Name: 大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 59 s
Description: 学ぶ大規模挿入環境ゲノムライブラリー構築法。環境サンプルからのゲノムDNA抽出、フォスミドベクターへの挿入、大腸菌を用いたファージパッケージングと感染、自動コロニーピッキングによる384ウェルプレート保存までの手法を解説。微生物叢の遺伝的多様性と代謝機能研究に活用可能。

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我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 MTとSLは、微生物の多様性と進化（CMDE）用トゥーラ基礎資金センターからの奨学金によってサポートされていました。 MTはまた、ドイツ学術振興協会（DFG）から奨学金の支援を受けた。

<ol><li>Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seawater+sampling+and%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Seawater sampling and.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. 28, (2009).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+Filters+and+Cesium+Chloride+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation.</a> J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).</li>
<li>Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+Ocean%27s+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean's interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+methanogenesis%3A+testing+the+hypothesis+with+environmental+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics.</a> Science. 305, 1457-1462 (2004).</li>
</ol>

手順は、最も効率的に沿岸水のサンプルに由来するゲノムDNAを持つ大規模挿入フォスミドライブラリを生成する方法を説明しています。アップストリームゲノムDNAの抽出は、別々のプロトコル[3]に記述されています。 フォスミドライブラリとしての生産は、すべての4つ表示される手順を含む、全体の手続きに間に合うように多段階のプロセス、計画は少なくとも2〜3週間です。ゲノムDNAの抽出は、最も重要なステップであると、すべてのダウンストリームの手順は、抽出されたゲノムDNAの質と量に依存しています。ため、このステップのために十分な時間を費やして検討し、慎重に作業。あなたの抽出されたDNAの質と量の制御は非常に重要です。これはあなたが作るしようとしている最初のライブラリの場合は特にそれは、フォスミドクローンの数が少ないことが起こり得ます。自体はフォスミドライブラリーの構築がまっすぐなので、故障は、主に不十分な品質及び/またはあなたの抽出精製したゲノムDNAの量によって引き起こされます。ゲノムDNAを再抽出し、図書館の建設が成功しなかった場合、精製およびDNA -回復に関連するステップに特別な注意を払...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ステップ II&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CopyControl&amp;#8482; Fosmid Library Production Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>CCFOS110</td><td>フォスミドライブラリー 9-10 個分を構築するのに十分な量</td></tr><tr><td>SeaPlaque アガロース</td><td>Cambrex</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>撹拌機能付きホットプレート</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>1.0X TAE 泳動バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHEF Mapper XA パルスフィールド電気泳動システム（冷却モジュールおよび可変速ポンプを含む）</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;#955; DNA-HindIII 消化済みDNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3012S</td><td></td></tr><tr><td>MidRange I PFG マーカー</td><td>New England Biolabs</td><td>N3551S</td><td></td></tr><tr><td>10,000X SYBR Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ対応プラスチックラップ</td><td>Saran premium wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager トランスイルミネーター</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>GELase アガロースゲル消化用調製試薬</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>G09100</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit（Ultracel-10 メンブレン付き）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 回分*#</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>デジタルドライブロックヒーター</td><td>VWR international</td><td>12621-088</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR international</td><td>14231-854</td><td></td></tr><tr><td>遠心機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>遠心機ローター</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>JA 5.3</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ, 1.7 mL, 透明</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ステップ III&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 液体培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>ファージ希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ステップ IV&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート（蓋付き）</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003370(3370)</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート（蓋付き）</td><td>Fisher Scientific</td><td>07201157(3680)</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 100 O.D. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 150 Dia. x 15mm H</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm</td><td>VWR international</td><td>CABD351040</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>LB 液体培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Difco アガロース</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-1</td><td></td></tr><tr><td>QFill3</td><td>Genetix</td><td>X3050</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>Javex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>QPix コロニーピッカー</td><td>Genetix</td><td>QPix2</td><td></td></tr><tr><td>ピッキングヘッド (E. coli)</td><td>Genetix</td><td>X4006</td><td></td></tr></tbody></table>

大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

Large Insert Environmental Genomic Library Production

自然界における微生物の大半は現在、従来の栽培方法にアクセスできないままです。過去10年間、カルチャに依存しない環境ゲノム（<em&gt;すなわち</em&gt;メタゲノム）アプローチは、研究者は環境から直接土着微生物群集の遺伝的内容をキャプチャすることで、この栽培のギャップを埋めることが可能に、浮上している。この目的のために、ゲノムDNAライブラリーは、巧みな実験室のクローニング技術とはいえ、標準を使用して構築されています。ここでは、季節的低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体に由来するDNAで大規模な挿入、環境ゲノムフォスミドライブラリーの構築について説明します。このプロトコルは直接沿岸海洋の水の採取[1]などの接続プロトコルのシリーズにリンクされている微生物バイオマスの、大量のろ過[2]とDNA抽出と浄化のプロトコル[3]。当初は、高品質のゲノムDNAは、5 - リン酸化平滑末端の作成を終了 - 修理です。エンド修理DNAは、サイズの選択とゲル抽出を30と6万塩基対（KB）の長さの間のDNA断片を回収するために行われるため、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を施す。サイズ選択されたDNAをPFGEゲルマトリックスから精製し、ホスファターゼ処理、平滑末端フォスミドCopyControlベクトルPCC1（EPICENTREに連結され<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"&gt; http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a&gt;）。 PCC1とインサートDNAのリニアコンカテマーは、その後、ファージ耐性のその後の感染症で、ラムダterminaseによってファージ粒子にパッケージheadfullされています<em&gt; E.大腸菌</em&gt;細胞。成功した形質導入クローンを抗生物質選択の下にLB寒天プレートに回収し、ロボットがピッキング、自動コロニー（Qpix2、GENETIX）を用いて384ウェルプレートフォーマットでアーカイブされます。現在のプロトコルは、（4）〜（7）をEPICENTREからCopyControlフォスミドライブラリーの制作キットを含むさまざまなソースから描画し、複数の研究グループの出版された作品。各ステップは心のベストプラクティスが提示されます。可能な限り我々はライブラリの生産の全体的な品質と効率を向上させるために実行に微妙な点を強調。フォスミドライブラリーの製造と自動コロニーピッキングのプロセス全体が含まれている多くのインキュベーションのステップがあるとして、少なくとも7〜10日かかる。しかし、プロトコル内で言及されている可能性がいくつかの停止ポイントがあります。

季節低酸素フィヨルドの垂直方向の深さの連続体から分離された環境ゲノムDNAとのフォスミドライブラリーの構築が記載されている。得られたクローンのライブラリーは384ウェルプレートに取り、自動コロニーピッキングシステムのアプリケーションによって下流の塩基配列決定と機能的スクリーニングのためにアーカイブされます。

自然界に存在する微生物の大部分は、現在においても従来の培養法では回収できないままである。過去10年間にわたり、培養に依存しない...

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生物学

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大規模な挿入環境ゲノムライブラリーの製造

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