マウス腹腔細胞の分離
2010年1月28日
哺乳類の腹腔内には、自然免疫応答のための重要な別の免疫細胞集団が含まれています。効率的な単離法は、これらの細胞の生化学と機能解析のために必要です。ここでは、マウスの腹腔内細胞の単離のための包括的な方法を提供する。
腹腔細胞の単離は、安楽死させたマウスを仰向けに固定することから始まります。腹膜の外皮を切開し、ゆっくりと引き上げて内皮を露出させます。3% FBSを含むPBSを腹腔内に注入し、腹膜を優しくマッサージします。腹腔細胞を含む液体を回収し、氷上の15 mLチューブに移します。
細胞を一度洗浄し、血球計数器でカウントします。こんにちは。ウィスコンシン血液センター血液研究所のDr. Bonの研究室のOjiです。本日は、マウスの腹腔から細胞を単離する手順をご紹介します。
当研究室では、さまざまな表現型解析、生化学的解析、および免疫学的アッセイに用いる細胞を得るために、本手順を使用しています。主に、腹腔B細胞集団に関心を持っています。それでは、始めていきましょう。
腹腔から免疫細胞を分離し始める前に、必要なすべての材料を準備します。まず、氷バケツ、27ゲージ針付きの5 mLシリンジ、25ゲージ針付きの5 mLシリンジ、発泡スチロールブロック、およびマウスを固定するためのピンを用意します。解剖前に、固定ブロックを置くトレー、はさみ、ピンセット、および回収チューブを準備してください。
3%胎児牛血清を含むPBSをあらかじめ冷却しておく。これらおよび回収チューブは、実験を通して氷上に保持する。麻酔投与および適切な安楽死処置の後、マウスに70%エタノールをスプレーし、スチロールブロックまたは解剖パッドの上に仰向けに固定する。ピンセットとハサミを用いて、腹膜の外皮を切開する。
皮膚を優しく引き下げ、腹腔の内壁を露出させます。臓器を穿刺しないよう注意しながら、27ゲージの針を腹腔内にゆっくりと刺入します。氷冷したPBS 5 mLを腹腔内に注入します。
次に、腹膜を優しくマッサージし、細胞が腹膜壁から剥離してPBS溶液中に落下するように促します。その後、25ゲージの針を斜面（ベベル）を上にして装着した5mLシリンジを用意し、針を腹膜内に挿入します。細胞収量を高めるため、可能な限り多くの液体を回収してください。
この操作を行う際は、脂肪組織や他の臓器が針に詰まるのを防ぐため、チップをゆっくりと動かしてください。針を抜き、細胞懸濁液をポリプロピレン製の回収チューブに移します。腹膜の内皮を切開し、体腔内に残っている液体を回収してください。
ピンセットで皮膚を広げながら、プラスチック製の後方ピペットを使用して残りの液体を回収します。最後に、細胞懸濁液を1500 RPMで8分間遠心分離し、上清を捨ててから、5 mLのPBSで細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。
トリパンブルー排除法を用いることで、細胞数を決定できます。通常、未処置のマウスから500万から1000万個の腹腔細胞を単離することが可能です。全細胞集団の50〜60%がB細胞となります。
約40%がマクロファージおよび顆粒球であり、5〜10%がT細胞となります。ここでは、マウスから腹腔細胞を分離する方法を説明しました。この手順を用いる際は、マウスを慎重に安楽死させ、腹腔内の臓器を穿刺しないようにすることで、腹腔細胞集団に含まれる血液量を制限することが重要です。
血液で汚染されたサンプルは必ず廃棄してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしています。
概要
本記事では、免疫応答の研究に不可欠な、マウスからの腹腔細胞の分離に関する詳細な手法を提示します。この手順は、その後の解析に向けて細胞集団の完全性を確保するように設計されています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 生化学
背景
- 腹腔内には、さまざまな種類の免疫細胞が存在します。
- これらの細胞は、自然免疫応答において重要な役割を担っています。
- 機能的および生化学的な研究において、細胞の単離方法は極めて重要です。
- これらの細胞を理解することは、免疫学的研究に寄与します。
研究の目的
- 腹腔細胞を分離するための信頼性の高い手法を提供する。
- マウスにおける免疫細胞集団の研究を容易にする。
- 後続の免疫学的アッセイの精度を向上させる。
使用した手法
- マウスの安楽死および解剖の準備。
- 3% FBSを含むPBSを腹腔内に注入する。
- 腹腔細胞を含む液を回収する。
- 遠心分離を行い、単離した細胞を計数する。
主な結果
- 500万から1,000万個の腹腔細胞を正常に単離した。
- 細胞の50〜60%がB細胞であることを確認した。
- 約40%がマクロファージおよび顆粒球である。
- 細胞の5〜10%がT細胞である。
結論
- この手法は、腹腔から免疫細胞を単離するのに有効です。
- 血液混入を避けるため、慎重な安楽死処置と解剖が極めて重要です。
- 本手順は、さまざまな免疫学的研究に適用可能です。
よくある質問
業界における重要性
腹腔免疫細胞を単離することで、表現型が定義されたB細胞およびマクロファージのサブセットへのアクセスが可能になり、標的の早期段階でのバリデーションが行えます。これにより、機能解析のための再現性のある一次細胞入力を提供でき、創薬パイプラインにおけるメカニズム的なリスク低減を支援します。本手法は、免疫調節薬のスクリーニングに関連する免疫細胞集団を標準化された方法で回収することで、リード化合物同定における予測の信頼性を向上させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：自己免疫疾患および感染症モデルにおける治療仮説の検証のため、B1aおよびB1b細胞サブセットの解析を可能にする。
- 科学的価値：自然免疫応答研究における経路解明のため、ナイーブな組織居住性マクロファージを提供する。
- 運用的価値：ターゲットエンゲージメントスクリーニングに向けた免疫細胞集団の一貫した単離により、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： フローサイトメトリーおよび生化学的アッセイによる表現型解析に向け、検証済みの生物学的システムを調製します。
- 実用的価値： 制御された細胞回収量（マウス1匹あたり5–10 million cells）により、アッセイの標準化と再現性を確保します。
- 実用的価値： B細胞（50–60%）、マクロファージ（40%）、T細胞（5–10%）を定量的に回収することで、信頼性の高い化合物評価を可能にします。
翻訳・前臨床研究
- 科学的価値：自己反応性B1細胞および調節性IL-10産生サブセットを単離することで、疾患に関連するシステムモデリングを支援します。
- 実用的価値：天然IgM分泌B1細胞を単離することで、トランスレーショナルバイオマーカーの整合性を促進します。
- 実用的価値：疾患モデルにおけるメカニズム追究のための一次免疫細胞を提供し、前臨床段階における継続性を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの検証、アッセイの開発、および前臨床のメカニズム研究に用いる一次免疫細胞を提供することで、初期の創薬ワークフローに組み込まれます。
- 探索生物学： 定義されたB細胞およびマクロファージのサブセットを単離することにより、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 標準化された細胞単離および生存可能な免疫細胞集団の回収を通じて、アッセイへの即応性を実現します。
- 分析： ヘモサイトメーターによる計数および生存率除外法を用いて、細胞サブセットの定量的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 自然免疫および調節に関与するB1細胞を単離することで、探索研究を前臨床検証へと結びつけます。
- 組織的な再利用： 免疫学および腫瘍学の探索プログラム全体で活用可能な、免疫細胞調達の再利用可能な能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：表現型が特性評価された免疫サブセットへのアクセスにより、標的バリデーションにおける予測信頼性が向上します。
- 運用的価値：定義された細胞回収量とサブセット分布により、標準化と再現性が確保されます。
- 戦略的価値：免疫調節剤スクリーニングにおけるメカニズムの曖昧さを軽減し、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：機能的アッセイパネル向けの信頼性の高い一次細胞インプットを通じて、リスク調整後の優先順位付けが可能になります。
実施上の検討事項
- 臓器の穿刺や血液混入を防ぐため、マウスの解剖および無菌操作の専門知識が必要である。
- 細胞の処理および計数において、シリンジ、針、遠心分離機、血球計数器などの器具に依存する。
- 一貫性を確保するため、PBS/FBSの調製およびコールドチェーン管理におけるチーム間の標準化が必要である。
- 腹腔内の細胞組成を変化させる疾患モデルに適用する場合、調整上の検討事項が含まれる。
- 血液混入はサンプルの完全性を損なうため、注意深い安楽死および解剖を行う必要があり、それが制限要因となる。
