Name: 大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: 学ぶ大規模挿入環境ゲノムライブラリー構築法。環境サンプルからのゲノムDNA抽出、フォスミドベクターへの挿入、大腸菌を用いたファージパッケージングと感染、自動コロニーピッキングによる384ウェルプレート保存までの手法を解説。微生物叢の遺伝的多様性と代謝機能研究に活用可能。

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我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTとSLは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからの奨学金によってサポートされていました。 MTはまた、ドイツ学術振興協会（DFG）から奨学金の支援を受けた。

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

手順は、最も効率的に沿岸水のサンプルに由来するゲノムDNAを持つ大規模挿入フォスミドライブラリを生成する方法を説明しています。アップストリームゲノムDNAの抽出は、別々のプロトコル[3]に記述されています。 フォスミドライブラリとしての生産は、すべての4つ表示される手順を含む、全体の手続きに間に合うように多段階のプロセス、計画は少なくとも2〜3週間です。ゲノムDNAの抽出は、最も重要なステップであると、すべてのダウンストリームの手順は、抽出されたゲノムDNAの質と量に依存しています。ため、このステップのために十分な時間を費やして検討し、慎重に作業。あなたの抽出されたDNAの質と量の制御は非常に重要です。これはあなたが作るしようとしている最初のライブラリの場合は特にそれは、フォスミドクローンの数が少ないことが起こり得ます。自体はフォスミドライブラリーの構築がまっすぐなので、故障は、主に不十分な品質及び/またはあなたの抽出精製したゲノムDNAの量によって引き起こされます。ゲノムDNAを再抽出し、図書館の建設が成功しなかった場合、精製およびDNA -回復に関連するステップに特別な注意を払...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ステップ II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Fosmid Library Production Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>フォスミドライブラリー 9-10 個分を構築するのに十分な量</td></tr><tr><td>SeaPlaque アガロース</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>撹拌機能付きホットプレート</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>1.0X TAE 泳動バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEF Mapper XA パルスフィールド電気泳動システム（冷却モジュールおよび可変速ポンプを含む）</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA-HindIII 消化済みDNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>MidRange I PFG マーカー</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10,000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ対応プラスチックラップ</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager トランスイルミネーター</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>GELase アガロースゲル消化用調製試薬</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit（Ultracel-10 メンブレン付き）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 回分*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>デジタルドライブロックヒーター</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>遠心機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>遠心機ローター</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ, 1.7 mL, 透明</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ステップ III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 液体培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>ファージ希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ステップ IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート（蓋付き）</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート（蓋付き）</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 100 O.D. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 150 Dia. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>LB 液体培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco アガロース</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix コロニーピッカー</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>ピッキングヘッド (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

Large Insert Environmental Genomic Library Production

自然界における微生物の大半は現在、従来の栽培方法にアクセスできないままです。過去10年間、カルチャに依存しない環境ゲノム（<em&gt;すなわち</em&gt;メタゲノム）アプローチは、研究者は環境から直接土着微生物群集の遺伝的内容をキャプチャすることで、この栽培のギャップを埋めることが可能に、浮上している。この目的のために、ゲノムDNAライブラリーは、巧みな実験室のクローニング技術とはいえ、標準を使用して構築されています。ここでは、季節的低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体に由来するDNAで大規模な挿入、環境ゲノムフォスミドライブラリーの構築について説明します。このプロトコルは直接沿岸海洋の水の採取[1]などの接続プロトコルのシリーズにリンクされている微生物バイオマスの、大量のろ過[2]とDNA抽出と浄化のプロトコル[3]。当初は、高品質のゲノムDNAは、5 - リン酸化平滑末端の作成を終了 - 修理です。エンド修理DNAは、サイズの選択とゲル抽出を30と6万塩基対（KB）の長さの間のDNA断片を回収するために行われるため、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を施す。サイズ選択されたDNAをPFGEゲルマトリックスから精製し、ホスファターゼ処理、平滑末端フォスミドCopyControlベクトルPCC1（EPICENTREに連結され<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;）。 PCC1とインサートDNAのリニアコンカテマーは、その後、ファージ耐性のその後の感染症で、ラムダterminaseによってファージ粒子にパッケージheadfullされています<em&gt; E.大腸菌</em&gt;細胞。成功した形質導入クローンを抗生物質選択の下にLB寒天プレートに回収し、ロボットがピッキング、自動コロニー（Qpix2、GENETIX）を用いて384ウェルプレートフォーマットでアーカイブされます。現在のプロトコルは、（4）〜（7）をEPICENTREからCopyControlフォスミドライブラリーの制作キットを含むさまざまなソースから描画し、複数の研究グループの出版された作品。各ステップは心のベストプラクティスが提示されます。可能な限り我々はライブラリの生産の全体的な品質と効率を向上させるために実行に微妙な点を強調。フォスミドライブラリーの製造と自動コロニーピッキングのプロセス全体が含まれている多くのインキュベーションのステップがあるとして、少なくとも7〜10日かかる。しかし、プロトコル内で言及されている可能性がいくつかの停止ポイントがあります。

季節低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体から分離された環境ゲノムDNAとのフォスミドライブラリーの構築が記載されている。得られたクローンのライブラリーは384ウェルプレートに取り、自動コロニーピッキングシステムのアプリケーションによって下流の塩基配列決定と機能的スクリーニングのためにアーカイブされます。

自然界に存在する微生物の大部分は、現在においても従来の培養法では回収できないままである。過去10年間にわたり、培養に依存しない...

こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部、Steven Helm研究室のMarcusです。本日は、大きなインサートを持つ環境ライブラリーの構築手順をご紹介します。本日の手順では、ファージパッケージングとライブラリー宿主であるE. coliへの感染を行うSan Leeさん、そしてコロニーピッキングを行うElise HawleyさんとChin Yangさんがサポートします。当研究室では、海洋および陸上環境における微生物コミュニティの構造と代謝を研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。fosmid DNAライブラリ作成のための本プロトコルは、バイオマス試料からのゲノムDNAの単離および断片化の後から開始します。これらの手順については、付随するJoVEの記事で詳細に説明しています。続くいくつかのステップでは、SHE DNAをSMIDベクターPCC oneにライゲーションさせるための準備を行います。最初のステップは、SHE DNA断片の末端修復およびリン酸化です。5'末端の処理に必要なすべての試薬は、Epicentre社のPCC one SMIDライブラリ作製キットに含まれています。末端修復反応をセットアップするために、すべての試薬を氷上で融解させ、末端修復バッファー、dNTP、最大20 µgのSHEインサートDNA（0.5 µg/µL）、酵素ミックス、および水を合わせます。最終容量を80 µLにするため、水を加えます。チューブを短時間遠心分離し、すべての液体を底に集めてください。末端修復反応を室温で45分から1時間インキュベートします。その後、70 °Cで10分間加熱し、酵素を不活性化させます。末端修復のインキュベーション中に、次ステップのためのゲルを準備することができます。パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）では、30から60 kbの範囲のDNA分子を単離することを目的とします。PFGEは、標準的な電気泳動では共泳してしまうこれらの巨大断片を分離するための電気泳動法です。まず、150 mLの1×TAE泳動バッファーを用いて、低融点アガロースによる1%ゲルを調製します。末端修復DNAおよびローディングバッファーを含む80 µLのサンプル全量を、1つまたは2つのウェルにロードできるコームを選択してください。低融点アガロースゲルは凝固中に非常に壊れやすいため、ゲルの取り扱いには十分注意してください。電気泳動槽を準備します。1X TAEバッファーを2.2 L槽に加え、装置を起動して走行バッファーを循環させます。冷却装置を14 °Cに設定し、ポンプを70 RPMに設定します。NEB製のミドルレンジのPFGマーカーもあわせて含めます。ゲルの切断位置が高くなりすぎないようにするため、ゲルシリンジからarosを押し出し、メスで端から小さ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

ここでは、T7リニアRNA増幅に基づく遺伝子発現解析用のライブラリーのシークエンシングの両方シングルリードとペアエンドイルミナのmRNA -...

10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ

遺伝子レポーターアッセイは、DNA配列とその遺伝子調節活性との関係を解剖するための確立された強力なツールです。候補の調節要素を、同定配列タグを持つレポーター遺伝子に結合させることで、これらのアッセイの大規模な並列化が可能になります。...

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環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

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BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

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短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ

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挿入型突然変異誘発細胞ライブラリーにおける機能関連レンチウイルス組み込み部位の同定

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実験計画法と自動化ワークフローで実現された遺伝子コード化されたバイオセンサー設計空間の効率的なサンプリング

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凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

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大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

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