Name: 脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 学ぶ定量的リン酸化プロテオミクス法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、質量分析による細胞シグナル伝達メカニズムの研究を強化します。HILIC分画とIMAC濃縮を含む手法です。

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我々は、技術的な質量分析の解析と有用な議論の支援、そして博士のために博士リッチロジャースに感謝したいと思います。ロブサンモリッツ、ジェフRanish、および有用な議論のためのハミドMirzai。 この作品は、優秀のNIHセンターによって資金を供給された。

細胞増殖とメディア<ol><li>その後、1.0のOD 600〜100mlリッチメディアで一晩BY4742Δarg4Δlys1細胞の単一コロニーを含む最小の酵母培地の二つ1リットルの培養（硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない0.17％酵母窒素塩基、0.5％硫酸アンモニウム）にシードとリジン（13 C 6 15 N 2、Isotec）、同位体的に正常または重いアルギニン（Isotec 13 C 6 15 N 4）の20mgの/ Lを添加したアミノ酸の充実した、。 </li><li>細胞は1.8のOD 600に、18時間増殖させた。それは、細胞が標識された同位体の完全な取り込みを実現するために少なくとも9世代を経ることが重要です。光サンプルは、培地を（同位体、通常のアルギニンとリジン、0.2％オレイン酸（シグマケミカル）及び0.5％のTween 40（Sigma社化学））を含むオレイン酸に再シードし、別の85分のために刺激された、滅菌水で洗浄し、ペレット化した。これは、アルギニンやリジン、オレイン酸で刺激したサンプルと同位重いグルコース産の参照試料を基準にして、軽い同位得られます。 </li></ol>ペプチドの細胞の溶解、分離および分画<ol start="3"><li>遠心ボトルを秤量する。 3分間の遠心分離により収穫のサンプル。メディアを取り出し、余分な液体を吸引除去する。ペレットとボトル（通常1〜2グラムの生成します）、液体窒素中で、フラッシュの凍結を量る。液体窒素で凍結ペレット（リン酸塩（PBS、Gibco）を緩衝生理食塩水、10％グリセロール、プロテアーゼ阻害剤（SigmaFASTのプロテアーゼインヒビター錠、シグマ）の&quot;粉砕&quot;バッファのペレットの重量にボリュームと同等を追加し、ホスファターゼ阻害剤をHALT（サーモサイエンティフィック））。 </li><li>液体窒素中で粉砕容器を凍結する。液体窒素が沸騰停止するまで待ちます。冷凍ボールベアリングで、粉砕容器にペレットを転送します。 </li><li> 3分間方向の反転で1分20秒のサイクルで、600rpmで挽く。液体窒素中で粉砕容器を再冷凍。合計粉砕時間15分4回繰り返します。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブの代わりにドライアイスに冷凍grindateを収集する。使用を-80℃で保存するまで準備。 </li><li> 8M尿素、0.1Mの重炭酸アンモニウム、0.1MトリスpH 8.6の10mlのソリューションとなります。冷凍grindateの1ボリューム（尿素のバッファの例の3mls用PBS緩衝液1mlで1グラムペレットに添加）に尿素緩衝液の3倍量を追加。すぐに、プローブ先端の超音波処理（ - 10秒間のパルス2）との混合物を超音波で分解する。ソリューションの泡立ちを防ぐために、チューブの底近くに先端をキープ。 grindateは直ちにソリューションに行く必要があります。 </li><li> 4℃で5分間、遠心分離によってライセートをクリア℃に</li><li>新鮮なチューブに上清を移します。 </li><li> 0.5Mトリス[2 - カルボキシエチル]ホスフィン（TCEP）の新鮮なアリコートを行う。 5mMの最終濃度のために1:100でサンプルに追加。 37℃を1時間</li><li>削減システインのアルキル化。室温に冷却してください。 1Mヨードアセトアミドの新鮮なアリコートを行う。 （我々は箔で管を包む）暗所で保管してください。 20mmの最終濃度に追加し​​ます。室温で1時間、暗所でインキュベートする。 </li><li> 1時間室温で1M株式から20mm DTTとヨードアセトアミドを癒やす</li><li>標準ブラッドフォードまたはBCAアッセイ（記載されていない）を持つ蛋白質を定量化する。下のSDS PAGEによって分析用のサンプルを取る。 </li><li>重い同位体の取り込みを検証するには、縮小およびアルキル化ライセート100μlを使用してください。のdH 2 Oで1:4に希釈して、超音波で分解し、トリプシンに50:1タンパク質でトリプシンを追加。 C18 Ultramicrospin列（ネストグループ）とVACし、脱塩速度のダウンは最低4時間、乾燥サンプルのダイジェスト。 <ol><li>アセトニトリル100μlの水和物列</li><li> 200μlの0.1％TFAで平衡化する。 </li><li> 200μlの0.1％TFAで乾燥したサンプルを再懸濁します。カラムにロードします。 〜200 XGまたは列内の流れのために必要な最小限の速度で遠心する。 </li><li> 200μlの0.1％TFAで2回洗浄。 </li><li> 50μlの60％アセトニトリル、0.1％TFAで二回で溶出。 </li><li> VACスピードで乾燥したサンプル。 </li><li> 20μlの0.1％ギ酸でサンプルを再懸濁します。質量分析計を2μlを実行します。それぞれm / zのスペクトル10と8ダルトンのシフトによって同位体重いアルギニンとリジンの取り込みを確認してください。 98パーセント - 各アミノ酸のための取り込みは、96の間でなければなりません。 </li></ol></li><li>同位体重いと光の試料の等量（タンパク質のmg）をミックス。 </li><li> 20％メタノールでサンプル1:4希釈する。 </li><li> 1:200でトリプシンを追加。 37℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>その消化はSDS PAGEで完了するために行っているを確認してください。 2を実行し、前消化のサンプルの4μLおよび8後トリプシン消化物のdを16μlの。消化が完了したことをクマシー染色によって可視化する。それが完了していない場合、プローブ先端の超音波処理を短時間でサンプルを超音波で分解し、トリプシンで再びダイジェスト。 </li><li> VAC速度でサンプルを下に乾燥させる。乾燥したペレットを溶液になるまでフィルタリングのdH 2 Oと渦の200μlを追加すると。 VAC速度でサンプルを下に乾燥させる。のdH 2 Oで再懸濁します再度サンプルを乾燥させる。 </li><li> 0.1パーセントトリフルオロ酢酸でペレットを再懸濁します（TFA;シグマ）。 pHがストリップを用いて3程度であることを確認してください。 10％のTFAで酸性化する必要があれば。 </li><li>沈殿物からペレット。 </li><li>ウォーターズをSep - Pak Vacを500mgのC18カラムでサンプルを脱塩。これらの列をオーバーロードしないでください。最大量は5 mgのですが、それは少し少なめにロードする方が良いでしょう。必要に応じて複数の列の間にサンプルを分割します。 <ol><li>水和物5ミリリットル、100％アセトニトリルでカラム。 〜200 XGまたは列内の流れのために必要な最小限の速度で遠心する。 </li><li> 5ミリリットルの0.1％TFAでカラムを平衡化する。サンプルをロードします。フローを収集し、再度ロードする。 </li><li> 5ミリリットルの0.1％TFAで洗浄する。繰り返します。 </li><li> 2ミリリットル60％アセトニトリル、0.1％TFAで溶出。 </li><li> VAC速度でサンプルを下に乾燥させる。 </li></ol></li></ol>リン酸化ペプチドのペプチド分画と分離<ol><li>ペプチドは、HILICカラムで分画しています。我々は、東ソーTSK - GELアミド- 80 4.6ミリメートルX 25センチメートルガードカラムと分析カラムが使われています。このステップであなたの時間をかけ、次に実行する2つの空白の勾配は、サンプルをロードする前に、90％で2時間の列を実行します。このサイズはXXになるものと考えられている列の最大負荷は、我々は通常は実行ごとに5つ以上の投与をロードしないでください。 </li><li>溶剤 - 98パーセントACN/0.1％TFA 溶媒B - 2％ACN/0.1％TFA 90％負荷以上20&#39;、90％85％以上の5&#39;、85％〜60％以上40&#39;、60％0％から5以上&quot;、0％〜90％以上5&#39;。 </li><li>流速は1ml/minであり、分画は85％〜60％の勾配で始まる2分間隔で収集した。 </li><li> 10のフラクションの数を減らすためにフラクションを組み合わせる。増加した分画は、おそらくリン酸化プロテオームの高いカバレッジを得られます。 </li></ol>リン酸化ペプチドの濃縮<ol><li>リン酸化ペプチドは、PHOS -セレクト鉄のアフィニティーゲルを用いて濃縮される。我々は、一定分量たちのIMAC樹脂を融解凍結を避けるために。 250mMの酢酸の50mlの、30％ACNの負荷のソリューションを行います。 HClでpH 2.7〜をもたらす。負荷溶液500μlにペレットを再懸濁します。必要に応じてHClまたはNaOHで調整し、pHを確認してください。 </li><li>適切な列のIMACビーズの予備洗浄​​を200μl。我々はMolbiotecスピンカラムを使用してください。 各画分に50％のスラリー（ゲルソリューションをロードするため）の15μlを加え、そして最後の回転を介してエンドと30&#39;​​のサンプルをインキュベートする。分析のための手順を守って下さい。 </li><li>負荷液で試料を3回洗浄し、一回で500μlのフィルタリングのdH 2 Oを</li><li> 2でペプチドを溶出- 50mMののNa 2 HPO 4（pHは8.4）緩衝液400μlの3分。ガラスバイアルに移す。 </li><li> 5μlの100％のギ酸、液体窒素中でフラッシュ凍結、およびVACスピードで乾燥試料ダウンでpH3に酸性化。 </li><li> 0.1％TFA、前述のようにきれいなC18の200μlに再懸濁し、リン酸化ペプチド。 VAC速度で溶出サンプルを乾燥させる。 </li><li> 0.1％ギ酸20μlにペプチドを再懸濁します。質量分析計の分析ごとに2μlを使用するか、または必要に応じて。 </li></ol>ノートずっとこのプロトコルのためには&quot;ブラインド&quot;働くことになります。細胞溶解は、ウェスタンブロットおよびブラッドフォードまたはBCAアッセイによって監視することができる、とトリプシン消化にも容易に評価することができます。 HILICカラムはこれに似たトレースを与えた、または他の[1、2]使用されている液体クロマトグラフィーのマシンに依存することによって見られるだろう。サンプルは、質量分析法によって監視され、そのような高質量精度、高解像度のマシン上で高コストの分析に行く前にLCQsまたはMALDIsなどの安価なマシン上でサンプルをテストします。あなたがそれに酸でサンプルをダウン乾燥最後に場合、ガラスを使用してください。

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
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<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

このメソッドは、定量的に分析することができるリン酸化ペプチドの濃縮が得られます。パラメータの数は、このプロトコルに変更が、覚えておくべき最も重要な側面は、リン酸化を維持することですすることができます。定量化のための細胞の調製はin vivoであなたの細胞を標識することができない場合など、さまざまな方法で達成することができる、などICATのようなタグ[3]またはITRAC [4]は差定量化のための二つの文化にラベルを付けるためにポスト抽出を使用することができます。目的。 分別のために最も一般的な方法は、SDS PAGE [5、6]、SCXクロマトグラフィー[7]、及びHILICベースのクロマトグラフィー[1、2]によってゲル分画です。我々は、それがグラデーションの終わりまで、ペプチドを保持するため、HILICを選んだのではなくSCXのように、勾配の前方に溶出するが、他のグループは他の方法との良好な成功を収めている。 IMACを使用する際には、洗浄の使用する樹脂の量、インキュベーションの時間あるいは数を増減する...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Arginine-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-Lysine-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 7.4 (10X) 液</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFAST プロテアーゼ阻害剤タブレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt ホスファターゼ阻害剤カクテル</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Retsch PM100 ボールミル グラインダー</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Retsch 125 ml ステンレス製粉砕ジャー</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrospin C18 カラム</td><td>The Nest Group</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm 分析カラム</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>これはHILICクロマトグラフカラムです。</td></tr><tr><td>ガードカラム 4.6 mm ID x1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>HILICカラムの寿命を延ばすために、このガードカラムを推奨します。</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; 鉄アフィニティーゲル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>これはIMAC樹脂です。分注して保存してください。</td></tr></tbody></table>

脂肪酸の定量的なphosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

このプロトコルは、同位体の重鎖および軽S.セレビシエ細胞の脂肪酸のオレイン酸、で、成長し、刺激を説明します。細胞は、ボールミルの粉砕機と尿素の可溶化により溶液に持ち込まれた結果grindateで冷凍融解の手順を使用して接地している。この手順では、リン酸化を維持し、細胞溶解中にリン酸化プロテオームの方向転換を防止する、代謝的に不活性状態で細胞の溶解が可能になります。還元、アルキル化、タンパク質のトリプシン消化後、サンプルをC18カラムと親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）を使用して分別削減サンプルの複雑さに脱塩されています。 HILICカラムには、優先的によくphosphoproteomicsに適した親水性の分子を保持する。リン酸化ペプチドは非リン酸化されたものよりクロマトグラフプロファイルは、後で溶出する傾向がある。分別した後、リン酸化ペプチドはリン酸化ペプチド濃縮用電荷ベースの親和性に依存している固定化金属クロマトグラフィーを、使用して濃縮される。この手順の最後にあるサンプルは、定量的質量分析法により分析する準備が整いました。

冷凍融解、尿素solubilziation、HILIC分画とリン酸化ペプチドのIMAC濃縮を用いた定量的リン酸化の手順の説明。

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

本プロトコルでは、同位体標識した重いS. cerevisiae細胞および軽いS. cerevisiae細胞の培養と、脂肪酸であるオレイン酸による刺激について述べる。細胞を粉砕し...

リン酸化は、タンパク質の局在からDNA転写に至るまでのプロセスを制御する重要な細胞シグナル伝達機構であり、質量分析法を用いてリン酸化のみを解析することは、シグナル伝達およびプロテオミクスの両研究における刺激的な新展開です。異なるラベルで標識した細胞をボールミルグラインダーで溶解し、続いて還元、アルキル化、混合、および消化を行います。消化したペプチドを親水性相互作用クロマトグラフィーで分画し、各分画からiMac濃縮法によってリン酸化ペプチドを濃縮します。リン酸化ペプチド濃縮分画を質量分析（MS）により同定します。こんにちは。Institute Persistence BiologyのEグループのRamsey Celineです。本日は、代謝標識されたリン酸化ペプチドの抽出手順をご紹介します。当研究室では、ホッサのプロテオームを定量的に研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。この手順は、同位体標識によるライトおよびヘビーの酵母細胞を培養することから始まります。まず、100 mLのリッチ培地に酵母細胞の単一コロニーを接種します。この培養物をOD 600が1.0になるまで一晩培養します。次に、これを種菌として、全アミノ酸を添加し、さらに20 mg/Lの同位体標識物を補充した1 Lの最小培地2本に接種します。通常または同位体標識された重いアルギニンおよびリシンを用いて、1リットルの培養液をOD 600が1.8になるまで18時間培養します。標識同位体を完全に組み込ませるためには、細胞を少なくとも9世代以上分裂させることが極めて重要です。細胞に標識同位体が完全に組み込まれたら、通常アルギニンおよびリシンを含む培地で培養した細胞を遠心分離します。細胞ペレットを得るために、ペレットを滅菌水で洗浄し、同位体標識されていない通常のアルギニンおよびリシンを含むオレイン酸含有培地に移して85分間刺激します。これにより、同位体的に軽度のオレイン酸刺激サンプルが得られます。一方、同位体標識された重いアルギニンおよびリシンを含む培地で培養した別の培養物は、オレイン酸で刺激せず、同位体的に重いグルコース成長参照サンプルとして使用します。1リットルを回収するため、培養液を250ミリリットルの遠心ボトル4本に分配します。遠心分離後、培地を100ミリリットルだけ残して除去し、細胞を再懸濁させて次のチューブに転送することを繰り返し、細胞を1本のチューブに回収します。最後に、単一のチューブに集まった大きなペレットを、4,000 RPMで3分間遠心分離します。培地を除去した後、遠心ボトルとペレットの重量を、空の遠心ボトルの重量と比較します。遠心分離後、培地を除去し、ボトル内の過剰な液体を吸引します。ペレットを計量し、標準的な収量は1〜2gとなります。次に、ペレットを液体窒素で急冷し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む研磨バッファーをペレットに加えます。添加する研削バッファーの量は、ペレットの重量と同等にする必要があります。研削容器を液体窒素で冷却してください。液体窒素の沸騰が止まったら、スパチュラを用いてペレットを削り取り、凍結させたボールベアリングが入った粉砕容器に移します。600 RPMで、1分間の22回サイクルと方向反転を組み合わせて3分間ペレットを粉砕します。粉砕容器を液体窒素で再度凍結させます。粉砕をさらに4回繰り返し、合計15分間行います。両方のサンプルの粉砕が完了した時点での粉砕時間を記録します。凍結粉砕物を50 milliliterのファルコンチューブに回収し、液体窒素またはドライアイスで凍結保存します。粉砕した日付を記録し、使用するまで-80°Cで保存します。ペプチドの単離および分画は、まずアルキル化から行います。最初のステップは、尿素溶液でサンプルを可溶化させることです。凍結した各粉砕試料1量に対し、3量の尿素バッファーを加えて溶解させます。例えば、1 gのペレットに3 mLのRIAバッファーを加えます。1 mLのPBSバッファーを用いて行います。直ちにプローブを用いて混合物をソニケーションします。チップソニケーションを行ってください。溶液が泡立つのを防ぐため、チップをチューブの底付近に保持します。粉砕した組織は直ちに溶液に投入してください。6,000 RPMで5分間遠心分離し、ライセートを清澄化します。4 °Cにて、上清を新しいチューブに移します。還元反応を開始するために、調製直後の0.5 molar Tris、2-carboxyl LITAL PHOSPHINEまたはTCEPを、1:100の希釈率で各サンプルに添加します。TCEPの最終濃度を5 millimolarにするため、サンプルを37 °Cで1時間インキュベートします。37 °Cでのインキュベーション後、サンプルを室温まで冷却させます。次に、調製したばかりの1 M iodoacetamideを最終濃度が20 mMになるように加え、室温の暗所で1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、20 mM DTTでiodoacetamideをクエンチします。そのまま室温で1時間放置します。還元およびアルキル化された溶解物は、これでトリプシン消化の準備が整いました。この時点で、溶解物のサンプルを用いて、タンパク質定量やSDS-PAGE解析を行い細胞溶解を確認したり、質量分析を行い重同位体の取り込みを検証したりすることができます。トリプシン消化を開始するために、同等量の重同位体サンプルと軽同位体サンプルを混合します。サンプルを20% methanolで4倍に希釈し、trypsinを200倍に希釈して添加します。サンプルを37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、SDS pageおよびCoomassie染色で完全に消化されていることを確認した後、speed vacを用いてサンプルを乾燥させます。ろ過蒸留水を200 µL加え、ペレットが溶解するまでボルテックスします。スピードバキュームでサンプルを乾燥させ、再び蒸留水で再懸濁します。サンプルの乾燥後、再度ペレットを0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）で再懸濁し、必要に応じてpH試験紙を用いてpHが3付近であることを確認します。10% TFAで酸性化し、沈殿物を遠心分離でペレット化します。トリプシン消化したサンプルを、Waters社製VAC 500 mg C18カラムを用いて脱塩します。まず、5 mLの100%アセトニトリルを用いてカラムを親水化させ、約200 ×g、またはカラムを透過させるために必要な最小回転数で遠心分離します。次に、5 mLの0.1% TFAでカラムを平衡化し、サンプルをロードします。カラムに過負荷をかけないように注意し、必要に応じてサンプルを複数のカラムに分けて分注してください。流出液を廃棄容器に回収し、必要であれば再度カラムにロードし、5 mLの0.1% TFAで洗浄します。この洗浄を繰り返し、2 mLの60% アセトニトリル 0.1% TFAで溶出させます。EEUは遠心分離によって回収する必要があります。サンプルをスピードバク（迅速真空濃縮機）で乾燥させ、乾燥したサンプルを200 µLの溶媒Bで再懸濁します。これで、再懸濁したサンプルのペプチド分画準備が完了しました。ガードカラムを備えたTSK gel AMIDE 80分析カラムを用いて、ペプチドを分画します。各ステップを慎重に行ってください。溶媒Aを90%の条件で2時間カラムを流し、その後、サンプルをロードする前にブランクグラジエントを2回行います。このサイズのカラムでは、現代的な液体クロマトグラフィーであっても、それほど新しくない装置であっても、通常1回あたり5mg以上のサンプルはロードしません。装置を使用することで、サンプルの自動注入、分画回収、流量制御、およびグラジエント混合が可能になります。これらは、説明通りにランの開始時に設定します。20分かけて90%Aをロードし、5分かけて90%Aから85%Aへ、40分かけて85%Aから60%Aへ、5分かけて60%Aから0%Aへ、そして5分かけて0%Aから90%Aへと変更します。流速を1 mL/minに設定し、2分間隔で分画を回収します。85%Aから60%Aのグラジエントから開始し、分画を統合して分画数を10に減らします。分画数を増やせば、リン酸化プロテオームのより広範なカバー率が得られる可能性があります。リン酸化ペプチドは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって濃縮されます。iMAC樹脂には、Phos Select Iron Affinity Gelを使用します。まず、ペレットを500 µLのロード溶液で懸濁させます。次に、各分画に50%スラリーを15 µL加え、エンドオーバーエンド回転させながら30分間インキュベートします。分析用にフローを保持してください。サンプルをロード溶液で3回洗浄し、その後500 µLのろ過蒸留水で1回洗浄します。続いて、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液400 µLを用いて、ペプチドを2〜3分間溶出させます。溶出したペプチドをガラスバイアルに移します。100%ギ酸5 µLをペプチドに加え、pH 3に酸性化させます。リン酸化ペプチドを0.1% TFA 200 µLで再懸濁し、前述の手法に従いC 18カラムで再度脱塩します。溶出したサンプルをスピードバックで乾燥させます。最後に、リン酸化ペプチドを20 µLの0.1%ギ酸に再懸濁します。これで、質量分析による定量分析が可能なサンプルが完成しました。ここでは、H-I-L-I-Cクロマトグラフィーを用いた全細胞ペプチドの分画によるクロマトグラムを示します。このトレースから、ホスホペプチドは溶出プロファイル全体で見られる一方で、リン酸化残基の大部分は溶出プロファイルの終盤近くまで保持されていることが分かります。ここでは、細胞の破砕、タンパク質の消化、ペプチドの分画、そして固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いたホスホペプチドの濃縮方法について説明しました。この手順を行う際は、リン酸化状態を維持することと、各溶液のpHを確認することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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生物学

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