Name: アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ蛍光ベースの腫瘍浸潤アッセイ法。Matrigel被覆インサートを用いて細胞の浸潤能を測定し、HT1080細胞とNIH3T3細胞を比較することで、がん研究における細胞浸潤のメカニズムを解析する手法を解説します。

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ポストラベリングとBDカルセインAM蛍光色素を用いて測定彼らがBDマトリゲルマトリックスを介して侵入し、BDフルオロブロックメンブレンを通過した後の細胞を定量にラベルが付いています。その結果、細胞浸潤の唯一のエンドポイントの測定を得ることができる。 <ol><li> 〜80％コンフルエントに細胞を成長させる。 </li><li>インサートシステムを準備し、再水和する。 <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> -20℃の保管からパッケージを削除し、それが室温に来ることができます。 </li><li>箔のパッケージを開き、挿入井戸の内部に500μL温かい（37℃）のメディアを追加します。プレートは37℃で2時間再水和することを許可° C、5％CO 2を 。 注 ：これは、細胞遊走のコントロールとして使用されるコーティングされていないBDファルコンフルオロブロック24マルチウェルインサートシステムを再水和するために必要ではない。 </li><li>再水和した後、慎重にメンブレン上にBDマトリゲルマトリックスの層を乱すことなく挿入ウェルから培地を取り除く。システムが使用できるようになりました。 </li></ol></li><li>細胞単層をトリプシン処理し、5 × 10 4細胞/ mLで無血清DMEMで細胞を再懸濁することにより細胞懸濁液を準備します。 注 ：異なる細胞タイプを使用している場合に、最適な播種密度を決定する必要があります。多孔質の成長表面上の細胞のタイプに最適な播種密度を決定するために、播種密度の範囲を（細胞/ cm 2）を使用して、ブラケットの非多孔質表面に使用される播種密度（すなわちフラスコ、ディッシュ、プレート）。たとえば、間に種々の細胞の濃度で2.5 × 10 5細胞/ cm 2、シードでは、現在シード5 × 10 4と5 × 10 5細胞/ cm 2、最適な初期播種密度を決定する。 </li><li>頂端チャンバーに細胞懸濁液の500μL（2.5 × 10 4細胞）を追加します。 </li><li>アクセスのためのサンプルポートを使用して、基底チャンバーのそれぞれに走化性因子の750μL（DMEMで5％FBS）を追加します。 </li><li> BDのアンジオジェネシスの腫瘍浸潤のシステムと非塗工BDファルコンフルオロブロック37℃、5％CO 2雰囲気で20〜22時間、24マルチウェルインサートプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、慎重に根尖チャンバーから培地を取り除く。これは、廃棄用容器に内容をフリックすることで実現できます。インサートシステムの底面に触れないでください。 </li><li> 500μL/ウェル、4μg/ mLのカルセインHBSSでAMを含む第二の24ウェルプレートへの挿入システムを転送します。 37℃で1時間インキュベート° C、5％CO 2。それは細胞質エステラーゼにより緑色蛍光カルセインに変換される蛍光性生体染色色素であるため、カルセインAM溶液が蛍光を読み取る前に、下室から削除されません。 </li><li>浸潤細胞の蛍光は、ボトム読み蛍光プレートリーダーで517分の494 nmの（EX / EM）の波長で読み取られます。ゲイン設定は、経験的に決定する必要があるかもしれませんが、中間点のゲインは十分な出発点でなければなりません。高すぎるゲイン設定は、高い蛍光試料と検出器の飽和につながる可能性がありますが、これは意味のある結果の取得を防ぐことができます。 autogain（あなたの読者にサポートされている場合）の使用は推奨されません。倒立蛍光顕微鏡は、結果を検証するために使用することができますが、この度は、このアッセイを初めて実行した操作を行うために特に便利です。 注 ：これは、挿入システムが正しいプレートのマップを使用して読み込まれることは重要である。載荷板のマップの詳細についてはwww.bdbiosciences.comまたは接触BDテクニカルサポート（labware@bd.com）でBDの技術告示第436参照してください。プレートをリーダーに挿入されるように適切な板の向きが右に向き左上隅とBD小瓶のロゴでもA1となります。 </li></ol>データの削減データは次式のように表される。 <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="式" /> 背景は、パーセントの細胞の浸潤の計算の前に減算されることがあります RFU =相対蛍光ユニット。

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するBD Biosciences社の従業員です。

<table><tbody><tr><td>BD BioCoat Tumor Invasion System</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 または 354166</td><td></td></tr><tr><td>HT-1080 および NIH/3T3 細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM; 無血清)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (カルシウムおよびマグネシウム不含 DPBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞遊走コントロールとして使用する BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 または 351158</td><td></td></tr><tr><td>5% 胎児牛血清含有 DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Calcein AM 蛍光染料</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 または 354217</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞浸潤後の標識用 BD Falcon 24ウェルプレート</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>底面読み取り機能付き蛍光プレートリーダー</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アン試験管内でフルオロブロックの腫瘍の浸潤アッセイ

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

転移性細胞の特徴は、基底膜を介して侵入し、体の他の部分に移行する能力です。細胞は、浸潤性であるためには基底膜を分解するだけでなく、移行の両方を分泌するプロテアーゼにできなければなりません。 BDアンジオジェネシスの腫瘍浸潤のシステムは、彼らの侵入特性の評価を可能にする条件下で細胞を提供する<em&gt; in vitroで</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;。それは一様にBDマトリゲルマトリックスで被覆された8.0ミクロンの細孔サイズのPETメンブレンのBDファルコンフルオロブロック24マルチウェルインサートプレートで構成されています。 BDマトリゲルマトリックスのこの均一な層は、再構成基底膜として機能<em&gt; in vitroで</em侵略を勉強するための適切なタンパク質の構造を提示しながら&gt;非浸潤細胞に真のバリアを提供する。コー​​ティングプロセスは、膜を介して移行するから非浸潤細胞をブロックし、膜の細孔を吸蔵。対照的に、浸潤細胞から自分自身を切り離し、被覆膜を介して移行することができます。細胞浸潤の定量は、このようなDiICなどの蛍光色素との事前または事後細胞浸潤のラベルのいずれかによって達成することができます。<sub&gt; 12</sub&gt;（3）またはカルセインは、それぞれ、AM、および浸潤細胞の蛍光を測定する。 BDフルオロブロックメンブレンは効果的に&gt; 99％の効率で490から700 nmまでの光の通過を遮断するので、蛍光標識した浸潤していない細胞は下の読書蛍光プレートリーダーで検出されていません。しかし、膜の底面に浸潤している細胞は、光源から遮蔽されなくなりましたし、それぞれのプレートリーダーで検出されています。このビデオでは、カルセインが侵入した細胞を検出するために回答を使用して、エンドポイントの細胞浸潤アッセイを示しています。

このビデオでは、蛍光ベースの方法論を用いて細胞培養用インサートを介して細胞の浸潤を測定する方法を示しています。

転移細胞の特徴は、基底膜を侵入し、体の他の部位へと遊走する能力にあります。細胞は、…できる必要があります。

細胞浸潤は、がんの進行および血管新生において重要なステップです。in vitroの浸潤アッセイでは通常、BDマトリックスやゲルマトリックスなどの再構成基底膜を分解し、セルカルチャーインサートを通過して遊走する細胞の能力を評価します。腫瘍浸潤アッセイは、matrigelをコーティングしたFluor blockインサートに細胞を添加することから開始します。再構成基底膜化学誘引物質を基底室に加え、システムをインキュベートします。一晩経つと、浸潤細胞がMatrigelバリアを分解し、周囲の光からFluorを保護する特殊膜であるFloraブロック膜を通過できるようになります。頂端室の内容物を廃棄し、マルチウェルインサートをFluorを含む2枚目のプレートに加えます。インキュベーション後、生存細胞が染色され、視覚的およびマイクロプレートリーダーの両方で検出可能になります。こんにちは、BD Biosciences Discovery LabWareのJeff Partridgeです。本日は、フローブロック腫瘍浸潤アッセイの手順をご紹介します。この手順を用いて、化学誘引物質に向かう基底膜を介した腫瘍細胞の浸潤を研究します。それでは、始めていきましょう。腫瘍浸潤アッセイに使用する細胞を、コンフルエンスが約80%になるまで培養します。本実験では、HT 10 80およびNIH 3T3細胞株を使用します。HT 10 80細胞は、本システムにおいてMatrigelバリアを遊走および浸潤することが証明されており、本アッセイの陽性対照として適しています。NIH 3T3細胞は浸潤性はありませんが遊走はするため、本手順の陰性対照として適しています。まず、-20 °Cで保存されていたBD bio coat腫瘍浸潤システムパッケージを取り出し、室温に戻してシステムを再水和させます。このアッセイでは無菌操作が必要なため、インサートは組織培養フード内で室温に戻してください。パッケージが室温になったら、開封して、目的の細胞が通過する基底膜を再水和させます。インサートウェルの内部に加温した培地を500 µL加え、37 °C、5% CO₂条件下で2時間再水和させます。コーティングされていないBD Falcon Flora Block 24マルチウェルインサートプレートは、浸潤アッセイ用の細胞準備における細胞遊走コントロールとして使用するため、再水和させる必要はありません。トリプシンを用いて細胞単層を剥離し、血清不含DMEMで5×10⁴ cells/mLの濃度で細胞を再懸濁します。異なる細胞種を使用する場合は、最適な播種密度を経験的に決定する必要があります。コーティング済みプレートを再水和させた後、メンブレン上のMAゲルの層を乱さないように、インサートウェルから培地を慎重に取り除きます。これでシステムの準備が完了しました。MAゲルの層を乾燥させないようにしてください。細胞浸潤アッセイを開始するために、Matrigelコートありとコートなしの両方の構成の腫瘍浸潤システムの頂端チャンバーに、各細胞懸濁液を500 µLずつ加えます。次に、サンプルポートから、コートありとコートなしの両方のプレートの基底チャンバーに、化学走趨物質を750 µL加えます。基底チャンバーを満たす際、気泡が混入しないようにすることが非常に重要です。遊走コントロールとして、各細胞懸濁液および化学誘引物質を、コーティングしていないBD Falcon Flora Block 24 Multi WA インサートプレートに添加します。腫瘍浸潤システムおよびコーティングしていない Falcon Flora Block 24 Multi WA インサートプレートを、翌日まで37 °C、5% 二酸化炭素雰囲気下で 20 から 22 時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、細胞を蛍光染料のcalcium amでラベルする準備が整います。アピカルチャンバーの培地を廃棄容器に弾き出すようにして、注意深く取り除きます。その後、すぐにインサートシステムを、1ウェルあたり500 µLの4 µg/mL溶液が入った2枚目の24ウェルプレートに移します。ハンクス平衡塩溶液中のCalcium am。これらの手順を遊走コントロールでも繰り返します。プレートを37°C、5% carbon dioxideで1時間インキュベートします。インサートシステムの底面に触れないでください。カルシウム存在下で1時間インキュベートした後、侵入した細胞の蛍光を測定できます。インサートシステムを正しいプレートマップに基づいて読み取ることが極めて重要です。プレートの正しい向きは、ウェルA1が左上隅に位置し、BD Falconのロゴが右側に来るようにしてリーダーに挿入します。底面読み取り方式の蛍光プレートリーダーを用い、波長494および517 nmで蛍光を測定します。プレートリーダーのデータが視覚的な結果と一致しているかを確認するため、倒立蛍光顕微鏡で結果を検証してください。これらは、HT 10 80およびNIH 3T3の2つの細胞株を用いた細胞浸潤アッセイから得られた、コート済みプレートおよび未コートのコントロールプレートの典型的なプレートリーダーデータです。細胞を含まないウェルのデータは背景（バックグラウンド）を表しており、細胞浸潤率を算出する前にこれを差し引くことができます。浸潤率は以下の式を用いて算出してください。浸潤率は、化学誘引物質に向かってMatrigelコーティング膜を通過した細胞の平均相対蛍光単位（rfu）に等しくなります。これを、化学誘引物質に向かってコートなしのVD fluaブロックメンブレンを透過して遊走した細胞の平均RFUで除します。次に、この値に100を乗じます。このグラフは、HT 10 80細胞とNIH 3T3細胞の細胞浸潤率の比較を示しており、見ての通り、HT 10 80細胞は浸潤性を示しますが、NIH 3T3細胞は浸潤性を示しません。倒立蛍光顕微鏡で細胞を確認すると、プレートリーダーから得られた結果と一致することがわかります。浸潤性のHT 10 80細胞は、Matrigelを浸潤し、さらにコーティングされていないメンブレンを遊走しました。対照的に、非浸潤性のNIH 3T3細胞は、Matrigelを浸潤しませんでしたが、コーティングされていないメンブレンは遊走しました。フローラルブロック腫瘍浸潤アッセイの実施方法について説明しました。この手順を行う際は、プレートを水平に保ち、気泡の発生を最小限に抑えることが重要です。気泡は結果に影響を及ぼす可能性があります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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