Name: パターニングの生体分子の微小電極上に自己組織膜を汚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-25T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶPEG自己組織化単分子膜を用いた微小電極のバイオフォーリング防止と電気泳動によるマイクロチューブルパターニング手法。シリコン基板上の金電極で生体分子をナノスケールで精密配置する技術を習得できます。

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我々は、SAMの形成に有用な議論をメリッサGrunlanを認めます。この研究は、ロバートA.ウェルチ財団（A - 1585）で部分的にサポートされていました。

試薬の調製 PIPESバッファー（KOHでpH6.8に調整した80mMのPIPES、1mMのMgCl 2を 、1mMのEGTAを、）準備する。 -70分注し、店舗のグルコースオキシダーゼ、カタラーゼとグルコース-20 ° Cとタキソール℃の既存のプロトコルに応じて。-70 1,2分注しストアのチューブリン° C供給者が含まれている手順に従って。 リソグラフィーを用いたパターンのAu微小電極<ol><li>スクライブまたはウェハのカッターを使用して1 Cm&#39;と1.5cmの基板にシリコンウエハーをカット。それらをカバーし、5分間超音波処理するのに十分なアセトンをビーカーに配置することにより、基板をクリーニング。基板を乾燥させることなく、新鮮なアセトンでそれらを洗い流した後、直ちにイソプロパノールと乾燥を使用して窒素ですすいでください。 </li><li>希望の機能の大きさに応じて、標準、ポジ型のフォトリソグラフィーや電子線リソグラフィーを用いてクリーンな基板上にAu電極を作製。3パターンの形状を設計するとき、によってカバレッジを確保するために、100ミクロン以下の各電極パターンの直径を保つPEG SAM（次のセクションで説明）。電極（図1）でパッドを接続して1mmの線のパターンから500 mmまでの300を位置付け接触パッドを（〜300 mm 2）を含めます。フローチャンバーを組み立てるためのパターンの周囲にスペースを可能にするために基板の中央付近にリソグラフィパターンを置きます。 <img border="0" src="/files/ftp_upload/1390/1390fig1thumb.jpg" alt="図1" /> 図1サンプルの形状。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 </li><li>レジスト層のパターンの開発の後、ピンセット（図1）を使用して、基板のエッジに接触パッドからレジストのラインに傷を付けない。金属蒸着時には、スクラッチは、電極と基板の端との間の電気的接触が可能になります。好ましくは二つの情報源と成膜チャンバは、、金属層を堆積させるために使用されます。電極は、真空を破ることなく、Auの6nmのに続いてCrのは2nm（接着用）の堆積によって形成される。チャンバー内部に搭載した水晶振動子マイクロバランス法は、蒸着時のフィルムの厚さを測定するために使用することができます。 </li></ol> SAMを準備<ol><li>予熱および75換気の良い場所で℃のオーブン250mLのガラスビーカーにトルエン20mLを添加することによりシリル化ソリューションを準備する。その後、プラスチックピペットを用いてトルエンに1 mLのPEG -シラン（すなわち5％v / v）を追加。ピペッティング5〜10倍にしてから30秒間ピペットで撹拌することにより、PEG -シランよくで混ぜる。 </li><li>彼らは完全にPEG -シラントルエン溶液中に浸漬され、均等にビーカーの底部全体に等間隔ていることを確認しながら、上を向いてパターニングされた側とビーカー内でパターン化されたサンプルを置きます。オーブンでビーカーを置き、75で18〜21時間を焼く℃にSAMが形成されている間、対向の準備（下記参照）と、残りの手順に必要な追加のコンポーネントを組み立てます。 </li><li>オーブンで18〜21時間後、トルエンは粘性PEG -シラン残渣にパターン化されたサンプルを残して蒸発してください。ビーカーにトルエン20mlを追加して1-2分のサンプルを浸す。ビーカーからサンプルを削除してから、トルエン、イソプロパノールでリンスし、窒素を用いて最終的に乾燥した。この時点で、サンプルがきれいになっているはずですし、SAMの層は、肉眼では見えないはずです。 SAMのは、涼しい乾燥した条件（25℃、適度な湿度）下で保存した場合、最大2日まで使用可能なこの方法を準備した。表面の曇りや凹凸のある色のついた残のコーティングで失敗したSAMの形成の結果。 </li></ol>対向を作り上げる微小電極の堆積のために使用される同一成膜室のセットアップでは、22 × 50mmの1番か0番のガラスカバースリップ上のAuの4nmのに続いてCrの1nmを、堆積することによって対向電極を作る。対向はライトグレーやピンクの色合いとほぼ透明にする必要があります。それをきれいに保つためにシャーレにコーティングされた側を対向して保管してください。 MTSにチューブリンの重合<ol><li>未標識チューブリンとローダミンのチューブリンを解凍し、すぐに明るいMTを取得するために非標識する標識された1:2の比率で組み合わせる。数回上下にピペッティングして混ぜる。 37加熱した水浴中で20-40分のためのチューブリンを重合℃にMTの長さが長く、重合時間のために大きくなります。チューブリンが重合している間、PIPES緩衝液を含むマイクロ遠心チューブに20 mMにタキソールを追加することによって、PIPES -タキソールバッファを準備。上下に数回ピペッティングし、ボルテックスでよくタキソールを混合し、37℃で加熱した浴中にチューブを置きます℃に重合後、暖かいPIPES -タキソールバッファとシールドは1 / 100でMTを薄める軽いから。このようにして調製したMTSは、時間とさらに希釈することによって減らすことができるバンドルを、上に細長いなります。 </li><li> 30 mLの冷PIPES緩衝（0-4℃）、2 -メルカプトエタノール50％、カタラーゼ5mLのグルコースオキシダーゼ、5mLの、そして5mLのグルコースの5 mLを組み合わせることにより10倍の酸素掃気混合物（OS）を用意する。グルコース最後に追加する必要があります。各コンポーネントを追加した後に3-5回ピペッティングにより混和する。氷の上でOSの混合物を置き、それは約2時間のために効果的なままになります。 </li><li>準備MTSは1XのOSが混在してMTの重合が成功したことと、MTSはイメージングすることにより、蛍光励起の数分で安定していることを確認します。イメージングのためにこのようにして調製したMTSは、ローダミンの蛍光に適した励起/発光フィルターの組み合わせを使用してください。さらに1 × OSのミックスでPIPES緩衝とイメージングを使用して1 / 10 1 / 100にして、MTSを希釈することにより、イメージング、個々のフィラメントに最適な希釈率を決定する。 </li><li>両面テープの2つが離れて2〜3ミリメートルを置くと大（22 × 50 mm）と小型（22 × 22ミリ）のガラスカバースリップを挟むことにより、フローチャンバーを準備します。テープは簡単にガラススライド上に置き、カミソリの刃で切断して短冊状にカットされます。マイクロピペットを用いてフローセルにMTのいくつかのマイクロリットルを導入する。高倍率のイメージングのために、長い作動距離の目標は、イメージングフローチャンバーの上面のために必要となる場合があります。フローチャンバーの上面にカバースリップ/試料表面からの距離は、テープの厚さによって決定されると60〜100ミリメートルでなければなりません。 </li></ol>電気泳動を用いてパターンのMT <ol><li>電極は、テープ（図2）に垂直に接続するパスとストリップの間にあるような模様の、SAM被覆したサンプル全体に両面テープの二つの薄いストリップを配置することにより、電気泳動槽を準備します。このようなテープに触れる金属側に両面テープで対向電極を配置することを約3mm（図2）によるサンプルのオーバーハング対向のエッジ。被覆銅マグネットワイヤーのいくつかの15cmの長さをカットし、両端から絶縁体の1cmをはがします。 （これはマルチメータで確認できます）対向電極との電気的接触を避けるために注意しながら銀塗装の小さなドロップを使用して、基板の露出のAuのエリアにワイヤを取り付けます。銀塗料を使用して対向する2番目のワイヤを取り付けます。銀の塗料で接続されたワイヤは、さらにテープで試料に固定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/1390/1390fig2thumb.jpg" border="0" alt="図2" /> 倒立型蛍光顕微鏡は図2。フローセルアセンブリ。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1390/1390fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。 </li><li> 1 ×最終濃度でOSと組み合わせてPIPES緩衝液を用いて所望の希釈でMTを導入する。 20倍の倍率で画像や電圧を印加する前に、シリコンウエハ上にパターンを見つけます。に応じて、フローチャンバーは、フローチャンバーの平面内の流体の流れとMTの移行を防止するために磨く爪を使ってシールすることができる。 </li><li>最大1 Vの電圧を印加し、MTの移行を観察。 MTの可逆的トラップが望まれる場合、低い電圧（0.5 V程度まで）を用いてもよいですが、これは横方向のドリフトを防ぐために、フローチャンバーを密閉する必要があります。マニキュアは、フローチャンバーの開口端をシールに適しています。約0.7 V以上の電圧では、いくつかMTの密着性は、それは弱いだろうけど、パターンに見られるかもしれない。約0.9 V以上の電圧で、MTの移行は速くなり、密着性が強くなります。約1.2 Vの上に誘導電気分解（ガスの気泡形成）のため、また、微小電極を破壊する可能性が大幅に増加します。移行は、顕微鏡の焦点の垂直面を調整することによって追跡することができます。正しく実施した場合、MTSは電極表面でローカライズされます。 </li></ol>

<ol><li>Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html</a> (2009).</li>
<li>Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html">http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Microlithography%2C+Micromachining%2C+and+Microfabrication%3A+Microlithography%22">Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography</a>. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

MTの移行を容易にするため、その明るさと低バックグラウンドの蛍光を蛍光顕微鏡を用いて可視化されています。それが唯一の生体分子は緩衝液の適切な調整により、正味の電荷を運ぶために誘導されている必要がありますように、メソッドは、一般的に生体分子パターニングに適用可能である。このようなキャピラリー電気泳動に使用されるシリカの壁などの無帯電した表面が存在するため、電気浸透は、この設定で回避されます。 この方法のいくつかの変更が可能です。開放端からの蒸発は、バルク流体の流れと望ましくないMTの移行を発生するため、フローチャンバーの両端をシールする可逆性を観察することが重要です。リソグラフィパターニングの前にシリコンウェーハの酸化が同時に使用される独立した電位を持つ複数の電極を可能にする、基板を介して導通を防止します。

第1ホウケイ酸ガラスカバースリップ（22 X 50 mm）をVWRから購入した。洗練された電子グレードのp -型&lt;111&gt;のシリコンウェーハを高純度銀の塗料が構造プローブ株式会社（カタログ＃5001 AB）から得られたアディソンエンジニアリング、（株）から購入した。絶縁ファインゲージの銅製マグネットワイヤーは、（〜0.08ミリメートル（0.003）直径）電子供給会社から入手することができます。

パターニングの生体分子の微小電極上に自己組織膜を汚

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

我々は、金の微小電極とシリコン基板上にポリ（エチレングリコール）（PEG）トリメトキシシラン自己組織化単分子膜（SAM）を形成するための手順を示します。 PEG - SAMは、単一のアセンブリ工程で形成し、シリコンと金の表面に生物付着を防止しています。 SAMは、標準、ポジ型のリソグラフィでパターン化されたコートの微小電極に使用されます。例として、微小管を使用して、我々は、可逆的な方法でSAM被覆電極に電気泳動を誘導するDC電圧を印加してください。フローチャンバーは、イメージングのために電気泳動と微小管のパターニングを使用されています<em&gt;その場で</em&gt;落射蛍光顕微鏡を用いて。それは標的分子を固定化する電気泳動を採用し、したがって、特定の分子の相互作用を必要としないとして、このメソッドは、一般的に生体分子パターニングに適用可能である。さらに、それは直接リソグラフィ技術を使用してパターンにSAM分子を試みるときに発生する問題を回避することができます。電子ビームリソグラフィーとの互換性は、このメソッドは、ナノスケールのパターンの生体分子に使用できるようになります。

我々は、金の微小電極とシリコン基板上にポリ（エチレングリコール）自己組織化単分子膜を（PEG - SAM）を形成するための手順を示します。 PEG - SAMは、単一工程で形成し、シリコンと金の表面に生物付着を防止しています。電気泳動は、ナノスケールにパターニング生体分子のためにダウンして使用されます。

金が蒸着されたシリコン基板上に、ポリエチレングリコール（PEG）トリメトキシシラン自己組織化単分子膜（SAM）を形成する手順を提示します。

この手順では、まずシリコン基板上にマイクロ電極を作製します。次に、微小管のファウリングを防ぐため、マイクロ電極と基板の上にポリエチレングリコール自己組織化単分子膜を形成します。その後、ルミニンで標識した微小管を調製します。最後に、電気泳動を用いて、パターン化された電極上に微小管を配置します。こんにちは、テキサスA&amp;M大学物理学科のNana研究室および生物医学工学科の分子バイオメカニクス研究室のJohn Noelです。私は物理学科のWil free Tezaで、テキサスA&amp;M大学のCenter Skill Science and Technologyの責任者を務めています。私はテキサスA&amp;M大学バイオメディカル工学科、分子バイオメカニクス研究室のディレクター、Juan Quangです。本日は、非特異的吸着防止性の自己組織化単分子膜でコーティングされたマイクロ電極の作製手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、電気泳動による微小管の配向性を研究しています。では、始めていきましょう。まず、スクライバーまたはウェハーカッターを使用して、シリコンウェハーを基板として用いるための1 cm × 1.5 cmのサイズに切断します。次に、基板を十分な量のアセトンが入ったビーカーに入れ、基板を乾燥させないように注意しながら5分間超音波洗浄して、基板を洗浄します。それらを新鮮なアセトンで洗浄した後、直ちにイソプロパノールで再度洗浄し、窒素を用いて乾燥させます。標準的なポジ型フォトリソグラフィーまたは電子ビームリソグラフィーを用いて、洗浄済みの基板上に金マイクロ電極を作製します。パターン形状を設計する際は、各電極パターンの直径を100 microns未満に抑えてください。ポリエチレングリコールトリメトキシシラン自己組織化単分子膜（PEG SAM）によって確実に被覆されるように、パターンから300 to 500 micrometersの位置にコンタクトパッドを配置し、パッドと電極を1 millimeterのラインで接続してください。レジスト層にパターンを形成した後、ピンセットを使用して、コンタクトパッドから基板端までレジストに線をひっかきます。金属堆積を行うことで、このひっかいた線が電極と基板端との間の電気的接点となります。金属層の堆積には、好ましくは2つのソースを備えた堆積チャンバーを使用します。電極は、2 nmのクロムを堆積させた後、6 nmの金を堆積させることで形成します。真空を破ることなく、チャンバー内部に装備された水晶振動子マイクロバランスを用いて、堆積中の薄膜の厚さを測定することが可能です。次に、換気の良い場所で自己組織化単分子膜の調製を開始し、オーブンを75 °Cに予熱します。250 mLのガラスビーカーに20 mLのトルエンを入れ、そこに1 mLのpeg selineを加えて機能化溶液を調製します。ピペッティングで5〜10回上下に混ぜた後、ピペットで30秒間攪拌し、十分に混合させます。パターンサンプルをパターン面を上にしてビーカーに入れ、サンプルが完全に溶液に浸かり、かつビーカーの底に均等に配置されていることを確認します。ビーカーをオーブンに入れ、SAMが形成されるまで18〜21時間焼き付けます。22 by 50 mmのガラスカバースリップ上に、1 nmのクロムを蒸着させた後、4 nmの金を蒸着させて対極を作製します。対極は、薄い灰色またはピンク色を帯びたほぼ透明な状態である必要があります。汚れを防ぐため、対極はコーティング面を上にしてシャーレに保管してください。オーブン内で18〜21時間経過した後、ビーカーをオーブンから取り出します。トルエンが蒸発し、パターン試料が粘性の高いPEGクリン残渣の中に残っているはずです。ビーカーにトルエン20 millilitersを加え、試料を1〜2分間浸します。サンプルをビーカーから取り出し、トルエン、次いでイソプロパノールで洗浄し、最後に窒素で乾燥させます。この時点で、サンプルは清潔に見え、SAM層は肉眼では確認できないはずです。このように調製したSAMは、涼しく乾燥した条件下で保存した場合、最大2日間使用可能です。SAM形成に失敗すると、表面に濁った、あるいは色むらのある残留コーティングが生じます。SAMの調製が完了したら、チューブリンの微小管への重合を開始します。まず、ラベルなしチューブリンとロドミン標識チューブリンを融解し、明るい微小管を得るために、ラベルなしとラベルありを2:1の比率で直ちに混合します。ピペッティングを数回繰り返し、十分に混合させます。次に、37 °Cに設定した恒温水槽内で、tubulinを20〜40分間重合させます。その間に、20 µMのTaxolをpipee緩衝液に混合し、pipes Taxol緩衝液を調製します。ピペッティングを数回繰り返し、ボルテックスで十分に混合した後、チューブを37 °Cの恒温槽に入れます。重合後、微小管を温めたTaxolバッファーで希釈し、遮光保存します。微小管の重合が成功していること、および数分間の蛍光励起下で微小管が安定していることを確認してください。チューブリンの微小管への重合が完了した後、酸素捕捉剤混合液を用いて、調製した微小管をイメージングします。次に、電気泳動によるMTSのパターニングを開始します。まず、両面テープをガラススライドの上に置き、カミソリで細い帯状に切り出します。パターニングされたSAMコーティング試料に、電極がテープの間に位置し、接続パスがテープに対して垂直になるように、2本の両面テープを貼り付けます。対極を両面テープの上に、金属面がテープに接するように配置し、サンプルの端が対極から約3 mmはみ出すようにします。被覆付き銅マグネットワイヤーを15 cmの長さに数本切り、両端の被覆を1 cm剥がします。少量の銀ペイントを用いて、基板の露出した金領域にワイヤーを固定します。その際、対極と電気的に接触しないように注意してください。次に、銀ペーストを使用して、2本目の電線を対極に取り付けます。銀ペーストで取り付けた電極線は、テープを用いてサンプルにさらに固定することができます。続いて、ピペットを用いて、目的の希釈濃度の微小管を導入し、20倍の倍率でシリコンウェハー上のパターンを確認してから電圧を印加します。フローチャンバーには深さがあるため、フローチャンバーの上表面をイメージングするには、作動距離の長い対物レンズが必要になる場合があります。試料表面からフローチャンバー上表面までの距離はテープの厚さによって決まり、約 60 to 100 micrometers になります。最大 1 volt の電圧を印加し、微小管の移動を観察します。微小管の可逆的なトラッピングを目的とする場合は、マニキュアを用いてフローチャンバーを密封し、横方向へのドリフトを防止させ、電圧を約0.5 Vまで下げて使用してください。移動の追跡は、顕微鏡の垂直方向の焦点面を調整することで可能です。印加電圧を約0.9〜1.2 Vに設定すると、微小管が電極表面に局在します。電圧を高くすると移動速度が上がり、接着が強くなりますが、電圧が高すぎると電気分解が誘発され、脱重合が起こります。微小管についてですが、SAMコーティングを施したマイクロ電極は微小管の吸着を防ぐため、ここでは微小管パターニングに向けたSAMコーティング済みマイクロ電極の作製方法を説明しました。この手順は、微小管的可逆的パターニングにも利用可能です。さらに、このプロセスは微小管に限られたものではなく、一般的なバイオ分子のパターニングにも利用可能です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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