Name: 初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶ初期圧力法によるゼブラフィッシュの雌性発生二倍体作成法。UV照射精子を用いた受精後、適切なタイミングで静水圧を加えて微小管を脱重合させ、第2極体の排出を阻止することで、全遺伝子座で相同染色体を持つ二倍体胚を作製する技術です。

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体外受精と雌性発生二倍体のための方法は1970年代と1980年代にオレゴン大学のジョージStreisingerの研究室でシャーリーンウォーカーによるゼブラフィッシュのために開発されました。方法は、ここで説明ゼブラブック3で完全に利用可能であるシャーリーンのプロトコルから変更されていません。 体外受精と雌性発生二倍体のための方法は1970年代と1980年代にオレゴン大学のジョージStreisingerの研究室でシャーリーンウォーカーによるゼブラフィッシュのために開発されました。方法は、ここで説明ゼブラブック3で完全に利用可能であるシャーリーンのプロトコルから変更されていません。

初期の圧力の概要注：このようなtricaine、魚の水とハンクス生理食塩水、このプロトコルで使用される試薬の多くのためのレシピは、ゼブラフィッシュブック3（第10章をオンラインで利用することができます<a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> ） <ol><li> UV不活化精子を用いた体外受精で胚を作り出​​す。 </li><li>すぐに卵を水でいっぱいに充填されたガラスバイアル（プラスチック製のスナップキャップ付き）に受精卵を転送する。ラテックスゴムの薄いシートでバイアルの開口端部を覆い、ゴム製オーバーバイアルにトップを（穴が切断されているに）スナップ。 </li><li>油圧プレスでバイアルを置き、1.4分で受精した後、8000 psiの（多くのプレス機を2インチ径のピストンにかかる圧力を読み取るために較正されている、との読みがPSIに変換する必要があることに注意）に圧力を上げる</li><li>受精後6分で始まる、徐々に1分間の期間にわたって圧力を解放。 </li></ol>詳細な初期圧力の手順<ol><li> 実験の前日 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>午後遅くに、別々の男性と女性が圧迫される。彼は遺伝物質を寄与されることはありませんので、どんな歳の男性を使用することができます。雌は腹に大きなや脂肪になるはずです。男性は黄色と元気なはずです。 </li><li>それらは容易に午前中にアクセスすることができるタンクを保持するには別に一晩女性と男性を保持する。 </li></ol></li><li> 実験の朝 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>ハンクス溶液を調製、炭酸水素ナトリウムを加える。 </li><li>魚の施設へ移動：アイスバケット、ハンクス、Tricaine、タイマー、精子を収集するためのチューブ。 </li><li>魚の水にTricaineを薄める</li></ol></li><li> 精子を集める <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>氷上ハンクス液の明確なバイアルを準備。測定〜男性当り50μlを圧迫する。 </li><li> tricaineに浸漬して、一度に3または4人の男性を麻酔。これらは、プラスチックスプーンで麻酔から持ち上げることができます。 </li><li>魚の水ですすぎ、ペーパータオル（非常に重要：水を活性化精子）に&quot;湿気、乾燥を&quot;汚点。 </li><li>落射照明と低倍率での実体顕微鏡下で泡のホルダーで魚をマウントします。鉗子と骨盤フィンを分離し、排出腔の開口部にマイクロキャピラリーを置きます。 </li><li>スムース（ミリポア）ピンセットで慎重に、しっかりと魚のストローク側面。 </li><li>乳白色の精子が生殖孔から出てくるように、穏やかな吸引を用いてマイクロキャピラリーでそれを収集する。 </li><li>氷冷ハンクス生理食塩水でいくつかの男性からのプールが精子。 50から10人の男性から精子の数百の卵の受精に適しています。寒いハンクスので精子は数時間あるいは数日のために効率的に卵を受精していきます。 &quot;眼球&quot;精子の濃度、濁った懸濁液を作るのに十分な収集。 </li></ol></li><li> UV不活性化精子 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>氷とガラスペトリ皿の底を埋める。 </li><li>皿に氷の上にwatchglassを置く。 </li><li>パスツールピペットを使用して、watchglassに試験管から精子を転送する。それと空気の気泡を取ることなく、できるだけピペットに精子をできるだけ多く使うようにしてください。あなたがピペットからそれらを追放しているとしても、watchglassでバブル精子をしないでください。時計皿上に薄くで精子を排出する。このピペットを捨てます。 </li><li> UVクロスリンカーにペトリ皿を置き、 </li><li> 2分間架橋剤をオンにする</li><li>清浄なピペットを使用して、watchglassから精子を取り出して、氷上でUV精子と場所マークのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 </li></ol></li><li> 採卵と体外受精 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> tricaineで一度に3つまたは​​4つの女性を麻酔。 </li><li>魚の水ですすぎ、ペーパータオル上で&quot;生乾きにしたの&quot;汚点。余分な水は卵を膨張し、受精を防ぐことができます。 </li><li> 35mmプラスチックシャーレに湿った（ウェットではない）指で女性を置き、腹に慎重にしっかりと押してください。彼女が産卵のために用意されている場合、彼らは非常に簡単に出てくるでしょう。 </li><li>へらで卵を収集し、水にメスを返します。 （下記参照）女性に残っている卵は長すぎる白と水っぽくなるのに対し、良い卵は、黄色がかった、透明感のある色です。良い卵を得る保証するために、魚の施設内に来てライトの後の最初の2時間の間にそれらを収集する。乾燥アウトを防ぐために覆われて卵を保管してください。 </li><li>卵にUV精子懸濁液の30〜50μl加えて、ピペットの先端で軽くかき混ぜる。 </li><li>即時LYは、魚の水の約1 mlを追加し、タイマーを起動します 。この時点で開発するために左の卵は半数体となります。 </li></ol></li><li> 初期の圧力注：。AGは、受精後90秒以内に達成しなければならないステップ！ <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>卵は水の添加によって活性化された時点でタイマーを起動します。 </li><li>しばらく待ってから、皿の中央に、より多くの水、スワール卵を追加。 </li><li>カットオフと洗練されたパスツールピペットを用いて、圧力のバイアルに受精卵を転送する。 </li><li>必要に応じて彼らはほとんどバイアルのリップで水のビーズを残して、あふれているように、バイアルに多くの卵の水を加える。 </li><li>水のビーズ上のゴムの上に置き、ゴム上のプラスチック製の蓋を固定します。 </li><li>補充シリンダーをするより多くの卵の水を加え、加圧シリンダーで上下逆さまにバイアル（s）を置きます。しっかりとシリンダーの上部を置く。 </li><li>プランジ​​ャーとプレスで円筒を置き、8000ポンド/平方を適用します。インチ</li><li>活性化の時間後の6分間（圧力の4.5分の合計時間）まで、プレスで円筒にしておきます。 </li><li>活性化後6分で、記者からシリンダーを削除し、シリンダーからバイアルを取り外してください。慎重に胚の冷却を防ぐためにバイアルを乾燥させる。 </li><li>シリンダーと補充卵を水でリセット。 </li><li>必要に応じて部分的に卵を水で埋めることによって、次のバイアルを準備。 </li><li>卵のすべてのバッチについて繰り返します。 </li></ol></li></ol>注：シリンダが一度に3バイアルまで保持されるので、すでにtricaineで他の雌は卵を与えるかどうかを確認するために数分を卵の受精を遅らせることをお勧めします。これは、一度に複数のバッチを処理することにより、最高速度のものを助ける。プレスが使用されている回も、治療が完了するまでtricaine内の任意のより多くの魚を入れていない覚えている。魚が長すぎる麻酔に滞在できるようにすることは、それらを殺すことができる。第二に、あなたがプレスが使用されている間に魚を絞る、と卵を得れば、彼らはマスコミを再び使用することができる時間で実行可能なように乾燥しすぎかもしれません。

<ol><li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+analyses+and+gene-centromere+distances+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish.</a> Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).</li>
<li>Streisinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half-tetrad+analysis+in+zebrafish%3A+mapping+the+ros+mutation+and+the+centromere+of+linkage+group+I%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I.</a> Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).</li>
<li>Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pressure+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Early pressure screens.</a> Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).</li>
<li>Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-linkage+analysis+and+consolidation+of+the+zebrafish+genetic+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map.</a> Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).</li>
<li>Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+with+disrupted+early+T-cell+and+thymus+development+identified+in+early+pressure+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen.</a> Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).</li>
</ol>

この方法により製造された胚は、真の雌性発生二倍体であることを確認することが重要です。コントロールとして、通常の二倍体の卵（UV不活化せずに精子のいくつかを取っておくことにより）と一倍体の胚（EPの手順を経由せずにUV精子で受精卵のクラッチを脇に保つことによって）のクラッチのクラッチを生成する。 1日の後の受精の一倍体胚ではショートボディの軸、不規則な脳と体節の形態を持っている。半数は2〜3日後に実行可能ではありません。いくつかの不規則な&quot;EPのモンスターが&quot;発生する可能性があるものの、EPの二倍体は、通常の二倍体のようになります。 EPの二倍体のクラッチは、（70〜90％）、主に実行可能でなければなりません。 EPの二倍体のクラッチの半数体の存在は、EPのプロセス（例えば、圧力を保持するために失敗を押して）で障害が発生したことを示唆している。半数体クラッチの二倍体の存在は、不完全な精子の不活性化を（例えば架橋剤の失敗）を示唆している。 EPの二倍体が前方に遺伝画面4,6で識別されるマップの突然変異体に遺伝子セントロメア距離1を<...

<table><tbody><tr><td>トリカイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>時計皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フレンチプレス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>圧力シリンダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インスタントオーシャン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パステールピペット</td><td></td><td></td><td>細い端を切り落とし、火炎磨きを行う</td></tr><tr><td>UVクロスリンカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

二倍体真核生物におけるヘテロ接合性は、しばしば遺伝学的研究が面倒になります。ヘテロ接合の雌から直接実行可能なホモ接合二倍体の子孫を生成するメソッドは、F1変異女性が加速フォワード遺伝学的スクリーニングに有害な突然変異を直接スクリーニングすることができます。 Streisingerら。<sup&gt; 1,2</sup&gt;は、紫外線不活化精子とゼブラフィッシュ卵を活性化し、物理的処理（熱または圧力）そのdeploymerize微小管を使用して第二減数または最初の接合子の細胞分裂のどちらかを防ぐことによって、雌性発生（ホモ接合）二倍体のゼブラフィッシュを作製するための方法を説明した。 &quot;初期の圧力&quot;（EP）メソッドは、受精直後に起こる減数分裂IIを、ブロックします。 EP法は、いずれの性の肥沃な大人に開発することができます実行可能な胚の割合が高い生成します。方法は、減数分裂I.ホモ接合体の変異がセントロメア遺伝子座は50％とテロメア遺伝子座のための1％未満の間でEPのクラッチで検出された際に再結合することにより、動原体から分離されたものを除き、すべての遺伝子座でホモ接合である胚を生成します。このメソッドは、ゼブラフィッシュ帳からそのまま再現されている<sup&gt; 3</sup&gt;。

これは、すぐに紫外線で不活化精子と受精した後、第二減数分裂をブロックすることにより、雌性発生二倍体のゼブラフィッシュの胚（遺伝のみ寄与母親由来胚）を生成するための方法です。 EPの胚は、最初の減数分裂時の組換えが原因で完全にホモ接合体ではない、しかし、彼らは再結合することにより、動原体から分離されていないすべての遺伝子座でホモ接合である。

二倍体真核生物におけるヘテロ接合性は、遺伝学的研究を困難にすることが多い。～から生存可能なホモ接合二倍体の子孫を直接的に産出させる手法は……

こんにちは。オレゴン大学神経科学研究所のCharles Kimmel研究室のCharlene Walkerです。そして、私はGregory Walshです。フレッド・ハッチンソンがん研究センター基礎科学部門のCecilia Moens研究室で研究しています。本日は、早期加圧法を用いて三倍体ゼブラフィッシュを作製する手順をご紹介します。この手法では、UV照射精子で受精させた卵に静水圧をかけることで、適切なタイミングで微小管を脱重合させます。これにより、第2極体の放出が妨げられ、相同染色体が減数分裂Iの2つの産物である二倍体胚が形成されます。この手法は、私がオレゴン大学のGeorge Reisingerの研究室にいた1970年代初頭に開発されました。当研究室では、この手順を2世代にわたる4つの遺伝学的スクリーニングに使用しています。F1変異誘発魚の配偶子を直接スクリーニングすることで、ホモ接合型の雌性二倍体（gyno）の子魚において発生表現型を引き起こす劣性変異を同定できます。ゼブラフィッシュは高い遺伝的干渉を示すため、この手法を用いて変異の染色体上のマッピングを行い、これらの変異が中心体からどの程度の距離にあるかを推定します。それでは、手順を開始しましょう。実験の前日の午後遅くに、精子採取の準備として、ストリッピングを行う雄と雌を分離します。遺伝的な寄与はないため、高齢の雄を使用しても問題ありません。雌は腹部が大きくふっくらとしており、雄は黄色く活発である必要があります。翌朝に容易に取り出せるよう、雄と雌を別々の保持タンクに一晩入れておきます。実験当日の朝に、Hank液を調製し、重曹（炭酸水素ナトリウム）を添加します。氷を入れたバケットに入れて魚類飼育施設に運びます。Hank's溶液、trica、タイマー、および精子採取用のチューブを用意します。最後に、魚類飼育施設に到着後、tricaを飼育水で希釈します。これは次のステップで魚を麻酔させるために使用します。精子の採取を開始するために、氷上のハンクス溶液が入った透明なバイアルを用意します。雄1匹あたり約50 µLの溶液を絞り出せる十分な量の冷やしたハンクス溶液を用意し、一度に1匹または2匹の雄を麻酔させます。浸漬およびトリカ（trica）を用いて、プラスチックスプーンで麻酔液から取り出します。雄魚を魚用水で洗浄し、ペーパータオルで水分を吸い取ります。水は精子を活性化させるため、この操作は非常に重要です。乾燥後、落射照明を備えた低倍率の実体顕微鏡下で、魚をフォームホルダーに固定します。ピンセットで腹鰭を広げ、精子を採取し始めるために、総排泄腔の開口部にマイクロキャピラリーを配置します。乳白色の精子が生殖孔から出たら、滑らかなミルポールピンセットで魚の側面を優しく、かつしっかりと撫でます。緩やかな吸引を用いてマイクロキャピラリーに精子を回収し、数匹の雄から採取した精子を氷上でまとめて保持します。5〜10匹の雄から採取した冷やしたハンクス平衡塩溶液中の精子は、20〜30匹の雌の卵を受精させるのに十分な量です。冷やしたハンクス溶液中で保存された精子は、数時間にわたって効率的に卵を受精させることができます。精子をUV不活化させるため、白濁した懸濁液を作製するのに十分な量の精子を回収します。まず、ガラス製のペトリ皿の底に氷を敷き詰めます。皿の中の氷の上に時計皿を置きます。次に、ピペットを使用して、試験管から時計皿に精子を移します。気泡を巻き込まないように、できるだけ多くの精子をピペットで採取してください。精子に気泡が入らないようにすることが極めて重要です。精子を時計皿上に薄く均一な層になるように排出し、ピペットを廃棄します。精子の移送後、ペトリ皿をUVクロスリンカーに入れます。クロスリンカーの電源を入れ、エネルギー量を900 JUULsに設定して照射します。クロスリンク後、清潔なピペットを用いて、時計皿から精子を回収し、「UV sperm」と記入したファルコンチューブに移して氷上に置きます。卵の採取を開始するために、まず雌の魚を2匹ずつ麻酔します。Tricaを使用する場合、長時間の麻酔は魚を死に至らしめる可能性があるため、Tricaに浸しすぎないことが極めて重要です。次に、魚を飼育水で洗浄し、ペーパータオルで水気を拭き取ります。水分が多すぎると卵が膨潤し、受精が妨げられるため、ここは極めて重要な手順です。湿らせた（ただし濡らしすぎない）指で、雌を35 mmのプラスチック製ペトリ皿に移します。腹部を優しく、かつしっかりと押さえてください。雌魚が産卵可能な状態であれば、卵は容易に排出されます。スパチュラで卵を回収し、雌魚を水に戻してください。健全な卵は黄色の半透明色をしていますが、雌魚の体内に長く留まっていた卵は白く水っぽくなります。良質な卵を確実に回収するためには、魚類飼育施設の点灯後2時間以内に採取し、卵が乾燥しないようカバーをかけて保管してください。卵を回収した後、UV精子懸濁液を30～50 µL加え、ピペットチップで穏やかに攪拌します。直ちに魚用水を約1 mL加え、タイマーを開始します。この時点で発生させた卵はハプロイド（単倍体）となります。以下の手順は、受精から90秒以内に完了させる必要があります。タイマーを開始してください。水を追加し、卵が活性化した瞬間に開始します。減数分裂第一分裂中期に至る正確なタイミングは、温度に依存します。加圧および除圧のタイミングは、28.5 °Cで最適化されています。タイマーを開始した後、しばらく待機し、水をさらに加えて卵をディッシュの中央に泳がせます。先端を切断し研磨したパスチャーピペットを使用します。必要に応じて受精卵をプレッシャーバイアルに移し、バイアルのループ部分に水滴が残る程度まで、卵用水をほぼ溢れる直前まで加えます。次に、水滴の上にラバーキャップを被せ、その上からプラスチック製のリッドで固定します。バイアルを圧力シリンダーの中に逆さまに配置し、卵水を追加します。シリンダーを充填するため、上部カバーをシリンダーにしっかりと固定します。閉じた後、プランジャーを上げた状態でシリンダーをプレス機に設置し、8,000 pounds per square inchの圧力を加えます。活性化から6分後までシリンダーをプレスに保持し、計4.5分間の加圧を行います。活性化から6分後、シリンダーをプレスから取り出します。シリンダーからバイアルを取り出し、胚が冷却されないよう注意しながら乾燥させます。シリンダーをリセットし、卵水で満たします。必要に応じて、次のバイアルに卵水を部分的に満たして準備します。これらの手順をすべての卵のバッチに対して繰り返します。シリンダーには一度に最大2本のバイアルを入れることができるため、トリカ内の他の雌が卵を産卵するかどうかを確認するために、卵の受精を1〜2分遅らせるのがよいでしょう。これにより、より多くのバッチを一度に処理でき、効率を上げることができます。また、プレス使用中に魚を絞ると、プレスを再び使用できるまで（受精から24時間後）に卵が乾燥しすぎ、生存できなくなる可能性があります。半数体ゼブラフィッシュ胚は、短くがっしりした体、短い尾、そして形成不全の脳を持つのが特徴です。それでも、それらはすべて、体節、脊索、目、耳などの同じ身体部位を持っています。二倍体、半数体、二倍体はすべて、約24時間後に抑制のない屈曲運動を示します。受精後、EP二倍体の兄弟個体は長い尾と適切に形成された脳を持ち、生存率は約60〜70%になるはずです。これらは、未処理の展開コントロールと非常によく似ています。通常、ハプロ胚のバッチには、外見が良好な胚、死滅した胚、およびその中間の状態の胚が混在しています。外見が良好な胚と欠損のある胚の比率は、雌のゲノムに含まれる有害遺伝子の影響を反映しています。このような背景があっても、同じ特徴的な表現型を持つ個体が最大50%まで現れるため、変異の特定は比較的容易です。この方法で作製された胚が真のOIDsであることを確認することが重要です。コントロールとして、UV不活化していない精子の一部を取り分けておき、通常の二倍体卵の一群を作製させます。また、EP処置を行わずにUV処理した精子で受精させた卵の一部を取り分けておき、半数体胚の一群を作製させます。半数体は2～3日後に生存できなくなります。EP処理された胚は、通常の二倍体と同様の外見であるはずです。一部の不規則なEPモンスターが出現することもありますが、EP二倍体のクラッチは概ね70〜90%の生存率を示すはずです。EP処理を施したクラッチに単倍体が存在することは、EPプロセスの失敗（例えば、プレス機の加圧保持の失敗など）を示唆しています。一方、単倍体クラッチに二倍体が存在することは、精子の不活性化が不十分であったこと（例えば、架橋剤の不具合など）を示唆しています。ゼブラフィッシュを用いた体外受精の方法と、第二次有糸分裂を抑制することで雌性遺伝的二倍体ゼブラフィッシュ胚を作製する方法について説明しました。この手順を行う際は、初期圧力をかけるタイミングが極めて正確であること、および処理期間を通じてプレス機が8,000 pounds per square inchの圧力を維持することが重要です。必ずプレス機の校正を確認してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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Biology

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