大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部、Steven Helm研究室のMarcusです。本日は、大きなインサートを持つ環境ライブラリーの構築手順をご紹介します。本日の手順では、ファージパッケージングとライブラリー宿主であるE. coliへの感染を行うSan Leeさん、そしてコロニーピッキングを行うElise HawleyさんとChin Yangさんがサポートします。

当研究室では、海洋および陸上環境における微生物コミュニティの構造と代謝を研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。fosmid DNAライブラリ作成のための本プロトコルは、バイオマス試料からのゲノムDNAの単離および断片化の後から開始します。これらの手順については、付随するJoVEの記事で詳細に説明しています。

続くいくつかのステップでは、SHE DNAをSMIDベクターPCC oneにライゲーションさせるための準備を行います。最初のステップは、SHE DNA断片の末端修復およびリン酸化です。5'末端の処理に必要なすべての試薬は、Epicentre社のPCC one SMIDライブラリ作製キットに含まれています。末端修復反応をセットアップするために、すべての試薬を氷上で融解させ、末端修復バッファー、dNTP、最大20 µgのSHEインサートDNA（0.5 µg/µL）、酵素ミックス、および水を合わせます。最終容量を80 µLにするため、水を加えます。チューブを短時間遠心分離し、すべての液体を底に集めてください。

末端修復反応を室温で45分から1時間インキュベートします。その後、70 °Cで10分間加熱し、酵素を不活性化させます。末端修復のインキュベーション中に、次ステップのためのゲルを準備することができます。

パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）では、30から60 kbの範囲のDNA分子を単離することを目的とします。PFGEは、標準的な電気泳動では共泳してしまうこれらの巨大断片を分離するための電気泳動法です。まず、150 mLの1×TAE泳動バッファーを用いて、低融点アガロースによる1%ゲルを調製します。

末端修復DNAおよびローディングバッファーを含む80 µLのサンプル全量を、1つまたは2つのウェルにロードできるコームを選択してください。低融点アガロースゲルは凝固中に非常に壊れやすいため、ゲルの取り扱いには十分注意してください。

電気泳動槽を準備します。1X TAEバッファーを2.2 L槽に加え、装置を起動して走行バッファーを循環させます。冷却装置を14 °Cに設定し、ポンプを70 RPMに設定します。

NEB製のミドルレンジのPFGマーカーもあわせて含めます。ゲルの切断位置が高くなりすぎないようにするため、ゲルシリンジからarosを押し出し、メスで端から小さなプラグ状に切り出します。このプラグをウェルの前面に配置し、溶融したarosで封止します。

ゲルのロード前に、ランニングバッファーが14 °Cまで冷却されていることを確認してください。最初のウェルに、New England Biolabs Lambda Hindi III 消化液を5 µLロードします。2番目のウェルに、滅菌水10 µLとローディングバッファーで希釈したSmidコントロールサイズマーカーを1 µLロードします。

次に、末端修復および熱不活化させた混合液にローディングバッファーを加えてロードします。蓋を閉め、装置を設定してください。ゲル電気泳動は、一晩または12時間行います。

ゲルの電気泳動が完了したら、Cyber Gold染色剤を用いてDNAを可視化します。Cyber Goldを希釈し、250 mLの1×TAEバッファーに溶解させます。ゲルをこの溶液に入れ、暗所で1時間染色します。Cyber Goldは光感受性があるため注意してください。ゲルの染色中に、次に行うゲル抽出ステップに備えて、70 °Cと45 °Cのウォーターバスを準備します。

次のステップは、切り出しとゲル精製です。目的のサイズ範囲である 30 〜 60 kilobases の DNA を精製します。染色したゲルを、ラベルを貼った空のマイクロチューブおよび滅菌スカルペルと共に、ブルーライト・トランスイルミネーターへ移動させます。

ゲルのクロスコンタミネーションを防ぐため、トランスイルミネーターにラップを敷きます。ビューインググラスを装着し、ブルーライトを点灯してください。これで、末端修復済みゲノムDNAとFO smidコントロールサイズマーカーを確認できます。メスを用いて、smidコントロールサイズマーカーと同じ位置およびそのわずか上方に泳動した、幅5〜7 mmのゲルスライスを切り出します。

PFGマーカーをスライスの境界上端として使用します。スライスをティアードチューブに移してください。次の工程に進むまで、スライスを-20 °Cで最大1年間保存することが可能です。

次に、ゲル回収を行います。切り出したゲルからDNAを精製してください。ゲルスライスが入ったチューブの重量を量り、そこからタレ（容器）の重量を差し引いて、スライスの重量を算出します。

次に、70 °Cのウォーターバスでゲルスライスを10～15分間加熱し、溶解させます。ゲルスライスが完全に溶解したら、速やかにチューブを45 °Cのウォーターバスに移します。なお、1 mgの固体ゲルは溶解後1 µLの体積になることに留意してください。

融解したaros 100 µLあたり、Jase酵素調製液を1ユニットまたは1 µL添加します。45 °Cで1時間インキュベートします。その後、さらに2〜4 µLのlesを添加し、45 °Cでさらに1時間加熱インキュベートします。

加熱後、70 °Cで10分間加熱してゲルを不活化します。酵素を不活化した後、チューブを氷上に10分間置き、その後最大速度（13,000 RPM）で15分間遠心分離して、不溶性粒子をペレット化します。

ペレットを乱さないように注意しながら、精製したDNAを含む上清を回収し、15 mLのファルコンチューブに移します。次に、DNAを洗浄し濃縮するため、3 mLの滅菌水を加えて希釈します。

溶液を15 mLのFalconチューブから、UltraCell 10メンブレンを備えたAmicon Ultra 4遠心フィルターユニットに移します。フィルターユニットを50 mLのFalconチューブをアダプターとして使用してスイングバケットローターにセットし、4,000 ×gで6〜8分間遠心分離します。溶液が約100〜500 µLになるまで遠心分離を行ってください。

フィルター上に保持し、ろ液は廃棄します。次に、空のファルコンチューブに滅菌水をさらに3 mL加えます。この溶液をアモンチューブに移し、遠心分離の工程を繰り返します。

ファルコンチューブを3回目に洗浄し、フィルター上に回収された最終容量を50から100 µLまで減少させます。サンプルの喪失について心配する必要はありません。長時間の遠心分離後であっても、フィルターには50 µLの液体が保持されます。

残りのDNA溶液をAmConチューブからあらかじめ洗浄したMicroCon YM 50遠心フィルターユニットに移し、AmConチューブをさらに50 µLの滅菌水で洗浄して、すべてのDNAを回収します。MicroCon YM 50遠心フィルターユニットを、フィルターがわずかに液体で覆われている状態になるまで、マイクロ遠心機で10,000 ×gで遠心分離します。1分ごとに状態を確認してください。

フィルター上に少量の液体しか残っていない場合は、フィルターを逆さまにし、新しいマイクロ遠心チューブを用いて1000 GSで3分間の2回目の遠心分離を行い、DNA溶液を回収します。得られる総量は10～15 µLを超えないようにしてください。

そうでない場合、DNAが希釈されすぎてライゲーションに不十分な可能性があります。得られたDNA溶液の濃度をNanoDropまたはPico Green Assayで確認してください。回収および修復が完了しました。

DNAをpCC one FO SMIDクローニングベクターにライゲーションする準備が整いました。ライゲーションのために、すべての試薬を氷上で融解させます。次に、以下に記載する順序で混合し、各試薬を追加するたびに混ぜ合わせます。まず、滅菌水を加えて反応液量を10 µLにします。

次に、10x FastLinkライゲーションバッファー、10 mM ATP、pSMIDベクターとインサートを10:1のモル比で加えます。最後にFastLink DNA Ligaseを加えます。チューブを軽く遠心分離し、すべての液体を底に集めます。

チューブをタッピングし、再度スピンダウンします。ライゲーション反応を室温で2時間インキュベートし、70 °Cで10分間加熱して酵素を不活性化します。ここで、ライゲーション反応液を-20 °Cで保存するか、ファージパッケージングのステップに進んでください。

次のステップは、FO SMIDライブラリーを大腸菌に導入するためのバクテリアファージを生成することです。ファージパッケージング工程の2〜3日前に、提供されたEPI 300 T1耐性プレーティング株を通常のLBプレートにストリークし、37 °Cで一晩培養して単一コロニーを得ます。このプレートは密封し、4 °Cで保存して後で使用することができます。パッケージング反応の前日に、Epi 300プレートからの単一コロニーを用いて、10 mM硫酸マグネシウムを添加した50 mLのLBブロスに接種します。225 RPM、37 °Cで一晩振盪培養してください。

パッケージング反応の当日、10 millimolarの硫酸マグネシウムを添加した新鮮な50 milliliterのLBブロスに、オーバーナイト培養液5 milliliterを接種します。細菌を37 degrees CelsiusでOD 600が0.8から1.0になるまで培養します。OD 600が1.0を超えないようにしてください。

正確な結果を得るために、分光光度計で測定する前にサンプルを希釈してください。準備が整うまで、または最大72時間まで、氷上または4 °Cで保存します。細菌が感染準備に整ったので、次はファージの融解準備を行います。

max plaques Lambda Packaging extractを氷上で解凍します。ライゲーション反応1回につき1本のチューブを使用し、解凍には約10〜15分かかります。その間に、反応1回につき1本の空の1.5 milliliterチューブを再度氷上で予冷しておきます。

Lambdaパッケージング抽出液の融解後、直ちに各抽出液25 µLをあらかじめ冷却した1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、氷上に置きます。残りのパッケージング抽出液は-80 °Cに戻してください。融解したパッケージング抽出液を長時間氷上に放置すると、感染効率が低下します。

次に、解凍した抽出液 25 µL が入った各チューブに、ライゲーション反応液 10 µL を加え、気泡が入らないようにピペッティングを数回繰り返して混ぜ合わせ、氷上で保持します。短時間遠心してチューブ底に液を集め、パッキング反応を 30 °C のウォーターバスで 90 分間インキュベートします。インキュベート開始から 80 分後、残りのパッキング抽出液を氷上で解凍します。

90分間のパッケージング反応が完了した後、残りの25 µLのパッケージング抽出液を各反応チューブに加えます。さらに30 °Cで90分間インキュベートします。2回目のインキュベーション後、調製したファージ希釈バッファー100 µLを各パッケージングチューブに加えて穏やかに混ぜ、さらにクロロホルム5 µLを各チューブに加えます。

これで、チューブ内の全量は165 µLになりました。クロロホルム添加後に粘性の沈殿が生じることがあります。ファージ粒子をピペッティングする際は、この沈殿および有機クロロホルム相を避けて採取してください。

この時点で、必要に応じてパッケージング済みのファージ粒子を4°Cで数日間保存できますが、最良の結果を得るためには、調製したばかりのファージを使用してください。これで、ファージのパッケージング手順の間に培養していたホスト細胞に、パッケージング済みファージを感染させる準備が整いました。OD₆₀₀が0.8から1.0のEPI 300 T1耐性ホスト細胞に、ファージ粒子10 µLに対してEPI 300 T1耐性細胞400 µLの比率でパッケージング済みファージを添加します。

パッケージ化されたファージのチューブ底にあるクロロホルムをピペッティングして取り込まないようにするため、125 µLのパッケージ化ファージ粒子と、緩やかに混合した5 mLの調製済みepi 300 T1耐性宿主細胞を用い、37 °Cで30分間インキュベートします。次のステップは、パッケージ化ファージのタイターを決定することです。これは、感染した細菌を培地にプレートし、感染細胞を選択することで行います。

その後、得られたコロニー数をカウントし、プレートに播種した細菌に添加したファージの量で除します。C1 SMIDにはクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれています。したがって、感染したクローンを選別するために、細菌をクロラムフェニコール含有LBプレートに播種してください。

ファージ感染させたEPI 300 T1耐性細胞を、50 µLを2回、10 µLを2回の計4枚の別々のプレートに塗布し、プレートを倒立させた状態で37 °Cのインキュベーターに16～24時間（最大48時間まで）置き、コロニーを形成させます。その間に、5 mLの感染液から残りのEPI 300 T1耐性細胞を、4 °Cで3,500 ×gにて10分間遠心分離して回収します。上清は廃棄してください。

チューブ内の再懸濁液に、20%グリセロールを含むLBを1 mL加えます。細胞ペレットを懸濁させ、2 mLクライオバイアルチューブ2本に各100 µLずつ分注し、直ちに凍結して-80 °Cで保存します。翌日のコロニーピックアップ手順で使用するため、37 °Cのインキュベーター内にある4枚のプレート上のクローン数を数え、次ステップで使用するパッケージ化ファージのタイターを決定します。

冷凍保存されたEPI 300 T one耐性グリセロールストックには、ライブラリ内のすべての異なるプラスミドを導入した細胞が含まれています。次に、ウイルス力価と各プレートのサイズに基づいた適切な量を塗布してください。45 by 45 mmの正方形プレートでクローニングを行います。

ガラスビーズを用いた、クロラムフェニコール含有LB培地のバイオアッセイプレートです。また、細胞を均一に塗布するために、少量のLBブロスをプレートに加えてください。グリセロールストックを調製することで、細胞濃度がさらに約5倍に濃縮されることに留意してください。

コロニーピッキングの日に、37°Cで24時間インキュベートします。96ウェルまたは384ウェルプレートを用意し、各ウェルにLBブイヨンを200 µLまたは70 µLずつ分注します。抗生物質選択のために12.5 µg/mLのクロラムフェニコールを添加し、凍結保存用に10%グリセロールを添加します。このステップには、自動qfi 3プレート充填システムを使用します。

次のステップは、準備したLBクロラムフェニコールプレートからコロニーをピックアップし、凍結用に準備した96ウェルまたは384ウェルプレートに移すことです。この手順では、ユーザーマニュアルに従い、クローンピックアップエリアの周囲に無菌環境を作るため、クローンピックアップロボットqix twoを使用します。UVライトを点灯させ、そのまま30分間放置してください。

1%次亜塩素酸ナトリウム溶液を500 milliliters、滅菌脱イオン水を500 milliliters、および80%エタノールを500 milliliters準備します。UVライトが消えたら、トレイに記載されたラベルに従い、後方から前方向へ液体を満たします。1%次亜塩素酸ナトリウム溶液を満たし、次にオートクレーブ滅菌した脱イオン水を、そして最前方のトレイに80%エタノールを満たします。

十分な洗浄液がないとピッキングニードルを適切に洗浄できないため、液量に不足がないことを確認してください。最適なピッキングのためのパラメータを設定した後、細菌プレートとLBを満たした96ウェルまたは384ウェルプレートの蓋を取り外し、Q picksのポストの間に配置します。作業エリアのプレートは、ピッキング中に動かないよう、右前隅に密着させてください。

次に、フロントパネルを閉じます。すべてのパラメータが設定されたら、ピッキング手順を開始できます。すべてのピッキングが完了したら、ブラシとトレイを脱イオン水ですすぎ、ベンチ上に置いて乾燥させます。

発生したこぼれを清掃し、CICS内部を80%エタノールで拭き上げます。すべてのグリセロールストックプレートにラベルが貼られていることを確認し、選択した各コロニーから培養を行うため、37 degrees Celsiusのインキュベーターに24時間置きます。インキュベーターに、日付、培養したプレート数、培養開始時刻、取り出し時刻、およびあなたのイニシャルを記載したメモを貼っておいてください。

インキュベーション後、ライブラリが完成します。各ウェルには、開始サンプル由来のシアリングDNA断片が1つリガーゼされたPCC one fo smidを含む細菌クローンの培養物が含まれています。長期保存のためにプレートを-80°Cで凍結し、作業の完了を確認してください。

本プロトコルでは、特定の生息地における微生物コミュニティの遺伝的内容を捕捉するための環境smidライブラリの作製手順について解説します。このプロトコルにより、サンプリングされた環境の遺伝的内容を代表するSMIDライブラリを構築し、読者が重要なステップを最適化できるようにすることを目的としています。これは、全手順の最終段階で得られるFO smidクローンの数が不十分な場合に有効です。

海水サンプル由来のゲノムDNAからFO SMIDライブラリを構築する方法について説明しました。この手順を行う際は、高品質なゲノムDNAから開始することが重要です。開始前にすべてのプレートと試薬を準備し、この多段階のプロセスに十分な時間を計画してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。