Name: 補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学ぶ 補体枯渇法によるT細胞の高純度分離技術。モノクローナル抗体とウサギ補体を用いて標的細胞を95〜100%除去し、フローサイトメトリーで純度を確認する迅速かつ効率的な免疫細胞精製法です。

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私は図1のデータを提供するためSreemanti Basuさんに感謝します。この作品は、NIHの助成金AI069358とBloodCenter研究財団によって部分的にサポートされていました。

A.ウサギの補数<ol><li>株式のウサギの補数は、室温で解凍し、0.5および/または1ミリリットルボリュームに等分し、℃で長期保存のための-20-80で凍結保存してください。 </li><li>補体の各ロットは、最適な作業濃度を決定するために滴定する必要があります。一般的に、1:10-1:20の希釈が最適です。 </li><li>ウサギ補体は常に細胞の最終用途に応じて、販売前に滅菌済みされていない分注し、凍結または細胞に添加する前にするとき、補体を滅菌したフィルタリングする必要があります。 </li></ol> B.抗体の選択<ol><li>すべての抗体はこのように抗体が最初に活性についてテストされる必要があります、補体活性で有効である。 </li><li>マウスとラットモノクローナル抗体の両方は、補体活性化に効果的です。 </li><li> IgM抗体はIgGに続く補体による細胞溶解に使用するため、一般的に最も効率的です。最高の補体活性化のためのIgGアイソタイプは、種によって異なります。 </li><li>各抗体は、10 7細胞/ mlの細胞密度での最適な使用のために滴定する必要があります。 </li></ol> C.基本的なプロトコル<ol><li>熱不活性化FCSを含む培地中で× 10 7細胞/ ml 5に開始する細胞集団を調整します。細胞の最終容量は倍の起​​動ボリュームになります。枯渇が定量化できるように、いくつかのセルを保存することを忘れないでください。 </li><li>各抗体は、適切な所定の濃度または希釈で細胞懸濁液に追加する必要があります。よく反転により細胞を混ぜる。 </li><li>必要な補体の量を計算します。室温で補数の株式を解凍。補数が滅菌されていない場合、それは低タンパク結合シリンジチップフィルターを使用して滅菌する。注射器に、補体を添加する前に培地のいくつかのmlを追加し、細胞と抗体を含むチューブに直接フィルタを適用。 </li><li>細胞が1 × 10 7細胞/ mlになるようにチューブの最終容量を調整します。 </li><li> 15分ごとに混合、一時間、37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>細胞を遠心し上清を捨てる。 </li><li>培地で2回洗浄してください。細胞残渣は、ポリスチレンチューブの側に残ることでしょう。死んだ細胞や残骸はセルストレーナーまたは密度勾配遠心分離によってこれを除去することができます。 </li><li>枯渇する前と後の利益の細胞集団を比較することにより、細胞の純度を確認してください。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学、細胞の純度を決定する二つの良い方法です。 </li></ol>代表的な結果補体の活性化において非常に効率的なモノクローナル抗体を使用する場合は、1回のラウンド後の細胞の枯渇は、95％以上です。これは、我々はフローサイトメトリーによるTCRβの発現（eBioscience社、サンディエゴ、CA）によって検出されたとして、32.2％αβT細胞から成るマウス脾細胞の使用を開始図1に示します。我々は、mAb THY1のための特定の、すべてのT細胞により発現されたタンパク質が、他の白血球を用いてT細胞を枯渇。我々が使用される抗体はY - 19ラットIgG2c 2であった。記載された手順に続いて、TCRβ人口は1.56％、95％以上の削減に減少した。 <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。補体活性化によるTHY1 +脾臓T細胞の枯渇。合計マウス脾細胞は、赤血球の脾臓と溶解の均質化により得られた。アンチTHY1し、所定の濃度で赤ちゃんウサギ補体は、最終細胞濃度が1 × 10 7細胞/ mlとなるように脾細胞の単細胞懸濁液に添加した。 37℃で1時間Cのためのインキュベーション後、細胞を2回洗浄し、細胞の生存率をトリパンブルー排除により評価。枯渇の効率は、TCRβ+枯渇する前にセル（左パネル）と枯渇後（右パネル）の割合を比較するフローサイトメトリーによって評価した。水平バーは、陽性染色を示し、バー上の数字は、正のパーセントです。

<ol><li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , Current Biology Limited; Garland Pub. Inc. London; San Francisco; New York. (1994).</li>
<li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li>
</ol>

細胞集団の精製は、その機能の研究に必要な一般的な手順です。ここでは、抗原特異的抗体と補体の枯渇を使用して細胞集団を枯渇の迅速かつ効果的な方法を説明します。補体活性化抗体は、系統特異的なマーカーに利用できれば、どのような細胞集団の枯渇を達成することができます。ここでは、THY1のためのモノクローナル抗体特異的、本質的にすべてのT細胞集団で発現させたタンパク質を用いてT細胞の枯渇を示した。我々は、αβT細胞の95％以上が枯渇し、残りの脾細胞は、68％から98％に増加した。細胞の純度のこのレベルは、FACSおよび磁気ビーズ分離を含む他の精製戦略と似ています。補体の枯渇は、出発細胞集団が得られれば1.5時間で実行できる高速な手法です。補数の枯渇の別の利点は、高価な装置や試薬を必要としないための検査では、テクニックを実行できることです。必要な機器の唯一の主要な部分は、水浴及び遠心分離機です。ウサギの補数は、妥当なコストで、さまざまなベンダーから購入することができます（試薬の表を参照）、多くのmAbをATTCから購入し、コストを制御するために局所的に成長させることができる。対照的に、FACSは6図と高価な蛍光標識モノクローナル抗体で費用がかかります細胞選別能力を持つフローサイトメーターを必要とします。磁気ビーズの分離は、手頃な価格ですが、コストがかかります磁石と磁性ビーズ、購入する必要があります。さらに、いくつかの磁気ビーズ分離戦略はまた、カラムの購入が必要です。 細胞枯渇のための補数を使用することに主な障害とは、必要な抗原特異性と抗体の活性化補体の可用性です。ヒト、マウスやラットの抗体はすべての補数を修正する能力を持っていますが、いくつかのアイソタイプは、他よりも優れています。すべての3つの種からのIgMは補体を固定で非常に効果的であるが、IgGアイソタイプは変わる。したがって、すべてのモノクローナル抗体は、最初にその有効性を判断するためのパイロット試験で試験されている必要があります。非常に効率的ではない抗体の場合は、補体の枯渇の2ラウンドは、残りの細胞集団の生存能力に影響を与えずに行うことができます。コスト削減として、抗体は、最適な有効性のために滴定する必要があります。さらに、使用される抗体は、精製する必要はありません。ハイブリドーマ上清および腹水の作業と同様に効果的に、精製が困難なIgM抗体の場合に特に便利です。抗体と同様に、補体がパイロットスタディで調べられることが不可欠です。濃度が高すぎるが、非標的細胞集団の生存能力を失うことになります。また、重要なインキュベーション時間は60分を超えていないことです。 我々のプロトコルでは、我々は一緒に抗体や補体を共同でインキュベートする。しかし、細胞は15-30分のための抗体で標識し、前の補数の加算に洗浄することができます。この戦略を使用する場合は、のようなパッチおよびキャッピングまたは受容体の内部でいくつかのタンパク質で発生、細胞表面上の細胞の抗原の消失を防ぐために、氷上で抗体のインキュベーションを実施してください。非常に効率的ですが、他の方法に比べて枯渇を補完するための主な欠点は、正の選択のために使用することができないということです。したがって、細胞の亜集団を得ることが困難である。例えば、それは最高のFACSによって行われる濾胞性B細胞、から辺縁帯B細胞を精製するのは困難です。このような状況では、補体活性化は、ソートされているセルの数を減らすためにT細胞を枯渇させるために使用することができる。この戦略は、ソート時間を減らすことがお金の節約になりますこれと細胞の少ない厳しいだろう。 特定の細胞集団の精製は、一般的な要件であるため、多くの戦略が開発されている。補数の枯渇の戦略の主な利点は、その手頃な価格、技術的なシンプルさと時間の節約です。

<table><tbody><tr><td>3-4週齢ウサギベビー補体</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31061-3</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>各種</td><td>various</td><td>37 &amp;#x00B0;Cに設定したインキュベーターも使用可能です。</td></tr></tbody></table>

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

免疫細胞集団の精製は、しばしば彼らのユニークな機能を研究するために必要です。特に、このようなリアルタイムPCRやマイクロアレイ解析などの分子生物学的なアプローチは、高純度で細胞集団の分離が必要です。一般的に使用される精製戦略は、蛍光活性化細胞選別（FACS）、磁気ビーズ分離および補体枯渇などがあります。 3つの戦略の、補数の枯渇は、高速で安価な、細胞と高い細胞収率で穏やかであるという利点を提供しています。補体系が活性化されると細胞死をもたらす細胞表面に細孔を形成する膜攻撃複合体の形成で最高潮に達するタンパク質分解カスケードを開始する血漿蛋白質の多数で構成されています<sup&gt; 1</sup&gt;。古典経路は、IgMおよびIgG抗体により活性化され、最初の細菌を殺しためのメカニズムとして記述されていた。モノクローナル抗体（mAb）の生成と、補体カスケードは、抗原特異的に任意の細胞集団を溶解するために使用することができます。補体カスケードによる細胞の枯渇は、出発細胞集団への抗原特異的抗体とウサギ補体を固定する補体の添加によって達成される。細胞は37℃で1時間インキュベート℃及び溶解した細胞は、その後、洗浄の2つのラウンドで削除されます。補体結合のための高効率でモノクローナル抗体は、通常、標的細胞集団の95〜100％を使い果たす。標的細胞集団の精製方法に応じて、補体の枯渇は細胞の精製のためか、さらにその後の方法により精製することができる細胞集団を濃縮するのに使用することができます。

効果的に浄化がしばしば必要とされる免疫細胞集団の機能を研究する。補体の枯渇は、高純度と免疫細胞集団を単離するための高速かつ安価な手法です。

免疫細胞集団の特有の機能を研究するためには、しばしばそれらの純化が必要となります。特に、...などの分子生物学的なアプローチでは、

補体除去法は、免疫細胞集団を精製するための迅速かつ効果的で安価な手法です。補体除去は、特定の細胞型を標的とするモノクローナル IgM または IgG 抗体を細胞集団に添加することから始まります。この例では、T細胞を標的として除去します。次に補体系を添加して蛋白分解カスケードを誘発し、T細胞を死滅させます。その後、細胞集団を遠心洗浄およびろ過し、死細胞とデブリを除去します。この補体除去法により、通常、標的細胞集団の95から100%が除去されます。こんにちは、Bonnie Dittleです。私はミルウォーキーにあるウィスコンシン血液センター血液研究施設の研究員です。今日は、特定の細胞集団を迅速かつ安価に除去するための手法である、相補除去法についてご紹介します。私の研究室では、細胞活性化やタンパク質発現解析を含む多くのバイオアッセイに使用するため、この手法を用いて免疫細胞集団を高純度に濃縮しています。それでは、始めていきましょう。実験を開始する前に、ウサギ補体を0.5 mLまたは1 mLずつ分注し、-20°Cまたは-80°Cのフリーザーに保存しておいてください。補体を1/10から1/20の間の最適な希釈倍率に調整してください。本手順で我々が日常的に使用している補体の優れた市販ソースはPereze biologicals社製です。マウスおよびウサギのモノクローナル抗体は一般的に補体活性化に有効ですが、すべての抗体が適しているわけではありません。補体誘導性の細胞溶解には、一般的にIgM抗体が最も効率的です。IgG抗体は2番目に効率が高く、ほとんどのモノクローナル抗体がIgGであるため、一般的に使用されます。各抗体を、経験的に決定された10⁷ cells/mLの細胞密度での最適使用量に合わせてタイトレーションしてください。ほとんどの抗体は0.1〜10 µg/mLの範囲で使用されます。脾臓T細胞の除去には、TH1特異的なモノクローナル抗体を使用します。補体除去を開始するために、細胞を5%熱不活性化胎児牛血清を含む細胞培養培地で希釈し、開始時の細胞密度を2×10⁷ cells/mLにします。例えば、5×10⁷個の細胞を2.5 mLの培地で希釈します。この細胞量（液量）は最終容量の半分であり、したがって除去工程で使用される細胞濃度（1×10⁷ cells/mL）の2倍になります。この時点で、実験終了時に枯渇量を定量できるよう、最大10⁶個の細胞を保存しておきます。また、必要な量の補体を室温で融解します。Pereze Biologicals社のウサギ補体を5×10⁷個の細胞に使用する場合、1/15希釈が適切であることがわかっています。凍結保存されたEloquaは1.5 mLで十分です。次に、適切な量の抗体を細胞懸濁液に加え、混合します。補体を滅菌するために、低タンパク質結合のシリンジチップフィルターを使用してください。シリンジに1〜2 mLの培地を満たします。5×10⁷個の細胞に補体を加える前に、1:15希釈用に340 mLの補体を用意します。次に、細胞と抗体が入ったチューブに補体を直接ろ過して加えます。その後、チューブ内の最終容量を調整し、細胞濃度が1×10⁷ cells/mLになるようにします。次に、細胞をウォーターバスを用いて37 °Cで1時間インキュベートします。15分ごとに緩やかに転倒混和させることを忘れないでください。インキュベーション後、細胞の生存率に影響を与えない速度で遠心分離します。その後、クリーンベンチに戻り、上清を捨てます。次に、10 mLの培地で細胞を2回洗浄します。細胞の破片が集まり、一部がポリスチレンチューブの側面に付着していることに注目してください。最後の洗浄後、細胞を70 µmの滅菌ナイロンセルストレーナーでろ過します。最後に、除去前後の目的細胞集団を比較し、細胞の純度を確認します。実験前の細胞純度を決定するには、サイトメトリーおよび免疫組織化学が好適な手法として用いられます。補体活性化効率の高いモノクローナル抗体を使用する場合、1回目の補体除去で細胞の95%以上が除去されます。例として、マウスの胸腺細胞調製物におけるαβT細胞の割合をフローサイトメトリーで測定したところ、すべてのT細胞に発現し他の白血球には発現しないanti-CD5を用いて補体除去を行った後、αβT細胞は32.2%含まれていることが分かりました。TCRβ集団は95%減少し、最終濃度は1.56%となりました。補体枯渇による抗原特異的抗体を用いた、特定の細胞集団を迅速かつ効果的に除去する方法をご紹介しました。この手順を行う際は、各抗体の有効性を検証し、本実験を開始する前にパイロット実験で補体の量を滴定することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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