ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精
2009年7月6日
これは、ゼブラフィッシュのためのハイスループット精子の凍結保存プロトコルです。精子は、このプロトコルを使用すると、その後の体外受精で25％の肥沃度の平均値を持ち、長年にわたって安定な凍結保存。
こんにちは、私はカリフォルニア大学デービス校分子細胞生物学部のブルース・ドレイパーと、シアトルのフレッド・ハッチンソンがん研究センターの基礎科学部のセシリア・モーンズです。今日、セシリアと私は、オリジナルのブライアン・ハーヴェイのプロトコルを修正したゼブラフィッシュの精子の鳴き声保存プロトコルを実演します。2人のチームで作業すると、100人の個々の男性の精子を2時間以内に凍結保存することが可能であることを示します。
解凍後の生殖能力には幅がありますが、平均して25%の生殖能力を受け取り、これは7年以上にわたって凍結保存された図書館からのものです。それでは始めましょう。この手順を実行する前に、まず、精子凍結液を作ります。
ギンズバーグフィッシュリンガー溶液は3日ごとに新鮮に作られ、凍結培地はメタノールの有無にかかわらず毎日新鮮に作られています。これらの溶液の組成は、このプロトコルに付属するオンライン補足情報に記載されています。この手順で使用される材料は、凍結と融解の速度に影響を与える可能性があり、それが凍結精子の生殖能力に影響を与える可能性があります。
このため、推奨される資料のリストも補足的なオンライン情報として提供されています。ドライアイスペレットではなく、細かく砕いたドライアイスで精子を凍結するのが最善です。ドライアイスを砕く簡単な方法の1つは、タオルで包み、ハンマーで粉砕することです。
より効率的な方法は、ツメなどのドライアイスグラインダーを使用し、RE2をモデル化してゼブラフィッシュの精子を凍結することです。最初に、3.33マイクロリットルまたは底から約16.7ミリメートルのレベルで実験ペンで10マイクロリットルの毛細管をマークし、男性を麻酔し、希釈されたトリカと魚の水を含むビーカーに2〜4人の男性を配置します。レシピはゼブラフィッシュの本にあります。
麻酔をかけたら、プラスチックのスプーンを使用して魚を麻酔薬から持ち上げ、ペーパータオルでそっと拭いて乾かします。腹側の描画には特に注意してください。水は精子を活性化するので、イカの周りを完全に乾かすことが重要です。
魚をスポンジホルダーの腹側を上にして置きます。骨盤ヒレの周りがまだ湿っている場合は、キムワイプでやさしく乾かします。マークされたキャピラリーチューブを、キャピラリーチューブに含まれているゴム製のマウスピペットアダプターに入れます。
アダプターは、一方の端にマウスピース、もう一方の端にキャピラリーホルダーを備えたゴムホースです。あるいは、キャピラリーチューブを50マイクロリットルのハミルトンシリンジに接続することもできます。適切な直径の短いタイゴンチューブを使用して、男性をスコープの下に置き、骨盤のひれを慎重に広げて泌尿生殖器の開口部を露出させます。
毛細管の端を使って、滑らかな鉗子で魚の側面を優しく撫でたり、人差し指と親指で魚の側面を優しく絞ったりして精子を搾り出し、優しく吸引して排出されるまま毛細管に精子を集めます。精子と一緒に排出される可能性のある糞便は避けてください。精子の目標量は3.3マイクロリットルです。
許容される精子の最小量は、精子の質によって異なります。良い精子は白くて不透明ですが、毛穴の精子は水っぽく見えます。一般に、精子の最小許容量は、1マイクロリットルの良好な精子または目標の3分の1、および2マイクロリットルの細孔精子または目標の3分の2である。
精子の量が目標量の3.3マイクロリットルに達しない場合は、メタノールを含まない凍結培地を使用してペンマークに量を正規化する必要があります。精子の量がすでに毛細管のペンマークに達しているか、それを超えている場合は、次のステップに進みます。次に、精子に凍結保護剤を追加します。
メタノール入りの凍結培地をオレンジマークまで吸い上げます。現在、総容量は約20マイクロリットルです。精子と凍結保護剤の混合物を、ピペッティングで約4回上下して穏やかに混合した時計のガラスのきれいな領域に排出し、気泡が入らないようにします。
10マイクロリットルの精子凍結保護溶液を各標識バイアルの底にピペットで移すことにより、精子を2つのクライオバイアルに分注します。素早く移動してバイアルをキャップし、各クライオバイアルを別々の15ミリリットルのファルコンチューブに落とします。室温で、ファルコンチューブにキャップをし、細かく粉末にしたドライアイスに挿入します。
チューブは、ファルコンチューブを追跡するためにキャップだけが見えるように、十分に深く挿入する必要があります。それらに番号を付け、各チューブがドライアイスに入る時間を記録します。精子をドライアイスで20分間凍結させます。
精子が凍結した後、2つのクライオバイアルを液体窒素含有ドーアーフラスコに移します。一時的な保管用。サンプルが熱くならないように、フリーザーボックスを液体窒素の浴に入れます。
長い金属製のトングを使用して、doerフラスコからバイアルを回収し、クライオグローブで取り扱います。あるいは、クライオバイアルをドライアイスから直接冷凍庫に移すこともできます。フリーザーボックスを発泡スチロール容器内の液体窒素に浸して長期保存する場合は、クライオバイアルを極低温液体窒素フリーザーに入れます。
精子の生存率を維持するためには、バイアルを液体窒素バイアルに浸して保存することが重要であり、気相で保存すると時間の経過とともに生存能力が失われる可能性があります。精子の生存率を維持するためには、速度も重要です。凍結保護剤を追加してから精子バイアルをドライアイスの上に置くまでの時間は、体外受精で30秒以内にする必要があります。
凍結保存された精子は、2人で最適に機能します。一人が女性から卵子を絞り、もう一人が精子を解凍します。ウォーターバスを摂氏33度に設定します。
液体窒素冷凍庫からクライオバイアルを取り出し、解凍の準備ができるまでDまたはフラスコを含む液体窒素に移します。麻酔をかけた女性からの卵を35ミリメートルのプラスチック製のペトリ皿に絞ります。これについては、JoVEのプロトコル「Making Gyno Geneticが初期の圧力でゼブラフィッシュを配備」と題し、ゼブラフィッシュについて詳細に説明されています。
体外受精では、良好なクラッチには、均一で黄色がかった150個以上の卵が含まれています。白い破片は劣化を示しています。可能であれば、卵を3つ手に入れて1つの皿にまとめてみてください。
最初のクラッチから1分以内に3つの良好なクラッチが得られない場合は、次の手順に進みます。精子が解凍されている間、皿を覆ったままにしてください。その間、液体窒素からバイアルを取り出し、キャップを取り外します。
バイアルを33度のウォーターバスに半分ほどすばやく8〜10秒間浸します。室温の70マイクロリットルを素早く加え、ハンクの緩衝塩溶液をバイアルに加え、ピペッティングで上下に混合し、すぐにペトリ皿の卵に加え、ピペットの先端で穏やかに混合します。次に、750マイクロリットルの魚水渦巻き水を加えて混合し、室温で5分間インキュベートすることにより、精子と卵子をすぐに活性化します。
5分後、皿に魚と水を入れ、摂氏28度でインキュベートします。2〜3時間後、生存可能な胚をカウントし、100ミリメートル皿に50個の胚を移植します。また、精子サンプルの受精能を決定できるように、受精卵を頼り
にしてください。精子受精能は、体外受精に使用された卵子の総数に対する生存可能な胚の比率です。卵子は、体外受精の2時間後から6時間後までいつでも選別できます。不妊卵子が生存可能な胚と簡単に区別できる場合、不妊卵子は透明で分裂していません。
実体顕微鏡でトランス照明で見ると、凍結保存された精子の平均受精能は大きく異なります。ただし、数年間安定している平均25%の生殖能力を得ることが可能であるべきです。このグラフは、2001年から2003年の間に凍結された精子の平均受精率を示しており、最近では2008年と考えられています。
私たちは、魚の精子をゼロにするための泣き声のハイスループット方法を実証したばかりです。このプロトコルを行う際には、推奨されるすべてのプラスチック製の摩耗品と機器を使用すること、およびドライアイスペレットではなく粉砕された砕いたドライアイスを使用することが重要です。それは本当に高品質の精子と卵子を使用することが重要であり、体外受精を行うときの卵子の場合、精子を喘ぐときに、それはあなたが他の端で得る受精可能な胚の数を改善するために卵子のできるだけ多くを使用することが重要であり、それは3〜4人の女性を取ることができます、 右。
このプロトコルのもう一つの重要な要素は、速度です。オスからの精子を搾り出すからドライアイスに入れるまでに約1分以上かかることはありません。まあ、それだけだと思います。
あなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、ゼブラフィッシュの精子凍結保存プロトコルを提示しており、その後の体外受精で平均25%の受精率を達成しています。このプロトコルは長年にわたり安定しており、ゼブラフィッシュの精子の効果的な長期保存を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生殖生物学
- 凍結保存技術
背景
- ゼブラフィッシュは生物学研究におけるモデル生物です。
- 凍結保存は遺伝物質の長期保存に不可欠です。
- 精子の生存率を維持することは受精の成功に重要です。
- 精子凍結保存のプロトコルは効果にばらつきがあります。
研究目的
- ゼブラフィッシュの精子凍結保存の高スループット方法を開発すること。
- 凍結保存された精子の時間の経過による受精能を評価すること。
- 研究分野の研究者に信頼性の高いプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 精子凍結溶液と凍結保護剤の調製。
- 麻酔をかけたオスのゼブラフィッシュから精子の収集。
- ドライアイスと液体窒素を用いた精子の凍結。
- 体外受精のための精子の解凍。
主な結果
- 凍結保存された精子からの平均受精率は25%。
- プロトコルにより、2時間未満で100匹のオスからの精子の凍結保存が可能です。
- 7年以上の期間にわたって精子の生存率が維持されます。
- 特定の技術によって凍結保存の成功率が向上します。
結論
- 開発されたプロトコルはゼブラフィッシュの精子凍結保存に効率的かつ効果的です。
- 適切な技術により高い受精率を達成できます。
- この方法はゼブラフィッシュの長期的な遺伝学的研究をサポートできます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Zebrafish sperm cryopreservation enables long-term genetic resource management in preclinical discovery, supporting consistent model availability for target validation and phenotypic screening. The high-throughput protocol allows cryopreservation of 100 male samples in under two hours, improving operational efficiency in large-scale genetic repositories. Stable 25% fertility rates over multiple years provide predictable outcomes for downstream in vitro fertilization assays, reducing variability in genetic cross experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic hypotheses by preserving sperm lines for future crosses to validate gene function in disease-relevant systems.
- Operational Value: Standardized sperm collection and freezing procedures reduce technical variability, supporting reproducible target de-risking across laboratories.
- Predictive Value: Long-term storage capability allows retrospective testing of genetic models as new targets emerge, improving confidence in translational continuity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Cryopreserved sperm provides a uniform biological input for in vitro fertilization assays, enabling consistent egg-to-embryo conversion metrics for compound screening.
- Operational Value: Use of cryovials instead of capillary tubes improves sample handling and storage scalability in high-throughput workflows.
- Assay Readiness: Normalized sperm volumes using methanol-free freezing medium increase procedural uniformity, supporting reliable quantitative outputs in fertilization assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Stable fertility rates over seven years support multi-year preclinical studies requiring consistent genetic backgrounds for mechanism of action and safety profiling.
- Predictive De-risking: Reliable sperm viability reduces attrition in genetic model generation, improving success rates in phenotype-driven target validation pipelines.
- Disease-Relevant System: Zebrafish embryos derived from cryopreserved sperm enable rapid phenotypic assessment in vertebrate models aligned with human disease pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable upstream process for generating zebrafish embryos used in target validation, assay development, and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling on-demand generation of genetically defined embryos from archived sperm lines.
- Screening: Cryopreserved sperm improves assay reproducibility and throughput in in vitro fertilization-based compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Fertility rate measurements (viable embryos per total eggs) provide a quantitative endpoint for assessing sperm quality and genetic cross efficiency.
- Translational Research: Long-term sperm storage supports continuity from gene discovery through preclinical validation using consistent genetic backgrounds.
- Enterprise Reuse: Protocol establishes a reusable genetic resource management capability for large-scale zebrafish facilities supporting multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genetic model availability, reduction of mechanistic ambiguity in cross-generational studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sperm processing enable high-throughput biobanking.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on genetic model investment, capital efficiency in maintaining live colonies, reduced biological risk in longitudinal studies.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of genetic lines based on cryopreservation success rates and long-term fertility stability.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish handling, sperm extraction, and cryopreservation techniques.
- Instrumentation needs include dry ice grinder, liquid nitrogen storage, capillary tubes, cryovials, and temperature-controlled water baths for thawing.
- Cross-team standardization requires adherence to specified materials (e.g., finely crushed dry ice, recommended tubes) to control freezing/thawing rates affecting fertility.
- Adaptation considerations include sperm volume normalization using methanol-free freezing medium to ensure uniform sample preparation across variable male outputs.
- Practical limitations: Fertility varies per sample; protocol success depends on sperm and egg quality, with minimum acceptable sperm volume thresholds defined.
