2010年2月5日
効果的に浄化がしばしば必要とされる免疫細胞集団の機能を研究する。補体の枯渇は、高純度と免疫細胞集団を単離するための高速かつ安価な手法です。
補体除去法は、免疫細胞集団を精製するための迅速かつ効果的で安価な手法です。補体除去は、特定の細胞型を標的とするモノクローナル IgM または IgG 抗体を細胞集団に添加することから始まります。この例では、T細胞を標的として除去します。
次に補体系を添加して蛋白分解カスケードを誘発し、T細胞を死滅させます。その後、細胞集団を遠心洗浄およびろ過し、死細胞とデブリを除去します。この補体除去法により、通常、標的細胞集団の95から100%が除去されます。
こんにちは、Bonnie Dittleです。私はミルウォーキーにあるウィスコンシン血液センター血液研究施設の研究員です。今日は、特定の細胞集団を迅速かつ安価に除去するための手法である、相補除去法についてご紹介します。
私の研究室では、細胞活性化やタンパク質発現解析を含む多くのバイオアッセイに使用するため、この手法を用いて免疫細胞集団を高純度に濃縮しています。それでは、始めていきましょう。実験を開始する前に、ウサギ補体を0.5 mLまたは1 mLずつ分注し、-20°Cまたは-80°Cのフリーザーに保存しておいてください。
補体を1/10から1/20の間の最適な希釈倍率に調整してください。本手順で我々が日常的に使用している補体の優れた市販ソースはPereze biologicals社製です。マウスおよびウサギのモノクローナル抗体は一般的に補体活性化に有効ですが、すべての抗体が適しているわけではありません。補体誘導性の細胞溶解には、一般的にIgM抗体が最も効率的です。
IgG抗体は2番目に効率が高く、ほとんどのモノクローナル抗体がIgGであるため、一般的に使用されます。各抗体を、経験的に決定された10⁷ cells/mLの細胞密度での最適使用量に合わせてタイトレーションしてください。ほとんどの抗体は0.1〜10 µg/mLの範囲で使用されます。脾臓T細胞の除去には、TH1特異的なモノクローナル抗体を使用します。
補体除去を開始するために、細胞を5%熱不活性化胎児牛血清を含む細胞培養培地で希釈し、開始時の細胞密度を2×10⁷ cells/mLにします。例えば、5×10⁷個の細胞を2.5 mLの培地で希釈します。この細胞量(液量)は最終容量の半分であり、したがって除去工程で使用される細胞濃度(1×10⁷ cells/mL)の2倍になります。
この時点で、実験終了時に枯渇量を定量できるよう、最大10⁶個の細胞を保存しておきます。また、必要な量の補体を室温で融解します。Pereze Biologicals社のウサギ補体を5×10⁷個の細胞に使用する場合、1/15希釈が適切であることがわかっています。凍結保存されたEloquaは1.5 mLで十分です。
次に、適切な量の抗体を細胞懸濁液に加え、混合します。補体を滅菌するために、低タンパク質結合のシリンジチップフィルターを使用してください。シリンジに1〜2 mLの培地を満たします。
5×10⁷個の細胞に補体を加える前に、1:15希釈用に340 mLの補体を用意します。次に、細胞と抗体が入ったチューブに補体を直接ろ過して加えます。その後、チューブ内の最終容量を調整し、細胞濃度が1×10⁷ cells/mLになるようにします。
次に、細胞をウォーターバスを用いて37 °Cで1時間インキュベートします。15分ごとに緩やかに転倒混和させることを忘れないでください。インキュベーション後、細胞の生存率に影響を与えない速度で遠心分離します。
その後、クリーンベンチに戻り、上清を捨てます。次に、10 mLの培地で細胞を2回洗浄します。細胞の破片が集まり、一部がポリスチレンチューブの側面に付着していることに注目してください。
最後の洗浄後、細胞を70 µmの滅菌ナイロンセルストレーナーでろ過します。最後に、除去前後の目的細胞集団を比較し、細胞の純度を確認します。
実験前の細胞純度を決定するには、サイトメトリーおよび免疫組織化学が好適な手法として用いられます。補体活性化効率の高いモノクローナル抗体を使用する場合、1回目の補体除去で細胞の95%以上が除去されます。例として、マウスの胸腺細胞調製物におけるαβT細胞の割合をフローサイトメトリーで測定したところ、すべてのT細胞に発現し他の白血球には発現しないanti-CD5を用いて補体除去を行った後、αβT細胞は32.2%含まれていることが分かりました。TCRβ集団は95%減少し、最終濃度は1.56%となりました。
補体枯渇による抗原特異的抗体を用いた、特定の細胞集団を迅速かつ効果的に除去する方法をご紹介しました。この手順を行う際は、各抗体の有効性を検証し、本実験を開始する前にパイロット実験で補体の量を滴定することを忘れないでください。以上です。
ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。
補体除去法は、免疫細胞集団、特にT細胞を精製するための迅速かつ費用対効果の高い手法です。この方法は、モノクローナル抗体と補体系を利用することで、細胞単離における高い純度を実現します。
補体枯渇法は、特定の免疫細胞集団を分離するための迅速かつ費用対効果が高く、低刺激な手法であり、下流の機能解析やメカニズム研究に不可欠な高純度サンプルの調製を可能にします。この技術は、生物学的ノイズを低減し、ターゲットバリデーションやアッセイ開発におけるデータの信頼性を向上させることで、初期の探索ワークフローを支援します。また、スケールアップが可能で再現性が高いため、企業規模の免疫学研究パイプラインに適しています。
補体除去は、信頼性の高いターゲットバリデーション、アッセイ開発、および免疫調節治療薬の前臨床評価を可能にするサンプル調製ステップとして、研究開発のプロセスに適合します。