果として得られる容量は、合計で10〜15マイクロリットルを超えてはなりません。

そうしないと、DNAがライゲーションに対して希釈されすぎる可能性があります。得られたDNA溶液の濃度をNanoDropまたはPico Green Assayで確認します。復旧し、修理しました。

これで、DNAをPCC one FO SMIDクローニングベクターにライゲーションする準備が整いました。ライゲーションでは、すべての試薬を氷上で解凍します。次に、ここにリストされている順序で組み合わせ、追加するたびに混合します。まず、滅菌水を加えて10マイクロリットルの反応量にします。

次に、10 x 高速リンクライゲーションバッファー、10 ミリモル A-T-P-P-C-C 1 つの SMID ベクターを 10 対 1 モルの比率で挿入します。そして最後に、DNAリガーゼを高速リンクします。チューブを短時間遠心分離して、すべての液体を底に送ります。

チューブをタップして、もう一度回転させます。ライゲーション反応を室温で2時間インキュベートし、酵素を70°Cで10分間加熱不活性化します。この時点で、ライゲーション反応をマイナス20°Cで保存するか、ファージパッケージングステップに進むことができます。

次のステップは、FO SMIDライブラリを大腸菌に導入する機能を持つバクテリアファージを生成することです。2、3日前にファージパッケージングステップストリークを行い、提供されたEPI 300 Tの1つの耐性めっき株をプレーンLBプレート上にストリークアウトし、摂氏37度で一晩インキュベートして単一のコロニーを取得します。このプレートを密封して、将来の使用のために摂氏4度で保管できます。包装反応の前日、50ミリリットルのアルビーブロスと10ミリモルの硫酸マグネシウムをEpi 300プレートの単一コロニーに接種し、225RPMと37°Cで一晩シェイクします。

包装反応の日は、新鮮な50ミリリットルのLBブロスと10ミリモルの硫酸マグネシウムに5ミリリットルの一晩培養液を接種します。培養、細菌を摂氏37度からOD600まで0.8〜1.0にします。OD 600 の 1.0 を超えないようにしてください。

分光光度計で測定する前にサンプルを希釈して、正確な結果が得られるようにします。氷上または摂氏4度で、作業を開始する準備ができるまで、または最大72時間保管してください。細菌が感染する準備ができたので、いよいよファージの解凍を準備します。

ラムダパッケージングが氷上で抽出する最大プラーク。ライゲーション反応につき1本のチューブを使用すると、解凍には約10〜15分かかります。その間、空の1.5ミリリットルのチューブを、反応ごとに1つのチューブを使用して氷上で再度事前に冷却します。

ラムダ包装抽出物が解凍されたら、すぐに各包装抽出物の25マイクロリットルに予め冷却した1.5ミリリットルのマイクロフージチューブに移し、氷の上に置きます。残りの包装抽出物を摂氏マイナス80度に戻します。解凍した包装抽出物を氷の上に長時間放置すると、感染効率が低下します。

次に、気泡を導入せずに溶液を数回ピペッティングして混合した氷上で融解した抽出物25マイクロリットルごとに10マイクロリットルのライゲーション反応を加えます。チューブの底にあるすべての液体を短時間遠心分離して固め、パッケージング反応を摂氏30度の水浴で90分間インキュベートします。80分間のインキュベーション後、残りの包装抽出物を氷上で解凍します。

90分間のパッケージング反応が完了したら、残りの25マイクロリットルのパッケージング抽出物を各反応チューブに加えます。反応を30°Cでさらに90分間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、調製したファージ希釈バッファーを各包装チューブに100マイクロリットル加え、各チューブに5マイクロリットルのクロロホルムを穏やかに添加して混合します。

これで、チューブ内の総容量は165マイクロリットルになります。粘性沈殿物は、クロロホルム版の後に形成されることがあります。ファージ粒子をピペッティングする際には、この沈殿物と有機クロロホルム相を避けてください。

この時点で、パッケージ化されたファージ粒子を必要に応じて4度で数日間保存できますが、最良の結果を得るには、新たに調製したファージを使用します。これで、パッケージ化されたファージを使用したファージのパッケージングステップ全体で成長してきた宿主細胞に感染する準備が整いました。パッケージ化されたファージをEPI 300 T 1耐性宿主細胞OD 600.8〜1.0に、ファージ粒子10マイクロリットルごとに400マイクロリットルのepi 300 T耐性細胞の割合で

パッケージファージのチューブの底からクロロホルムをピペッティングしないように、125マイクロリットルのパッケージファージ粒子と5ミリリットルの調製されたepi 300 T One耐性宿主細胞を穏やかに混合し、摂氏37度で30分間インキュベートします。次のステップは、パッケージ化されたファージの力価を決定することです。これを行うには、感染した細菌を培地に播種して、感染した細胞を選択します。

次に、結果として生じるコロニーを数え、プレーティングした細菌に加えられたファージの量で割ります。C one SMIDには、クロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれています。したがって、感染したクローンを選択するには、LBプレートを含むクロラムフェニコールに細菌をプレートします。

ファージに感染したEPI 300 T 1耐性細胞の50マイクロリットルを2回と10マイクロリットルを2回、4つの別々のプレートに広げ、プレートを逆さまにして摂氏37度のインキュベーターに16〜24時間、コロニーが形成されるまで48時間以内に置きます。一方、5ミリリットル感染から残ったEPI 300 T 1耐性細胞を、摂氏4度で3,500GSの遠心分離により10分間採取する。上清を捨てます。

20%グリセロールを含む1ミリリットルのLBをチューブレサスに加えます。.細胞ペレットを懸濁し、2ミリリットルのクライオバイアルチューブにそれぞれ100マイクロリットルにクワットし、すぐに凍結して摂氏マイナス80度で保存します。翌日のコロニーピッキングステップでさらに使用するには、摂氏37度のインキュベーターで4つのプレート上のクローンの数を数え、パッケージ化されたファージの力価を決定します。これは次のステップで使用します。

凍結したEPI 300 T one耐性グリセロールストックには、ライブラリー内のすべての異なるプラスミドで形質導入された細胞が含まれています。次に、各smidのウイルス力価とプレートサイズに基づいて適切な量を広げます。2 45 x 2 45 mm 四方のクローンを作成します。

ガラスビーズを使用したクロラムフェニコールを含むLBのバイオアッセイプレート。また、プレートに少量のLBブロスを加えて、細胞を均等に広げます。グリセロールストックを調製すると、細胞がさらに約5倍に集中することに注意してください。

コロニーピッキングの日に摂氏37度で24時間インキュベートし、LBブロスのウェルあたり200マイクロリットルまたは70マイクロリットルで満たされた96または3 84ウェルプレートを準備します。抗生物質の選択にはブロス1ミリリットルあたり12.5マイクログラムのクロラムフェニコールを、冷凍には10%グリセロールを補給しました。このステップには、自動化されたqfi 3プレート充填システムを使用します。

次のステップは、準備したLB CHLORAMPHENIColプレートから、準備した96または3 84ウェルプレートにコロニーをピックアップして凍結することです。このステップでは、ユーザーズマニュアルに従って、クローンピッキングロボットqix twoを使用して、クローンピッキングエリアの周囲に無菌環境を作り出しています。UVライトが点灯している間、UVライトを30分間オンにします。

500ミリリットルの1%漂白剤、500ミリリットルの滅菌脱イオン水、500ミリリットルの80%エタノールを準備します。UVライトが消灯したら、ラベルの付いたトレイを後ろから前にいっぱいにします。1%漂白剤を充填し、次にオートクレーブ脱イオン水と80%エタノールをフロントトレイに充填します。

ピッキング針は十分な洗浄液がないと適切に洗浄できないため、それらがいっぱいであることを確認してください。最適なピッキングのためのパラメータを設定したら、バクテリアプレートとLB充填96または3 84ウェルプレートの蓋を外し、Qピックのポスト間に配置します。作業エリアのプレートは、ピッキング中に動かないように、右前隅に対してしっかりと固定する必要があります。

次に、フロントパネルを閉じます。すべてのパラメータが設定されると、ピッキング手順を開始できます。すべてのピッキングが完了したら、ブラシとトレイを脱イオン水ですすぎ、ベンチに置いて乾かします。

こぼれた可能性のあるものはすべてクリーンアップし、CICSの内部を80%エタノールで拭きます。すべてのグリセロールストックプレートにラベルが貼られていることを確認し、摂氏37度のインキュベーターに24時間置いて、選択した各コロニーから培養物を培養します。インキュベーターに、インキュベートしたプレートの日付、インキュベーションの時間、取り出しの時間、およびあなたのイニシャルを含むメモを残します。

インキュベーションの後、あなたはあなたのライブラリを持っています。各ウェルには、PCCを含む1つの細菌クローンの培養物が含まれており、開始サンプルから1つの薄いDNAにライゲーションされています。プレートをマイナス80°Cで冷凍して長期保存し、よくやったことを自分に祝いましょう。

提示されたプロトコルは、特定の生息地における微生物群集の遺伝的内容を捕捉するための環境smidライブラリを生成する方法の手順を説明しています。このプロトコルは、サンプリングされた環境の遺伝的含有量を代表するSMIDライブラリを作成し、リーダーが重要なステップを最適化できるようにする必要があります。全手順の最後に得られるFO smidクローンの量が少なすぎる場合。

海水サンプルに由来するゲノムDNAからFO SMIDライブラリーを構築する方法を示しました。この手順を行うときは、高品質のゲノムDNAから始めることが重要です。開始する前にすべてのプレートと試薬を準備し、このマルチステッププロセスに十分な時間を計画してください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。