初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成

こんにちは。オレゴン大学神経科学研究所のCharles Kimmel研究室のCharlene Walkerです。そして、私はGregory Walshです。フレッド・ハッチンソンがん研究センター基礎科学部門のCecilia Moens研究室で研究しています。

本日は、早期加圧法を用いて三倍体ゼブラフィッシュを作製する手順をご紹介します。この手法では、UV照射精子で受精させた卵に静水圧をかけることで、適切なタイミングで微小管を脱重合させます。

これにより、第2極体の放出が妨げられ、相同染色体が減数分裂Iの2つの産物である二倍体胚が形成されます。この手法は、私がオレゴン大学のGeorge Reisingerの研究室にいた1970年代初頭に開発されました。当研究室では、この手順を2世代にわたる4つの遺伝学的スクリーニングに使用しています。

F1変異誘発魚の配偶子を直接スクリーニングすることで、ホモ接合型の雌性二倍体（gyno）の子魚において発生表現型を引き起こす劣性変異を同定できます。ゼブラフィッシュは高い遺伝的干渉を示すため、この手法を用いて変異の染色体上のマッピングを行い、これらの変異が中心体からどの程度の距離にあるかを推定します。それでは、手順を開始しましょう。実験の前日の午後遅くに、精子採取の準備として、ストリッピングを行う雄と雌を分離します。遺伝的な寄与はないため、高齢の雄を使用しても問題ありません。

雌は腹部が大きくふっくらとしており、雄は黄色く活発である必要があります。翌朝に容易に取り出せるよう、雄と雌を別々の保持タンクに一晩入れておきます。実験当日の朝に、Hank液を調製し、重曹（炭酸水素ナトリウム）を添加します。

氷を入れたバケットに入れて魚類飼育施設に運びます。Hank's溶液、trica、タイマー、および精子採取用のチューブを用意します。最後に、魚類飼育施設に到着後、tricaを飼育水で希釈します。

これは次のステップで魚を麻酔させるために使用します。精子の採取を開始するために、氷上のハンクス溶液が入った透明なバイアルを用意します。雄1匹あたり約50 µLの溶液を絞り出せる十分な量の冷やしたハンクス溶液を用意し、一度に1匹または2匹の雄を麻酔させます。

浸漬およびトリカ（trica）を用いて、プラスチックスプーンで麻酔液から取り出します。雄魚を魚用水で洗浄し、ペーパータオルで水分を吸い取ります。水は精子を活性化させるため、この操作は非常に重要です。

乾燥後、落射照明を備えた低倍率の実体顕微鏡下で、魚をフォームホルダーに固定します。ピンセットで腹鰭を広げ、精子を採取し始めるために、総排泄腔の開口部にマイクロキャピラリーを配置します。乳白色の精子が生殖孔から出たら、滑らかなミルポールピンセットで魚の側面を優しく、かつしっかりと撫でます。緩やかな吸引を用いてマイクロキャピラリーに精子を回収し、数匹の雄から採取した精子を氷上でまとめて保持します。

5〜10匹の雄から採取した冷やしたハンクス平衡塩溶液中の精子は、20〜30匹の雌の卵を受精させるのに十分な量です。冷やしたハンクス溶液中で保存された精子は、数時間にわたって効率的に卵を受精させることができます。

精子をUV不活化させるため、白濁した懸濁液を作製するのに十分な量の精子を回収します。まず、ガラス製のペトリ皿の底に氷を敷き詰めます。皿の中の氷の上に時計皿を置きます。

次に、ピペットを使用して、試験管から時計皿に精子を移します。気泡を巻き込まないように、できるだけ多くの精子をピペットで採取してください。精子に気泡が入らないようにすることが極めて重要です。精子を時計皿上に薄く均一な層になるように排出し、ピペットを廃棄します。

精子の移送後、ペトリ皿をUVクロスリンカーに入れます。クロスリンカーの電源を入れ、エネルギー量を900 JUULsに設定して照射します。クロスリンク後、清潔なピペットを用いて、時計皿から精子を回収し、「UV sperm」と記入したファルコンチューブに移して氷上に置きます。

卵の採取を開始するために、まず雌の魚を2匹ずつ麻酔します。Tricaを使用する場合、長時間の麻酔は魚を死に至らしめる可能性があるため、Tricaに浸しすぎないことが極めて重要です。次に、魚を飼育水で洗浄し、ペーパータオルで水気を拭き取ります。

水分が多すぎると卵が膨潤し、受精が妨げられるため、ここは極めて重要な手順です。湿らせた（ただし濡らしすぎない）指で、雌を35 mmのプラスチック製ペトリ皿に移します。腹部を優しく、かつしっかりと押さえてください。

雌魚が産卵可能な状態であれば、卵は容易に排出されます。スパチュラで卵を回収し、雌魚を水に戻してください。健全な卵は黄色の半透明色をしていますが、雌魚の体内に長く留まっていた卵は白く水っぽくなります。良質な卵を確実に回収するためには、魚類飼育施設の点灯後2時間以内に採取し、卵が乾燥しないようカバーをかけて保管してください。

卵を回収した後、UV精子懸濁液を30～50 µL加え、ピペットチップで穏やかに攪拌します。直ちに魚用水を約1 mL加え、タイマーを開始します。この時点で発生させた卵はハプロイド（単倍体）となります。

以下の手順は、受精から90秒以内に完了させる必要があります。タイマーを開始してください。水を追加し、卵が活性化した瞬間に開始します。

減数分裂第一分裂中期に至る正確なタイミングは、温度に依存します。加圧および除圧のタイミングは、28.5 °Cで最適化されています。タイマーを開始した後、しばらく待機し、水をさらに加えて卵をディッシュの中央に泳がせます。

先端を切断し研磨したパスチャーピペットを使用します。必要に応じて受精卵をプレッシャーバイアルに移し、バイアルのループ部分に水滴が残る程度まで、卵用水をほぼ溢れる直前まで加えます。次に、水滴の上にラバーキャップを被せ、その上からプラスチック製のリッドで固定します。

バイアルを圧力シリンダーの中に逆さまに配置し、卵水を追加します。シリンダーを充填するため、上部カバーをシリンダーにしっかりと固定します。閉じた後、プランジャーを上げた状態でシリンダーをプレス機に設置し、8,000 pounds per square inchの圧力を加えます。

活性化から6分後までシリンダーをプレスに保持し、計4.5分間の加圧を行います。活性化から6分後、シリンダーをプレスから取り出します。シリンダーからバイアルを取り出し、胚が冷却されないよう注意しながら乾燥させます。

シリンダーをリセットし、卵水で満たします。必要に応じて、次のバイアルに卵水を部分的に満たして準備します。これらの手順をすべての卵のバッチに対して繰り返します。

シリンダーには一度に最大2本のバイアルを入れることができるため、トリカ内の他の雌が卵を産卵するかどうかを確認するために、卵の受精を1〜2分遅らせるのがよいでしょう。これにより、より多くのバッチを一度に処理でき、効率を上げることができます。また、プレス使用中に魚を絞ると、プレスを再び使用できるまで（受精から24時間後）に卵が乾燥しすぎ、生存できなくなる可能性があります。半数体ゼブラフィッシュ胚は、短くがっしりした体、短い尾、そして形成不全の脳を持つのが特徴です。

それでも、それらはすべて、体節、脊索、目、耳などの同じ身体部位を持っています。二倍体、半数体、二倍体はすべて、約24時間後に抑制のない屈曲運動を示します。受精後、EP二倍体の兄弟個体は長い尾と適切に形成された脳を持ち、生存率は約60〜70%になるはずです。

これらは、未処理の展開コントロールと非常によく似ています。通常、ハプロ胚のバッチには、外見が良好な胚、死滅した胚、およびその中間の状態の胚が混在しています。外見が良好な胚と欠損のある胚の比率は、雌のゲノムに含まれる有害遺伝子の影響を反映しています。

このような背景があっても、同じ特徴的な表現型を持つ個体が最大50%まで現れるため、変異の特定は比較的容易です。この方法で作製された胚が真のOIDsであることを確認することが重要です。コントロールとして、UV不活化していない精子の一部を取り分けておき、通常の二倍体卵の一群を作製させます。また、EP処置を行わずにUV処理した精子で受精させた卵の一部を取り分けておき、半数体胚の一群を作製させます。半数体は2～3日後に生存できなくなります。EP処理された胚は、通常の二倍体と同様の外見であるはずです。

一部の不規則なEPモンスターが出現することもありますが、EP二倍体のクラッチは概ね70〜90%の生存率を示すはずです。EP処理を施したクラッチに単倍体が存在することは、EPプロセスの失敗（例えば、プレス機の加圧保持の失敗など）を示唆しています。一方、単倍体クラッチに二倍体が存在することは、精子の不活性化が不十分であったこと（例えば、架橋剤の不具合など）を示唆しています。

ゼブラフィッシュを用いた体外受精の方法と、第二次有糸分裂を抑制することで雌性遺伝的二倍体ゼブラフィッシュ胚を作製する方法について説明しました。この手順を行う際は、初期圧力をかけるタイミングが極めて正確であること、および処理期間を通じてプレス機が8,000 pounds per square inchの圧力を維持することが重要です。必ずプレス機の校正を確認してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。