病原体関連分子パターン（PAMP）トリガ型植物におけるイミュニティ（PTI）のアッセイ
September 9th, 2009
タバコbenthamiana植物のPTIのための細胞死ベースのアッセイが記載されている。
こんにちは、Voice Thompson Institute for Plant ResearchのGreg Martinの研究室のSuma TIです。本日は、PAMトリガー免疫(PTI)の細胞死ベースのアッセイの手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、PTIにおける遺伝子の関与を探します。
それでは始めましょう。生後約7週間になるまでNicotiana ANAを成長させることから手順を開始します。開始の4〜5日前。
PAMは免疫またはPTIアッセイをトリガーしました。植物をトリミングして、すべての腋窩の枝と花を取り除きます。植物をより管理しやすくするために、腋窩の枝が出てきたらすぐに取り除いてみてください。
植物を準備した後、バクテリアの増殖に進みます。この手順では、チャレンジ細菌の2回目の接種に先立って植物免疫を誘導するために非病原性細菌を使用し、アッセイで使用されるすべての細菌の増殖を開始します。同時に、各シュードモナス菌の茎にシュードモナス菌の凍結グリセロール茎を使用します。
適切な抗生物質が入ったKBMプレートの中央に少量の細菌を広げ、プレートを摂氏30度で約18〜24時間インキュベートします。アグロバクテリウムについては、事前に準備した新鮮なプレートを使用して、2ミリリットルのポンドで液体培養を開始します。摂氏30度で一晩成長させ、翌日に振る。
シュードモナス菌のプレートに150〜200マイクロリットルの液体KBMを追加します。バクテリアをプレート全体に広げます。滅菌グリーターを使用。
プレートをインキュベーターにさらに20〜24時間戻します。4つのアグロバクテリウム。20マイクロモルのアセトンを含む約5〜10ミリリットルのLBで二次培養を開始します。
30°Cで一晩で振とうしながら培養します。細菌を調製した後、PTIアッセイを実施する前日にアッセイのために植物を調製します。バクテリアを準備した後、植物を約35〜40%の相対湿度と一定の光で摂氏22〜24度の部屋に移動します。
次に、太い黒いマーカーを使用して、葉に円をマークします。十分に広げられた葉を選び、古い葉や手触りが硬い葉や厚い葉は避けてください。葉の下部に印を付けることは避けてください。
円の直径は少なくとも1.5センチメートルで、葉ごとに2〜4個の円をマークできます。円は十分な間隔で配置し、できれば大きな静脈と交差しないようにする必要があります。PTIの誘導に使用された細菌を採取して、PTIアッセイを開始します。
使用されたシュードモナス種は、良好な成長を示す細菌性の芝生を形成しているはずです。滅菌した長い木の棒でこすり落としてプレートから収穫し、約20〜25ミリリットルの10ミリモルに再懸濁します。アグロバクテリウム遠心分離機用の塩化マグネシウム溶液。
培養液を採取し、10ミリモルの塩化マグネシウムと10ミリモルの20〜25ミリリットル程度で懸濁液を蘇生する。MES pH 5.6、遠心分離を繰り返し、再び、塩化マグネシウムとMES溶液の約20〜25ミリリットルで懸濁します。これで、誘導するシュードモナス菌とアグロバクテリウム菌が再懸濁されます。
3つの培養物すべての光学密度を600ナノメートルの波長で測定します。シュードモナス菌には塩化マグネシウム、アグロバクテリウムにはMESと塩化マグネシウムで細胞を希釈することにより、ODSを調整します。最終的に必要なOD値は、付属の書面によるプロトコルに記載されています。
総量25ミリリットルの細菌培養物は、約40〜50スポットを接種するのに十分です。次に、針なしの1ミリリットルのシリンジを使用して、葉の事前にマークされた円にPTIインデューサーを浸透させることにより、アッセイを開始します。植物が浸透した順序と、誘導後に浸透が始まった正確な時間を書き留めます。
導入接種から数時間後にチャレンジ接種に進みます。チャレンジ接種に必要な細菌株を、シュードモナス菌株を誘導するために前述したように収穫する。再度、ODを測定し、付属のGRプロトコルに従って培養物の濃度を調整します。
インデューサー浸潤から7時間後にチャレンジ接種を開始します。次のインデューサーチャレンジャーの組み合わせを使用します。最初の接種円の周囲上の点を、2番目の接種円の中心として選択します。
チャレンジインフィルトレーションは、インダクションと同じ順序でプラントを実行します。葉に複数のスポットがある場合は、浸透が重ならないようにしてください。最後に、アッセイで使用したすべての培養物を、適切な抗生物質を含むKBMまたはLBプレート上でプレートの段階希釈を行います。
チャレンジ接種の2日後、誘導およびチャレンジ接種の2日後にPTI応答の評価を開始でき、浸潤の重複領域内でPST DC 3000細胞死がチャレンジされたスポットでエフェクタートリガー免疫またはETIによる細胞死の出現を探します PTIの内訳を示し、誘導およびチャレンジの4〜5日後に陽性の表現型として採点する必要があります接種では、DC 3000ホップQ1変異体またはPSが再び高値に戻った場所で、病気による細胞死の出現を探します。浸潤の重なり合う領域の疾患による細胞死によって示されるPTIの内訳を探します。PTIのために損なわれていないものが浸潤の重なり合う領域で細胞死を示し始めるまで、植物を観察し続けます。
FLS 2で沈黙した植物は、PFDCの組み合わせで接種した2日後にPTIで損なわれます。細胞死は、どの遺伝子についてもサイレンシングされていないPTIコントロール植物の崩壊を示す重なり合う領域に見られます。また、PFDCの組み合わせを接種し、アッセイ実施の2日後に検査したところ、正常なPTI応答のためにオーバーラップ領域の外側には見られないが、オーバーラップ領域の内側には見られないという課題による細胞死
が認められました。この手順を行いながら、Pantトリガー免疫またはPTIの細胞死ベースのアッセイを実行する方法を示しました。植物を私たちが推奨する環境条件に保つことを忘れないことが重要です。湿度が高いと、植物に悪影響を及ぼし、アッセイをより迅速に進行させることができます。
というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、ニコチアナ・ベンサミアナ植物におけるPAM誘発免疫（PTI）の細胞死ベースの検定について説明しています。この手順には、植物と細菌の準備に続いて、PTI応答を評価するための一連の接種が含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物免疫学
- 細胞死アッセイ
- 病原体-植物相互作用
背景
- PAM誘発免疫（PTI）は植物の重要な防御機構です。
- ニコチアナ・ベンサミアナは植物免疫の研究に広く使用されています。
- PTIの理解は、病気耐性のある植物品種の開発に役立ちます。
- 細胞死アッセイは免疫応答を評価するために不可欠です。
研究の目的
- ニコチアナ・ベンサミアナにおけるPTIを評価する方法を示す。
- PTI応答における特定の遺伝子役割を調査する。
- 植物免疫学の研究者向けの詳細なプロトコルを提供する。
使用された方法
- 葉を切り取り、印を付けることによるニコチアナ・ベンサミアナ植物の準備。
- PTIを誘発するための非病原性細菌の成長。
- 事前に印を付けた葉の領域への細菌培養の浸透。
- 挑戦接種後の細胞死応答の評価。
主要な結果
- 細胞死アッセイを通じてPTIの成功的な誘発が観察されました。
- 重複領域での細胞死はPTIの崩壊を示しました。
- 対照植物は重複領域での細胞死なしに正常なPTI応答を示しました。
- 特定の遺伝子がサイレンシングされた植物は、妥協されたPTI応答を示しました。
結論
- 記述された検定はニコチアナ・ベンサミアナにおけるPTIを効果的に評価します。
- PTIメカニズムの理解は植物育種戦略に情報を提供できます。
- この方法は植物免疫の様々な研究に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This assay enables mechanistic de-risking of plant immune pathways by quantitatively linking PAMP recognition to downstream defense outputs. It supports target validation in agrochemical discovery by providing a reproducible readout for compounds that modulate PTI. The method enhances predictive confidence in early-stage screening for molecules that enhance or suppress plant immunity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the FLS2-flg22 signaling axis to validate pattern recognition receptors as therapeutic targets.
- Operational Value: Uses a cell death phenotype to functionally confirm PTI competence or breakdown in genetic or chemical perturbation models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs (overlapping vs. non-overlapping cell death) to distinguish PTI efficacy from ETI or disease susceptibility.
- Operational Value: Standardized in Nicotiana benthamiana, a scalable transient expression system amenable to high-throughput agroinfiltration workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular initiation (PAMP-PRR binding) to organismal outcomes (cell death containment), enabling pathway continuity assessment.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between molecular biologists and plant pathologists via a shared phenotypic endpoint.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement (PAMP-PRR binding) to functional validation (immune output) and phenotypic screening (compound library screening for immunomodulators).
- Discovery Biology: Tests whether a gene, protein, or small molecule modulates the earliest detectable output of PRR signaling.
- Screening: Delivers a binary, imaging-compatible readout (cell death presence/absence in overlap zone) amenable to automated scoring.
- Analytics: Enables comparison of PTI strength across genotypes or treatments via spatial quantification of defense responses.
- Translational Research: Bridges lab-based immune assays to field-relevant outcomes by modeling how early signaling affects disease resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a plug-and-play platform for testing diverse PAMPs, effectors, or microbial strains in a common phenotypic format.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor activation to a defined immunological consequence.
- Operational Value: Requires only basic infiltration and microscopy equipment, enabling broad adoption across discovery and translational teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in agrochemical lead optimization by predicting field-relevant immune priming capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on mechanistic fidelity to native PTI.
Implementation Considerations
- Expertise in plant growth, bacterial culture, and leaf infiltration techniques.
- Access to controlled-environment growth chambers with precise humidity and lighting.
- Standardized bacterial strains and optical density adjustment protocols for reproducible PAMP delivery.
- Adaptation considerations for different plant species or PAMP-effectors beyond flg22-FLS2.
- Practical limitation: Assay sensitivity to environmental variables necessitates strict growth condition controls.
