病原体関連分子パターン（PAMP）トリガ型植物におけるイミュニティ（PTI）のアッセイ

こんにちは。私はVoice Thompson植物研究所のGreg Martin研究室のSuma TIです。本日は、PAM誘発免疫（PTI）に関する細胞死ベースのアッセイの手順について説明します。私たちの研究室では、ある遺伝子がPTIに関与しているかどうかを調べるためにこの手順を用いています。

それでは、始めていきましょう。まず、Nicotiana ANAを約7週間まで成長させます。開始の4〜5日前から準備してください。

PAM誘発免疫（PTI）アッセイ。植物のすべての側芽および花を取り除くため、トリミングを行います。植物を扱いやすくするため、側芽が出現後すぐに除去するようにしてください。

植物の準備が完了したら、細菌の培養に進みます。この手順では、チャレンジ細菌による2回目の接種に先立ち、植物免疫を誘導するために非病原性細菌を使用するため、アッセイで使用するすべての細菌の培養を開始します。同時に、各pseudomonas細菌ストックについて、pseudomonas細菌の凍結グリセロールストックを使用してください。

適切な抗生物質を含むKBMプレートの中央に少量の細菌を塗布し、30 °Cで約18〜24時間培養します。アグロバクテリウムについては、あらかじめ準備した新鮮なプレートを用い、2 mLのLB培地で液体培養を開始します。30 °Cで振盪しながら一晩培養し、翌日に使用します。

150から200 µLの液体KBMをシュードモナス属細菌のプレートに添加します。滅菌済みのスプレッダーを用いて、細菌をプレート全体に塗り広げます。

プレートをインキュベーターに戻し、さらに20〜24時間培養します。アグロバクテリウムの二次培養を、20 µMのアセトアミドを含む5〜10 mLのLB培地で開始します。

30 °Cで振盪しながら一晩培養します。細菌の調製後、PTIアッセイ実施の前日に、アッセイ用の植物の調製を行います。細菌の調製が完了したら、植物を温度22～24 °C、相対湿度約35～40%の定光条件下にある室内に移動させます。

次に、太い黒のマーカーを使用して、葉に円を描きます。十分に展開した葉を選択し、古い葉や、触ったときに硬いまたは厚い葉は避けてください。また、葉の下部はマークしないようにしてください。

円の直径は少なくとも 1.5 centimeters とし、葉1枚につき2〜4つの円をマークします。円は十分な間隔を空け、なるべく太い葉脈をまたがないように配置してください。PTI誘導に使用した細菌を回収し、PTIアッセイを開始します。

使用するPseudomonas属菌は、良好な増殖を示す細菌集落（ローン）を形成している必要があります。滅菌済みの長い木製スティックでプレートからかき取り、回収した後、Agrobacterium遠心分離用の10 millimolar塩化マグネシウム溶液約20～25 millilitersに再懸濁します。

細胞を回収するための培養液を遠心分離し、約20〜25 mLの10 mM 塩化マグネシウムおよび10 mM MES（pH 5.6）に再懸濁します。再度遠心分離を行い、再び約20〜25 mLの塩化マグネシウムおよびMES溶液に再懸濁します。これで、誘導に用いるPseudomonasおよびAgrobacterium細菌の再懸濁が完了しました。

波長600ナノメートルで、3種類すべての培養液の光学密度を測定します。pseudomonasには塩化マグネシウムを、agrobacteriumにはMESおよび塩化マグネシウムを用いて細胞を希釈し、OD値を調整します。最終的に必要なOD値は、付属の書面プロトコルに記載されています。

25 millilitersの細菌培養液があれば、約40から50か所のスポットに接種するのに十分です。ここで、針のない1 milliliterシリンジを用いて、葉上のあらかじめマークした円の中にPTI誘導剤を浸潤させ、アッセイを開始します。植物に浸潤させた順番と、誘導後の浸潤開始時刻を正確に記録してください。

誘導接種から数時間後に、チャレンジ接種に進みます。誘導に使用したシュードモナス株と同様の手順で、チャレンジ接種に必要な細菌株を回収します。再度ODを測定し、付属のGRプロトコルに従って培養液の濃度を調整します。

インデューサーの浸潤から7時間後に、チャレンジ接種を開始します。以下のインデューサーとチャレンジ剤の組み合わせを使用してください。1回目の接種円の周辺上の1点を、2回目の接種円の中心として選択します。

誘導時と同じ植物の順序で、チャレンジ浸潤を行います。葉の上に複数のスポットがある場合は、浸潤領域が重ならないように注意してください。最後に、アッセイに使用したすべての培養液を連続希釈し、適切な抗生物質を含むKBMまたはLBプレートに塗布します。

チャレンジ接種の2日後から、PTI応答の評価を開始することができます。誘導およびチャレンジ接種の2日後に、Pst DC3000を接種した部位において、エフェクター誘発免疫（ETI）による細胞死の出現を確認します。浸潤した領域が重複する部分での細胞死は、PTIの破綻を示しており、陽性表現型としてスコア付けされるべきです。誘導およびチャレンジ接種の4〜5日後に、DC3000 hop Q1変異体またはPst DC3000を接種した部位において、病原性による細胞死の出現を確認します。ここでも、浸潤の重複領域における病原性による細胞死で示されるPTIの破綻を確認してください。PTIが損なわれていない個体が、浸潤の重複領域に細胞死を示し始めるまで、植物の観察を継続します。

FLS2をサイレンシングした植物では、PFDC複合体を接種した2日後にPTIが損なわれます。重複領域に細胞死が見られることは、PTIの崩壊を示しています。どの遺伝子もサイレンシングしていないコントロール植物にも同様にPFDC複合体を接種し、アッセイ実施の2日後に観察したところ、正常なPTI応答により、重複領域の内部ではなく外部にのみチャレンジによる細胞死が見られました。

以上で、PTI（PAMPトリガード免疫）に対する細胞死ベースのアッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、推奨される環境条件下で植物を維持することが重要です。湿度が高くなると植物に悪影響を及ぼし、アッセイの進行が早まりすぎてしまいます。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。