Name: の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぶショウジョウバエの心臓可視化法。成虫の頭胸部切除と腹部剥離、幼虫のヒストアクリルグルー固定による心臓拍動の観察技術を解説。発生生物学と循環生理学研究に応用可能です。

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あなたが始める前に大人の心<ol><li>新鮮な108mMのNa +、5mMのK +、2mMのCa 2 +は 、8MMのMgCl 2、1mMののNaH 2 PO 4、4mmの飽和NaHCO 3、10mMのスクロース、5mMのトレハロース、5mMのHEPES（pHは7.1、すべての試薬 ​​からを含む人工体液（AH）溶液を調製シグマケミカル）。スクロースおよびトレハロースは、細菌汚染を防ぐために、使用直前に冷蔵保存溶液からAHに追加する必要があります。 </li><li>室温および少なくとも15分間空気バブリングによって酸素を解決するためにAH持参。 </li><li>脂肪の除去に必要ないくつかの細かい毛細血管（例えばガラス管、100ul、VWR）を引き出します。 </li></ol>幼虫の心<ol><li> Sylgardコーティングされたカバースリップ：22x22mmカバースリップの上に、Sylgard溶液を50 -70μl程度の転送を爪楊枝を使って。 ° C一晩65℃Sylgard硬化をしましょう​​。 </li><li> Broadieとベイトのバッファを準備します（135mm幅のNaCl、5mMのKClを、4mmののMgCl 2、2mMのCaCl 2で 、5mMのTES、36mmのショ糖、pHは7.15 Broadieとベイト、1993を参照してください。）。 </li><li> histoacryl接着剤を適用するために必要なツールを準備します。最初に、いくつかの細かい毛細血管（例えば、科学製品GB100T8P）引き出します。チューブに小さい方の端を挿入することにより、小さなプラスチック製のチューブ（タイゴン、1 / 32&quot;）を1.5ミリリットルのピペットチップを接続する。もう一方の端に広い開口部とキャピラリを挿入します。プラスチック製の先端に接着剤と穏やかな吸引のドロップに毛細管を浸漬することによりHistoacryl接着剤でキャピラリーをロードする。接着剤を扱うとき一キャピラリー接着剤の先端から、過剰な接着剤を除去するために手でキャピラリー番目のグラスを持っている必要があります。それは数秒内にそうなる硬化緩衝生理食塩水と接触するまで、接着剤は液体です。しかし、それは通常、試料に印加しながら接着剤キャピラリー先端からまたはに削除されるのに十分な長さのプラスチックのままです。 </li></ol>アダルトフライから半無傷ショウジョウバエのハート<ol><li>大人ショウジョウバエのハエは、2〜5分間フライナップ（キャロライナ生物サプライ株式会社）で麻酔する。ケアは、長い露光のためのフライナップでハエを状態にならないようにご注意ください。寒さへの短期暴露はまた、ハエを麻酔するために使用することができますが、それはもはや心拍数とリズムに永続的な効果を持っているとしてCO 2が推奨されていません。 </li><li>麻酔ハエは、ワセリンの薄層でコーティングされたシャーレに、背側を下に、配置されます。疎水性のゼリーの翼と体可逆的に&quot;スティック&quot;のクチクラが、必要に応じその場を再配置することができます。これは、後続の操作時に特に重要になります。 </li><li>最初のカットは、春のはさみ（Roboz＃5611）の湾曲したペアを使用して行われます。はさみブレードは、足の下に置き、首の近くに胸部の背面に向かって傾斜している。頭、腹側神経索、および脚はシングルカットで削除されます。準備をして酸素、人工血リンパ（AH）溶液中に浸漬される。 </li><li>春のはさみを使用して、腹部（腹部セグメント7と8で構成される）の後部先端は、シングルカットで削除されます。これは腹部の両エッジに沿って横方向のカットを行うためのアクセスを提供し、後腸、腹部キューティクルの間の接続を切断するのに役立つ。腹側腹部キューティクルの解放されたフラップはその後削除されます。 </li><li>腹部の臓器は今だけtracheolsによって所定の位置に保持されているように手順3と4で腸の前部と後部の接続が切断されています。腸や他の腹部臓器は通常、宝石商の鉗子（Roboz、＃55）と揺さぶる優しいを使用して単一の塊として除去することができます。内臓を削除しても、まだ脂肪体に囲まれて背側クチクラに接続されている心臓の鼓動のチューブを明らかにする。 </li><li>脂肪体は、結果としてそれは明らかに心臓のチューブを確認するために、この脂肪の一部を削除する必要がしばしばある光学顕微鏡では非常に不透明です。これは、細かく描かれたガラスキャピラリーを用いた脂肪吸引の技術によって実現されます。毛細血管は、標準的なピペットプラー（例：サッターP - 97ピペットプラー）を使用して作られていますし、真空源に接続されているプラ​​スチック製のチューブ（タイゴン、1 / 16&quot;）に挿入されます。このシステムは、心臓の管の周りから余分な脂肪から吸引するために使用されます。直径40ミクロ​​ンよりも大きなヒントとピペットを使用するべきではありませんので、吸引力は、先端の直径に比例する。心臓の後方部分はこの地域を完全に回避する必要があることを非常に壊れやすいので細心の注意は、心臓自体に触れないように注意しておく必要があります。 </li><li>成体ショウジョウバエの心臓の管が、現在公開され、暴行されるべきである。必要に応じて、キューティクルと接続された心を穏やかにワセリンからキューティクルを持ち上げ、慎重に背部の下のそれを突き、再び心臓組織との接触を避けることによって再配置することができます。 tにおける彼のポイントは、準備の入浴ソリューションは、新鮮なAHLに置き換える必要があります。この調製物は、前の任意の操作に酸素20〜30分間平衡を許可する必要があります。準備が60分以上維持する場合、それは新鮮なAHLで灌流してください。 </li></ol>光記録のための固定化ショウジョウバエの幼虫<ol><li> Sylgardのカバーガラスの各コーナーに近いHistoacryl接着剤の滴を配置。接着剤の滴にB＆Bバッファー50μlのを追加している硬化が即座になります。 B＆Bで接着されたスポットの間にスペースを埋める - 接着剤は、スライド上にバッファを保持します。 </li><li>放浪L3の幼虫を取り、2分間氷上でウェットティッシュの紙の上に置きます。これは、その動きが遅くなります。その後、バッファと東洋背側を上に（これは歯状突起のベルトを欠いている幼虫の側面である）とそれに幼虫を移す。すぐに頭部とSylgardの間にいくつかの接着剤を適用する。接着剤は硬化が非常に速くなりますし、移動から幼虫の頭部を防ぐ。 </li><li>鉗子を使用すると、慎重に後部気門によって動物をつかみ、ゆっくりとストレッチ。後半では幼虫の両側に沿って接着剤を適用することによって、この位置で幼虫を修正。体壁の筋肉がキューティクルのさらなる動きを減らすために、動物の脇腹に多くの接着剤を追加。幼虫は、今この位置に固定されています。カバースリップは、AHLまたはPBSで満たされた小さなペトリ皿に配置することができます。心臓の拍動は、現在、体壁の動きからの干渉なしに記録することができます。 </li></ol>代表的な結果： 新鮮な、酸素AHで維持するときに半無傷の成体ショウジョウバエの心臓は（補足データを参照して、Ocorr、ら、2007）解剖以下の時間のためにリズミカルに負かす事になります。代表的な例は、ムービー1に示します。第3齢幼虫と若ハエ（1 - 3週間後に羽化）からハーツ- 3 Hzの一般的に1の間のレートでの定期的なハートビートを示す。古いより3週間ハエは、一般的に不整脈であり、それにもかかわらず、これらの心はまだ酸素AHLで何時間も自然に打ち負かすことができます。解剖の手順の結果として損傷を受けている成人ハエの心は、一般的にリラックスすることができない極端な収縮の局所領域を示しています。 1Hzよりも遅いビートのレートはほとんど3週齢未満のハエでは観察されない。従ってそのような準備が破損すると破棄されると考えられている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">ムービー1をダウンロードするには、ここをクリック。</a> -露出腹部心管を示す一週間古い大人の野生型のハエ（W 1118実験室株）（左前方）。定期的な、リズミカルな収縮を注意してください。右上隅の不透明な領域が残っている腹部の脂肪体であり、心臓の両側に丸い細胞が心膜細胞である。

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

ショウジョウバエモデルでは、胎生発育から学習や記憶に至るまで、科学的なさまざまな質問に対処するために使用されている強力な遺伝学的ツールであることが証明されている。最近この多目的なモデル生物はハエの心機能の遺伝学を調査するために使用されています。成体ショウジョウバエで心臓生理学を定量化するための試行回数は、腹部のクチクラを通してそのままハエで行った観測に頼ってきた。これらのアプローチのほとんどは、単一のパラメータ、心拍数を定量化するために腹部を介して目視観察や光強度の送信機の変更の記録に頼ってきた。これらのメソッドはいくつかの制限があります：通常、心臓の前端を観察することができる、何が観察されていると、心臓の収縮に二次脂肪体の動きであり、心臓への神経入力はそのままです。成人半無傷準備は心拍数に加えて、パラメータの数の定量化を可能にする機能の心臓の大部分のより詳細なビューを提供します。それは録音の手順（Joveの記事を参照、1435）電気生理学的または光学的に使用することができます。さらに、この調製物は、組織学的操作（Joveの記事を参照、1435）に適しています。また、PCRのための比較的きれいな心臓の組織サンプル、ウェスタンブロッティン...

<table><tbody><tr><td>マイクロ解剖用バネ剪刀（曲）</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>粗い切断に適している（ステップ3）</td></tr><tr><td>マイクロ解剖用バネ剪刀（直）</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー, 100ul</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー, 細径</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>水平および垂直の両方のピペットプラーが使用可能</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>Tygon</td><td>1/16&amp;#8221; 内径</td><td>100&amp;#x03BC;l キャピラリー用</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>Tygon</td><td>1/32&amp;#8221; 内径</td><td>小径キャピラリー用</td></tr><tr><td>Histoacryl&amp;#174; 組織用接着剤</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;心臓は最近、遺伝子、細胞、および筋原性心内分子メカニズムの基礎となる機能を調べるための良いモデル系として注目されています。ハエで心機能を調べる上で重要なステップは、まだ心臓の鼓動の臓器を観察し、記録されることを可能にしながら、その筋の機能を維持する方法で、心臓にアクセスする方法を見つけることです。幼虫と成人の両方で心臓の鼓動を観察し、記録するための2つの異なった方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ここで説明されています。大人のハエを使って私たちの半無傷の準備は、色素性クチクラからの干渉と脂肪体を覆うことなく、腹部、心臓の明確な可視化が可能になります。幼虫の心臓を記録するには、それにより心筋の収縮に関連付けられていない心の動きを減らし体壁の動きを最小化する幼虫を、固定化する必要が打つ。私たちの方法論は1-3 Hzのレートでの時間のために打つことができる安定した大人と幼虫の心の準備を生成する。

幼虫および成体での心臓の鼓動を可視化するために必要なテクニック<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;提示されます。各ライフステージでは、異なる方法論が必要になります。

ショウジョウバエ（Drosophila）の心臓は、...における機能の根底にある遺伝学的、細胞学的、および分子生物学的メカニズムを検討するための優れたモデルシステムとして、近年注目を集めています。

ここでは、成体心臓の解剖に向けて、Drosophilaの拍動する心臓を可視化するための2つの手法を提示します。まず、指示された線に沿って一度に切断し、頭部と胸部を除去します。次に、生殖器を除去し、ピンセットを用いて腹部の体腔を開きます。その後、腸管を取り除き、雌のハエの場合は卵巣を除去します。幼虫の心臓を固定するため、腹部第3および第4節にある腹部脂肪体を慎重に吸引除去し、成虫の心臓を露出させます。バッファー溶液に入れた1匹の幼虫の頭部周辺に、まず histo acral glue を塗布して固定します。幼虫をゆっくりと伸展させ、さらに後端に、次いで幼虫の体壁の両側面に glue を塗布します。こんにちは、GI Flerです。こんにちは、Karen erです。私たちはともにバーナム医学研究所の開発および老化プログラムのメンバーです。本日は、幼虫および成体ショウジョウバエの拍動する心臓を可視化するために我々が開発した手順について解説します。これらの調製法を用いて、ショウジョウバエにおける心拍パラメータの可視化、観察、および定量化を行います。まず、準備として人工血リンパ溶液を調製します。この溶液にはスクロース成分が含まれており、使用直前に冷蔵保存されたストック溶液から人工血リンパに添加する必要があります。細菌汚染を防ぐため、人工血リンパを室温に戻し、エアバブリングによって少なくとも15分間溶液に酸素を供給してください。次に、標準的なピペットプラーを用いて細いキャピラリーを数本作製します。これは、ハエの脂肪体を除去する際に必要となります。すべての準備が整ったら、成虫のハエを麻酔します。これはFlyNapに2〜5分間短時間さらすことで行えますが、5分以上にわたってFlyNapに放置しないよう注意してください。また、短時間の冷却による麻酔も利用可能ですが、心拍数や活動性に長時間の影響を及ぼすため、二酸化炭素の使用は推奨されません。次に、麻酔をかけたハエを、薄くペトロラタム（ワセリン）を塗布したペトリ皿に背面を下にして置きます。翅と体の疎水性クチクラがゼリーに可逆的に付着しますが、必要に応じてハエの位置を調整することができます。まず、曲がり鋏を用いて最初の切開を行います。ハエの脚の下に鋏の刃を配置し、首に近い背面に向かって斜め下に向けます。一度切断すると、頭部の腹側神経索と脚が一度に除去されます。その後、スプリング鋏を用いて、標本を酸素供給された人工血リンパ液に浸します。腹部第7および第8節で構成される腹部後端を、一回の切断で除去します。これにより、腹部の両縁に沿って側切を行うためのアクセスが確保され、後腸と腹部クチクラとの接続を切断することができます。鋏の刃を腹部先端の小さな開口部に挿入し、クチクラを側方に切断します。これにより、腹側クチクラの片側の端が解放されます。ピンセットでフラップを掴み、腹部の反対側の外側端に沿って同様に切開します。これで、解放された腹側腹部クチクラのフラップを取り除くことができます。腸およびその他の腹部器官は、通常、精密ピンセットを用いて優しく牽引することで、一塊として除去できます。内臓を除去すると、拍動する心管が現れます。心管は小さな空気筋によって背側のクチクラに付着しており、脂肪体で囲まれています。引き出された毛細管を、真空源に接続された1/16インチのプラスチックチューブに挿入します。吸引力はチップの直径に比例するため、一度設定した後は直径40 µm以上のチップを備えたピペットを使用しないでください。この吸引システムは、心管周囲の過剰な脂肪を除去するために使用します。また、クチクラ周囲に蓄積した気泡やデブリの除去にも使用できます。心臓自体に触れないよう細心の注意を払う必要があります。また、心臓の後部は非常に脆弱であるため、その領域も同様に避けてください。これで成虫のショウジョウバエの心管が露出しており、必要に応じて拍動していることが確認できるはずです。クチクラとそれに付着した心臓は、クチクラをワセリンからそっと持ち上げ、慎重に押し戻すことで位置を調整できます。心臓組織に接触しないように注意してください。この時点で、標本を浸している溶液を新鮮な人工血リンパ液に交換します。操作を開始する前に、酸素供給を行いながら20〜30分間平衡化させてください。調製物を60分以上にわたって維持する場合は、新鮮な人工血リンパで再灌流させる必要があります。これで本調製物は光学記録に使用できる状態となり、電気生理学的記録や組織学的操作にも利用可能です。幼虫内で拍動する心臓を可視化するには、別の手法が必要となります。まず、処前の日にカバーガラスを準備します。爪楊枝を用いて、Sard溶液 50〜70 µLを 22 by 22 mmのカバーガラスに転写します。Sylgardを 65 °Cで一晩硬化させます。次に、BrodyおよびBatesバッファーを調製します。調製後、分注して-20 °Cで保存し、必要に応じて解凍して使用できます。最後に、histo acral glueを塗布するために必要な器具を準備します。まず、細いキャピラリーを数本引き出します。次に、直径約1/32インチの小さなプラスチックチューブを1.5 mLピペットチップに接続します。チューブの細い端にキャピラリーを挿入し、開口部の広い側が反対端に来るようにします。セットアップ後、キャピラリーを接着剤の一滴に浸し、プラスチックチップへの穏やかな吸引によって、キャピラリーに組織用接着剤を充填します。接着剤を使用する際は、接着剤用キャピラリーの先端に付着した過剰な接着剤を取り除けるよう、予備のガラスキャピラリーをすぐに使える状態で用意しておく必要があります。接着剤は液体状ですが、緩衝生理食塩水に接触すると数秒以内に硬化します。ただし、通常はキャピラリーの先端から取り除いたり、試料に塗布したりするのに十分な時間、可塑性を維持します。次に幼虫の固定を開始するため、Sylgardカバースリップの各コーナーの近くにHisto-acral glueを1滴ずつ配置します。接着剤の滴にB&amp;Bバッファーを50 µL加えると、すぐに凝固します。接着箇所に囲まれた空間をB&amp;Bバッファーで満たしてください。これにより、バッファーがスライド上に保持されます。遊走期のL3幼虫を1匹取り、氷上の湿らせたティッシュペーパーの上に2分間置きます。これにより、幼虫の動きを鈍らせます。次に、幼虫をバッファーに移し、背側を上にするように向きを調整します。こちらは同一の帯状構造を持たない幼虫の側面です。頭部領域とシルガードの間に、少量の接着剤を速やかに塗布します。接着剤は非常に速く硬化し、幼虫の頭部の動きを固定します。ピンセットを用いて、動物の後端部分を注意深く掴み、緩やかに伸ばします。幼虫の後半部分の両側に接着剤を塗布し、この状態で固定します。体壁筋によるクチクルのさらなる動きを抑えるため、動物の側面にさらに接着剤を追加します。これで幼虫はこの位置に固定されました。カバーガラスを人工血リンパまたはPBSを満たした小型ペトリ皿に入れることで、体壁の動きによる干渉を受けることなく心拍を記録できます。解剖後、新鮮で酸素を供給した人工血リンパ中で維持すれば、半温存状態の成体ショウジョウバエの心臓は数時間にわたって律動的に拍動し続けます。代表的な例をここに、および補足動画1に示します。ここで示す羽化後3日の幼虫および羽化後1〜3週間の若いショウジョウバエの心臓は、一般的に1〜3 Hzの速度で規則的な鼓動を示します。一方、羽化後3週以上のハエは、一般的に不整脈傾向が強くなります。それにもかかわらず、これらの心臓は、酸素飽和させた人工血リンパ中で数時間にわたり自発的に鼓動し続けることが可能です。解剖手順の結果として損傷した成虫の心臓では、通常、極度に収縮して弛緩できず、しばしば制御不能に拍動する局所的な領域が見られます。羽化後3週未満のハエにおいて、1 Hzより遅い心拍数が観察されることは稀です。その結果、そのような標本は損傷しているとみなされ、廃棄されます。以上で、光学イメージング用のショウジョウバエの幼虫および成虫の心臓の作製方法を実演しました。半心拍標本を作製する際は、心臓自体には決して触れないように注意してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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