移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

こんにちは、セシリア・オーウェンズ研究所のヒラリー・ケンプです。そして、私はセシリア・オーウェンズです。ヒラリーと私は、シアトルのフレッド・ハッチンソンがん研究センターの基礎科学部門に所属しています。

遺伝子モザイクとも呼ばれるキメラゼブラフィッシュの胚を作る技術をご紹介します。この手順により、発生中の遺伝子機能の細胞基盤を評価することができます。特定の遺伝子が、細胞自律機能として知られる突然変異表現型を持つ細胞内で機能するかどうか、または細胞非自律性として知られる細胞環境内で機能するかどうかを調べることができます。

これらのモザイクは、胞胚期または初期胃期のいずれかで野生型の変異胚の間に細胞を移植することによって作成されます。その後、ドナー由来細胞の表現型と遺伝子型を宿主環境で観察することにより、遺伝子機能を評価します。それでは始めましょう。

プロトコルのこの部分では、移植後にドナー由来細胞の運命を追跡できるように、系統色素がドナー胚に注入されます。この技術を使用して任意の種類の核酸を注入することもできますが、DNAを注入するときは装飾ステップを省略します 胚を扱う前に、ペトリ皿の最も広い部分にスライドガラスを45度の角度で挿入して注射皿を準備します。ペン連鎖球菌胚培地中の1.2%arosが4分の3で満たされています。

アグロがセットされた後、スライドを取り外して斜めのトラフを作ります。トラフをペン連鎖球菌胚培地で満たします。次に、1つの細胞期の胚の酵素的装飾を進めます。

1細胞期の胚を1ミリグラム/ミリリットルで1〜5分間インキュベートします。プロナーゼソリューション。装飾を注意深く監視してください。

コリオンが目に見えて崩壊し始めたらすぐに、胚をシステム水に浸します そして、これはすべてのコリウムを注ぎ出し、胚はくちばし曲線の底にとどまっています。そして、胚がもう一度水面にぶつからないように、そしてほとんどの胚がコリオンをオフにしていることが非常に重要です。外側には渦巻いていますが、そうでないものもあります。

コリオンにまだ何かが残っている場合、このようにピペッティングする行為により、それらを取り出し、胚を放出して、水面にぶつからないようにします。コーティングされた胚は、エッジを滑らかにするためにファイヤーポリッシュされたピペットで扱うことが重要です。壊れやすいdecでコーティングされた胚を、ワイドボアファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して、注入皿のトラフに優しく移します。

そして、このトラフに 1 つのファイルをロードします。これで、正確に校正された火、プルガラスインジェクションピペット、および圧力注入リグを使用して、系統マーカーで胚を注入する準備が整いました。胚培地がいっぱい入った皿で針を折ったり、油でいっぱいの皿を使って針を校正したりします。

これは、通常の標準的なラボグレードの鉱物油です。私たちは、シャープな時計職人の鉗子のペアを取り、その後、適切なサイズが何であるかを決定するためにアイピースを通して見ながら、我々は針の両側に鉗子を置き、その後、我々は慎重にチップをオフに壊す、私は実際に見ていないすることはできません染料やリボヌクレオチドの量を決定するために。始める前に。

鉱油の皿のボーラスサイズを測定します。マイクロインジェクターの1つまたは2つのパルスで1ナノリットルのボーラスが送達されるように、針を切断する必要があります。ボーラスの体積は、接眼レンズマイクロメーターで測定したその直径から計算できます。

蛍光デキストランの1〜3%溶液の1ナノリットルを、1〜4細胞段階の間の被覆胚の液体に直接注入します。私がやろうとしていることは、胚を針の真下に配置することです。針を卵黄の中央にそっと突き刺し、フットペダルを踏み込みます。

注入したら、 色素が細胞に輸送されるように、卵黄の流れに注入することが重要です。この注射は、数日間の発生を通じてキメラ胚の細胞を追跡するのに十分です。理想的には、細胞が4細胞段階に達する前にこれを行い、新鮮なペン連鎖球菌胚で満たされたコーティングされたペトリ皿で注入された胚を低密度で育てます。中程度。

注入された胚は、発生速度がわずかに遅くなる傾向があり、胚を摂氏25度、28度、31度の異なる温度でインキュベートして、発生をずらし、移植を実施できる時間枠を最大化することに注意してください。ゼブラフィッシュ胞胚の細胞移植に使用される装置は、3方向ストップコックによって鉱物油の貯蔵庫とマイクロピペットホルダーに取り付けられた駆動制御ハミルトン注射器で構成されています。システムからすべての気泡を排除します。気泡は、吸引力と圧力を制御する能力を台無しにします。

少なくともDX倍率の高品質の光学系を備えた実体顕微鏡を使用してください。マイクロピペットホルダーとニードルの位置を制御するために、NARAシゲ手動マイクロマニピュレーターをお勧めします。振動が移植に伝わるのを防ぐために、磁気ベースを使用してベンチに固定されていることを確認してください。

針移植針は、電極極性上の緩やかなテーパーに引き寄せられるガラスキャピラリーピペットから作られています。解剖顕微鏡でピペットを引っ張り、引っ張った針の先端を折る方法の詳細については、Miriam Goodmanの研究室のJoVEプロトコルを参照してください。胞胚期移植の場合、針の外径は約50〜60ミクロン、胃期移植の場合は30〜40ミクロンを測定する必要があります。

胃のステージトランスファーで浸透性を向上させるには、まずマイクロ飼料を使用して針の端に鋭いとげを引っ張り、針の先端をマイクロフォージのフィラメントに近づけて滑らかにする必要があります。次に、ベベルの前縁がフィラメントに接触できるように針を回します。針の前縁がフィラメントに接触したら、すばやく引き離してとげを作ります。

細胞の損傷を避けるために、とげはまっすぐで、針の先端が曲がらないようにする必要があります リグと移植針を準備したら、キメラ胚を作る準備が整います。胞胚移植は、詳細な運命マップ情報が必要ない場合に、胚間で細胞を移植するために使用されます。原始生殖細胞を除いて、ほとんどの細胞は一般的にこの段階では運命にコミットしていません。

胞胚の運命図は、外胚葉を引き起こす細胞と中胚葉を引き起こす細胞を区別できるようなものです。中胚葉と内胚葉は胞胚期の胚の縁近くにありますが、神経系と表皮を生じさせる真皮前駆細胞は、胚の縁からさらに離れた場所にあります。ですから、胞胚期の胚に細胞を移植すると、その細胞を推定中胚葉または推定外胚葉に標的にすることができます。

しかし、外胚葉や中胚葉の特定の領域に細胞を標的にすることはできません。胚の背側がある胞胚の段階で、胚培地に1.2%のアロスを溶かした半分を充填したペトリ皿に、くさび形の突起が一対になったプラスチック型を浮かべて、あらかじめ注入皿を準備します。アロスが固まったら、テンプレートを取り除き、それぞれが1つの胚を保持するのに十分な大きさの三角形のウェルの列を残します。

移植型に連鎖球菌ペン胚培地を充填し、火で磨いたガラスピペットで胞胚期の胚を個別に各ウェルにロードします。次に、胚を移植ウェルに移し、最初に胚を横向きにすることができます。ドナー胚が1つの列に配置され、宿主胚が隣接する列に配置されるように胚を配置します。

移植針が胚に入ると、針が胚をウェルの後壁に押し付けるように、ステージ上に皿を配置します。マイクロマニピュレーターを使用して、移植針をかなり急な角度で皿に下げます。理想的には、移植針は約45度の角度で胚に入る必要があります。

針の先端が胚培地の表面の下に来たら、ハミルトンシリンジを制御するマイクロメータドライブをひねって、少量の胚培地を針に引き込みます。最も正確な制御のためには、鉱油と胚培地との間の界面は、針の細い先細部分に留まり、端に近すぎないようにする必要があります。ドナー胚を針で穏やかに配置し、次に針を引き戻して胚の胞胚キャップを所望の位置で入れます。

素早いハードヒットは、胚を転がさずに貫通します。ドナー細胞をゆっくりと慎重に針に引き込み、細胞がせん断されないようにします。必要な数の細胞が取り込まれた後、卵黄を針に取り込むことは避けてください。

圧力を少し逆にして吸引を停止し、宿主の胚を所定の位置に戻すために針を取り外します。移植皿を動かすことで、卵黄に触れないように注意する限り、移植針を使って優しく回すことで宿主胚の位置を微調整することができます。ドナー細胞を宿主胚に排出するときは、単一のドナー胚からドナー細胞を損傷して殺すため、胚に液体を取り込むことは避けてください。

ドナーホストペアを24ウェルプレートのコーティングウェルに移し、開発を続けます。胞胚期の特定の運命にコミットされていない細胞のルールの唯一の例外は、原始生殖細胞です。原始生殖細胞は、発生の非常に早い段階で特定され、原始生殖細胞の状態の運命にコミットしています。

非常に早い段階から、原始生殖細胞は胞胚とガス期の胚の縁近くにあります。ですから、移植実験の目標が原始生殖細胞を移植することであるならば、細胞がドナー胚のどこから来るかは非常に重要であり、宿主胚のどこに行くかは重要ではありません。つまり、体細胞にとっては、宿主胚のどこに行かれる場所が運命を決定することが重要だというのがルールです。

原始生殖細胞の場合、その運命はすでに決まっているため、ドナー胚のどこから来るかが重要です。目標が原始生殖細胞を移植することである場合、これは、細胞はドナー胚の希望の縁から拾い上げられる必要があり、それらはこのシートで3つまたは4つの細胞のそれぞれの4つの小さなクラスターで胚の縁のすぐ近くに位置します、この槍の段階または発達の高い段階。そして、誤って卵黄を吸い上げ始めないように、それらを非常に生意気に拾う必要があります。

さて、それが私がそこでやったことであり、今、私は宿主胚に移行しています。これで、原始生殖細胞は、それらが属する胚の生殖器隆起領域に研ぎ澄まされます。したがって、これらの原始生殖細胞を自分でそこに到達させる縁に移植する必要はありません。

だから、私はただ移植して、古い場所に戻してポスト胚に戻しているだけです。生殖細胞移植の鍵は、他の種類の移植とは正反対ですが、ドナー細胞がどこから来るかが重要であるということです。細胞を胃期の宿主に移植すると、実験者は、胚のシールドが見えたときに現れるゼブラゼブラフィッシュの運命マップを利用することができます。

さまざまな組織タイプと推定中枢神経系内のドメインを区別することが可能になります。胃リスト段階で胚間で細胞を移植する場合、プロトコルにはいくつかのバリエーションがありますが、一般的な手順は、胚盤を使用して胃をマウントするのと似ています。まず、ガラス製の窪みスライドのくぼみにメチルセルロースの縦縞を塗り、次に、火で磨いたピペットトランスファーを使用して、大量のペン連鎖球菌胚培地を浸します。

1人のドナーと3人のシールドステージホストがうつ病スライドにホストされます。宿主よりわずかに若いドナー胚を選択します。胃の接着剤、2ポンドのテスト釣り糸の短い長さの端を毛細管の端に操作するには、新しいツールが必要です。

したがって、小さなループを作成します。ループを使用して、ドナーと宿主の胚をメチルセルロースストリップの上部に優しく転がし、固定されるまでメチルセルロースに詰めます。ターゲット領域が一番上になるように、それらを所定の位置にロールします。

移植中、針は接線方向に胚に入り、液体を損傷することなくドナー細胞を送達します。胃期移植は、固定期の複合顕微鏡で行うのが最適です。マイクロマニピュレーターのコントロールを使用して、移植針の先端に焦点を合わせます。

マイクロピペットホルダーと針をかなり浅い角度で配置して、スライドのくぼみの端が許す限り針が水平に近づくようにします。次にドナー胚を突き刺します。適切に取り付けられている場合、胚が古すぎて針が簡単に貫通できない場合を除き、移植針が入っても転がりません。

ylkを貫通しないように、針はEDLの焦点面よりわずかに深い焦点面で胚に入る必要があります。穿孔後、ドナーから多数の細胞を取り出し、最大3回の宿主細胞注入を行うことができます。細胞を描くときは、必要に応じて細胞が取り込まれるので、針を動かして卵黄を吸い上げないようにしてください。

追加の胚は、細胞を宿主に排出する前に同じ針を使用してより多くの細胞のために採取することができ、宿主胚への細胞放出中に、針が標的領域を通して引き出されている間に細胞を排出するのとは対照的に、細胞を単一の塊に沈着させるのとは対照的に。これにより、ドナー細胞が目的の組織に寄与する可能性が高まります。細胞移植が完了したら、スライド全体をペトリ皿に入れ、ペン連鎖球菌胚を慎重に浸します。中程度。

次の数時間で、メチルセルロースは溶解し、胚を放出します。転送される細胞の数は、実験の特定の目的によって異なります。1人のドナーからの細胞は、移植の翌朝に3つまたは4つの宿主に移植することができます。

宿主を調べて、ドナー細胞のターゲティングが成功したかどうかを判断できます。胞胚年齢からの原始生殖細胞の移植が成功すると、蛍光標識細胞が得られ、ylkとylk伸長部との間の接合部の近くに腹側に配置されます。そこで、原腸移植と胞胚期移植の方法を紹介しました。

この技術を行うときは、細胞で標的にしたい標的組織に適したタイプの移植方法を選択することが重要です。したがって、胞胚期移植は、細胞が皮膚に行くか外胚葉に行くかを決定するのに十分です。また、この手法を使用して、原始生殖細胞を標的

より細かいマッピングを行いたい場合は、背側がすでに決定されている胃年齢移植を使用することをお勧めします。したがって、この技術を使用すると、神経系のさまざまな部分、特に前脳、中脳、後脳、脊髄に細胞を標的にすることができます。というわけで、これだけです。

ご覧いただき、ありがとうございました。