の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ

ここでは、成人の心臓を解剖するためのショウジョウバエの鼓動する心臓を視覚化するための2つの技術を紹介します。まず、頭と胸部を指定された線に沿って1回のカットで取り除きます。次に、腸の鉗子を使用して生殖器を切除し、腹腔を開き、メスのハエの場合は卵巣を切除します。

腹部セグメント3と4の腹部脂肪体は、幼虫の心臓を固定するために成体の心臓を露出させるために慎重に吸い出されます。緩衝液に入れた1匹の幼虫を、まず幼虫の頭部領域の周りにヒストアクラル接着剤を塗布して固定します。幼虫は穏やかに引き伸ばされ、より多くの接着剤が後端に塗布され、次に幼虫の体壁の側面に塗布されます。

こんにちは、G.I.フラーです。こんにちは、カレン・アーです。私たちは両方とも、バーナム医学研究所の開発および老化プログラムのメンバーです。

今日は、ラヴァルと成虫のショウジョウバエの心臓の鼓動を視覚化するために開発した手順をお見せします。これらの調製物は両方とも、ショウジョウバエの心拍パラメータを視覚化、調査、および定量化する方法として使用します。ショウジョウバエ。始める前に、まず人工血リンパ液を準備します。

この溶液にはスクロースエントリであるheloが含まれており、使用直前に冷蔵ストック溶液から人工血リンパに追加する必要があります。細菌汚染を防ぐために、人工血リンパ液を室温に戻して、少なくとも15分間空気を泡立てて溶液を酸素化します。次に、フライで脂肪体を除去するために必要な標準のピペットプーラーを使用して、いくつかの細い毛細血管を引っ張ります。

すべての準備が整ったら、成虫のハエに麻酔をかける必要があります。これは、2〜5分間のフライナップに短時間さらして行うことができますが、フライナップにハエを5分以上放置しないように注意してください。風邪への短期的な曝露は、ハエの麻酔にも使用できますが、二酸化炭素は心拍数と体に長期的な影響を与えるため、推奨されません。

次に、麻酔をかけたハエを背側を下にして、ワセリンの薄層でコーティングしたシャーレに入れます。翼と体の疎水性キューティクルは可逆的にゼリーにくっつくはずですが、フライは必要に応じて再配置できます。最初のカットは、湾曲したスプリングハサミを使用して行われます。

これは、ハサミの刃をフライの脚の下に置き、首の近くの背側表面に向かって角度をつけることによって行われます。頭部、腹側神経索、脚は一度切ってみれば一回切り出します。次に、調製物をスプリングハサミを使用して酸素化人工ヘモリンパ液に浸します。

腹部のセグメント7と8で構成される腹部の後端は、1回のカットで除去されます。これにより、腹部の両端に沿って横方向の切り込みを入れることができ、後腸と腹部のキューティクルとの間の接続を切断するのに役立ちます。ハサミの刃を腹部先端の小さな開口部に差し込み、キューティクルを横に切ります。

これにより、腹側キューティクルの一方の端が解放されます。鉗子でフラップをつかみ、腹部の反対側の側縁に沿って同様の切り込みを入れます。腹側腹部のキューティクルの解放されたフラップを取り外すことができます。

腸と他の腹部臓器は通常、宝石商の鉗子と穏やかに引っ張ることを使用して、単一の塊として除去できます。内臓を取り外すと、鼓動している心臓管が現れますが、これはまだ小さな気道筋によって背側のキューティクルに取り付けられており、脂肪体に囲まれています。引っ張られたキャピラリーはプラスチックに挿入され、1本の16インチチューブが真空源に取り付けられます。

吸引力は先端径に比例するため、先端径が40ミクロンを超えるピペットは一度設置すると使用しないでください。この吸引システムは、心臓管の周りから余分な脂肪を吸い取るために使用されます。また、キューティクルの周りに溜まった気泡やゴミを取り除くためにも使用できます。

心臓自体に触れないように細心の注意を払う必要があり、心臓の後部は非常に壊れやすいため、その領域は一緒に避ける必要があります。成虫のショウジョウバエの心臓管が露出し、必要に応じて鼓動しているはずです。キューティクルと付着した心臓は、キューティクルをワセリンからそっと持ち上げ、再び慎重に突き固めることで再配置できます。

心臓組織との接触を避けます。この時点で、製剤を浸す溶液を新鮮な人工血液リンパと交換する必要があります。この準備は、操作の前に酸素化で20〜30分間平衡化させる必要があります。.

製剤を60分以上維持する場合は、新鮮な人工血液リンパで再 ?? 流する必要があります。.この調製物は、光学記録に使用する準備ができており、電気生理学的記録や組織学的操作にも使用できます。鼓動する心臓内幼虫を視覚化するには、別の手法が必要です。

まずは、施術前日にカバースリップを準備します。これは、つまようじを使用して、約50〜70マイクロリットルのSard溶液を22 x 22ミリメートルのカバースリップに移すことによって行われます。シルガードを摂氏65度で一晩硬化させます。

次に、ブロディとベイツのバッファーを準備したら、アリコートを摂氏マイナス20度で保存し、必要に応じて解凍することができます。最後に、ヒストアクラル接着剤を塗布するために必要なツールを準備します。まず、いくつかの細い毛細血管を引っ張ります。

次に、1.5ミリリットルのピペットチップを直径約32インチの小さなプラスチックチューブに接続します。小さい方の端をチューブに挿入して、もう一方の端に開口部の広いキャピラリーを挿入します。セットアップが完了したら、キャピラリーを接着剤の滴に浸し、プラスチックの先端に優しく吸引して、キャピラリーにヒスト接着剤をロードします。

接着剤を使用するときは、接着剤の毛細血管の先端から余分な接着剤を取り除くために、2番目のガラスキャピラリーを手元に用意する必要があります。接着剤は、緩衝生理食塩水と接触するまで液体であり、数秒以内に硬化します。ただし、通常は、接着剤の毛細管先端から取り外すか、試験片に塗布する間、プラスチックのままです。

次に、幼虫の固定化を開始するために、シルガードの各コーナーの近くにヒストアクラル接着剤を一滴垂らします。カバースリップは、接着剤滴に50マイクロリットルのBとBのバッファーを追加し、接着されたスポット間のスペースをbとbで即座に硬化させます。接着剤はスライド上のバッファーを保持します。

さまようL 3の幼虫を取り、氷の上の濡れたティッシュペーパーの上に2分間置きます。これにより、動きが遅くなります。次に、幼虫をバッファーに移し、背側を上にして向きを変えます。

これは、同じベルトがない幼虫の側です。ヘッド領域とシルガードの間に接着剤をすばやく塗布します。接着剤は非常に速く硬化し、幼虫の頭が動くのを防ぎます。

鉗子を使用して、後部の輝きで動物を慎重につかみ、そっと伸ばします。幼虫の後半分で幼虫の両側に沿って接着剤を塗布することにより、幼虫をこの位置に固定します。体壁の筋肉によるキューティクルのさらなる動きを減らすために、動物の側面にさらに接着剤を追加します。

これで、幼虫はこの位置に固定されます。カバースリップは、人工血リンパ液を充填した小さなペトリ皿に入れることができ、PBSの心拍を体壁の動きに干渉することなく記録できるようになりました。半無傷の成体のショウジョウバエの心臓は、新鮮な酸素化された人工血液リンパで維持されると、解剖後数時間リズミカルに鼓動します。

代表的な例がここに示されており、補足映画では、ここに示されている星の幼虫の3番目から1つの心臓、およびELOの1〜3週間後の若いハエは、一般的に1〜3ヘルツの速度で規則的な心拍を示します。3週間より古いハエは一般的に不整脈です。それにもかかわらず、これらの心臓は、酸素化された人工血リンパ心臓で何時間も自発的に鼓動することができ、解剖手順の結果として損傷を受けた成虫のハエは、通常、リラックスできず、しばしば制御不能になる極端な狭窄の局所領域を示します。1ヘルツより遅い心拍数は、生後3週間未満のハエではめったに観察されません。

その結果、そのような製剤は損傷していると見なされ、廃棄されます。光学イメージング用のレベルと成虫のショウジョウバエの心臓を準備する方法を示しました。半無傷の準備をするときは、決して心自体に触れないでください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。