Name: 移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-17T16:04:00.000+00:00
Duration: 21 min 1 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚の細胞移植によるキメラ作成法。ブラスチュラ期またはガストラ期に細胞を移植し、発生過程における遺伝子機能の細胞自律性と非自律性を評価する技術です。

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この記事の執筆中に役立つ、入力用Moensラボのメンバーに感謝します。 HKは、NIH / NICHD助成金＃5R01HD037909 - 08でサポートされているポスドク研究員です。 CBMは、ハワードヒューズ医学研究所との研究者でもある。

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+developmental+potential+of+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo.</a> Trends Genet. 4, 68-74 (1988).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ-cell+development%3A+the+zebrafish+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective.</a> Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124, 3157-3165 (1997).</li>
<li>Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+nanos-related+gene+is+essential+for+the+development+of+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.</a> Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).</li>
<li>Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissues+and+patterning+events+required+for+distinct+steps+in+early+migration+of+zebrafish+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells.</a> Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+by+attraction+towards+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target.</a> Development. 129 (1), 25-36 (2002).</li>
<li>Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).</li>
<li>Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+zebrafish+pbx+proteins+reveals+a+hindbrain+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state.</a> Dev Cell. 3, 723-733 (2002).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).</li>
<li>Blaser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
</ol>

移植を対象とキメラを生成するために使用することができる容易さは、脊椎動物のモデルとしてゼブラフィッシュの列強の一つです。上記以外のこのプロトコルの変更は、接合体の開発において重要な役割を持つ遺伝子の母性遺伝子機能の解析が可能になります。これらの変異体の魚が大人になるまで生き残ることができないので、それは変異細胞の&quot;生殖クローン&quot;を作成し、そうでなければ、野生型宿主胚に変異生殖細胞を転送する必要があります。生殖細胞モザイクを生成すると、変異体ドナーからの野生型宿主胚に移植始原生殖細胞を含む。胚内の他のすべての細胞系譜とは異なり、生殖細胞系列は、母親の決定要因5,6の継承により、非常に開発の初期段階で指定されています。このように、生殖細胞モザイクを作るの最初のチャレンジは、ドナー胚の始原生殖細胞（始原生殖細胞）を識別している。中期胞胚段階で始原生殖細胞は、その系統標識ドナー胚の縁から50から100までのランダムな細胞を拾い、マージン7,8に沿って存在し、頻繁に始原生殖細胞の移動をもたらす。ラベルなしホストの胚の動物極に転送するときに、始原生殖細胞は、積極的に彼らは明確にそれらの...

試薬：これらの手順に使用される試薬の多くのレシピは、フルオンラインで利用可能であるゼブラフィッシュの本、に記載されています<a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> 。レシピは、魚の水の準備のためにそこに抗生物質、dechorionating、蛍光デキストランのためのプロナーゼ、およびメチルセルロースがある場合とない場合の胚の培地を用意されています。

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

複雑な発達過程を把握するために使用される最も強力なツールの一つは、キメラ胚の解析です。キメラは、複数の動物からの細胞を含む生物として定義され、モザイクには、複数の遺伝子型の細胞は通常、野生型と変異体、混合されているキメラの一種です。ゼブラフィッシュでは、キメラが容易に適切な初期段階での宿主胚にドナー胚からの細胞の移植によって作製することができる。標識されたドナーの細胞は、1細胞期胚に蛍光色素などの系列のマーカー、、の注入によって生成されます。標識されたドナー細胞は、ドナー胚から取り出され、化合物または解剖顕微鏡のどちらかに取り付けられたオイル制御のガラスピペットを使用して、ラベルなしホスト胚に導入されています。ドナー細胞は、いくつかのケースでは定評のある運命のマップに基づいて、ホスト胚の移植部位を選択することで、開発胞胚や原腸胚段階のホスト胚の特定の地域や組織をターゲットとすることができます。

胞胚や原腸胚の段階で移植の対象となるキメラゼブラフィッシュの胚を生成するためのステップバイステップのガイド。

複雑な発生プロセスの知見を得るために用いられる最も強力なツールのひとつが、キメラ胚の解析である。キメラとは、...

こんにちは。Cecilia Owens研究室のHillary Kempです。そして、私はCecilia Owensです。Hillaryと私は、シアトルにあるFred Hutchinson Cancer Research Centerの基礎科学部門に所属しています。本日は、遺伝的モザイクとも呼ばれる、キメラゼブラフィッシュ胚を作成する手法をご紹介します。この手順により、発生過程における遺伝子機能の細胞レベルでの基盤を評価することが可能になります。これにより、特定の遺伝子が、変異表現型を示す細胞内で機能しているか（細胞自律的機能）、あるいはそれらの細胞を取り巻く環境内で機能しているか（細胞非自律的機能）を検証することができます。これらのモザイク胚は、胚盤胞期または初期原腸陥入期の野生型胚と変異型胚の間で細胞を移植することで作製します。その後、ホスト環境におけるドナー由来細胞の表現型と遺伝子型を観察し、遺伝子機能を評価します。それでは始めましょう。プロトコルのこのセクションでは、移植後にドナー由来細胞の運命を追跡できるよう、ドナー胚にリネージ染料を注入します。この手法を用いて、あらゆる種類の核酸を注入することも可能ですが、胚を扱う前にDNAを注入する場合は、標識ステップを省略してください。ペトリ皿の最も広い部分にガラススライドを45度の角度で挿入し、注入用ディッシュを準備します。ディッシュの4分の3まで、1.2% aos 含有 pen strep 胚培液を満たしてください。アガロが固まった後、スライドを取り除いて面取りされた溝を作ります。溝にpen strep embryo mediumを充填します。次に、1細胞期の胚の酵素的処理に進みます。1細胞期の胚を、0.5 mg/mL Pronase溶液中で1〜5分間インキュベートします。脱殻の様子を注意深く観察してください。絨毛膜が目に見えて崩壊し始めたらすぐに、胚をシステムウォーターに浸します。これにより、すべての絨毛膜が流れ出し、胚はビーカーの底に留まります。胚が再び水面に触れないようにすることが非常に重要です。ほとんどの胚から絨毛膜が除去されていますが、一部は外側に漂っています。卵膜（コリオン）に包まれたままの個体がある場合、このようにピペッティングすることで、胚を水面に接触させることなく卵膜から脱出させ、放出することができます。コーティングされた胚を扱う際は、端を滑らかにするために火炎研磨したピペットを使用することが重要です。広口の火炎研磨ガラスピペットを用いて、壊れやすいDECコーティング胚をインジェクションディッシュの溝へ慎重に移します。次に、1つのファイルをこの溝にロードします。これで、精密に校正されたファイアポリッシュ済みガラス注入ピペットと圧力注入装置を用いて、胚にリネージマーカーを注入する準備が整いま

generating-chimeric-zebrafish-embryos-by-transplantation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ゼブラフィッシュ細胞移植は、組織特異的キメラを生成するために遺伝学と発生学の組み合わせを可能にします。このビデオでは、原腸胚の研究室では前脳の交連形成時のアストログリア集団と特定の指導の手がかりの役割を調査することを許可している細胞移植を段階を示しています。...

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

我々は、胚発生時のライブイメージング細胞挙動のためのキメラゼブラフィッシュの胚を生成するプロトコルを示しています。...

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

ハード絨毛膜とソフト胚による、メダカ胚の操作は、ゼブラフィッシュにおけるよりも複雑です。このビデオでは、キメラの生産のためのイメージングと細胞移植のためにアガロースに取付け、dechorionation含むメダカ胚を操作する方法のためのステップバイステップの手順を示しています。これらの手順は、脊椎動物のゲノム機能の遺伝的解剖のためにそれらの補完的な機能をフルに活用するために実験室でのメダカとゼブラフィッシュを使用するために不可欠です。...

キメラの生成のためのメダカ胚および細胞移植のDechorionation

このプロトコルは、異なる遺伝的背景を持つパラビオティックゼブラフィッシュの胚を生成する方法についての段階的な指導を提供します。ゼブラフィッシュ胚の比類のないイメージング能力と組み合わせることで、この方法は、目的の候補遺伝子の細胞自律機能と非細胞自律機能を調べるための独自の強力な手段を提供します。...

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

細胞の駆出や移植などの発生学的操作は、早期の発達を研究するための重要なツールです。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚でこれらの操作を行う簡単で効果的な移植装置を記述する。...

ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

学ぶゼブラフィッシュ胚の細胞移植によるキメラ作成法。ブラスチュラ期またはガストラ期に細胞を移植し、発生過程における遺伝子機能の細胞自律性と非自律性を評価する技術です。

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

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