Name: マウス腹腔細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 学ぶマウス腹腔細胞の分離法。PBS注入と遠心分離で500〜1000万個の免疫細胞を収集し、B細胞やマクロファージの解析に応用できます。免疫学研究に有用です。

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この作品は、NIHの助成金AI069358とBloodCenter研究財団によって部分的にサポートされていました。

<ol><li>プロセスを開始する前に、以下の項目は、収集と準備に注意する必要があります。 <ul><li>アイス</li><li> 27グラムの針で5ミリリットル注射器</li><li> 25グラムの針で5ミリリットル注射器</li><li>発泡スチロールブロックとマウスを取り付けるためのピン</li><li>取り付けブロックを置くことができる上トレイ</li><li>はさみや鉗子</li><li>コレクションチューブ</li><li> 70％エタノール</li><li> PBSで3％ウシ胎児血清（FCS）（前は氷上で冷却して保持） </li></ul></li><li>マウスを安楽死させる、70％エタノールでそれをスプレーし、その背面に発泡スチロールのブロックにマウントします。 </li><li>ハサミとピンセットを使用すると、腹膜の外側の皮膚をカットし、静かに腹腔の内側を覆う内側の肌を露出するために、それを引き戻す。 </li><li> 27グラム針を用いて腹腔内に、氷冷PBS（3％FCSを含む）5 mlを注入する。ない穿刺あらゆる臓器にまで注意して腹膜にゆっくりと針を押し込みます。 </li><li>注入後、軽くPBS溶液に接続されているすべての細胞を取り除くために、腹膜をマッサージ。 </li><li>腹膜の5 mlシリンジに接続されて、25gの針、ベベルを挿入し、脂肪組織や他の臓器で目詰まりを避けるために、静かに針の先端を移動させながら液体を集める。できる限り多くの流体を収集し、シリンジから針を除去した後、氷上に置きチューブに回収細胞懸濁液を入金。 オプション：ステップ4-6を繰り返します。 </li><li>腹膜の内側の皮膚の切開を行うと鉗子で皮膚を押しながらすると空洞から残りの液を収集するためにプラスチック製パスツールピペットを使用してください。 </li><li>ステップで6または7目に見える血液汚染が検出された場合、汚染されたサンプルは破棄されるべきである。 </li><li> 、8分間1500rpmで採取した細胞懸濁液をスピン上清を破棄し、カウントするために必要なメディアまたはPBSで細胞を懸濁します。 </li></ol>チオグリコール酸を得るために代替プロトコルは、マクロファージを誘発した。 このメソッドは、マクロファージのより高い収量を得るために使用されます。 <ol><li> 3％（w / v）の各マウスの腹腔内にブリューチオグリコール酸培地（7）5 mlを注入する。 </li><li> 3-5日を待って、セルのコレクションのために上記のステップ1へ進みます。 </li></ol> nonelicitedアプローチに比べ、約10倍以上のマクロファージを採取することができます。唯一の懸念は、この手順で得られたマクロファージはそれらの生理学的特性のいくつかで異なることです。 代表的な結果： unmanipulatedマウスから、5〜10000000腹腔細胞は、良好なアイソレーションプロトコルで取得できます。すべての生細胞の中で、50〜60％がB細胞である、〜30％のマクロファージと5〜10％は、T細胞（図1）です。 <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。腹膜腔から単離した細胞の表現型。それらは抗マウスTCRβ- FITC、B220 - PE -テキサスレッド、CD11bパシフィックブルー、CD23 - PE - Cy7とCD5 - APCで染色した腹腔細胞の以下の単離。代表的なフローサイトメトリープロットは、BおよびT細胞（）、マクロファージ（B）、B1とB2セル（C）とB1AとB1B細胞（D）の割合を示しています。

<ol><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li>
<li>Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+of+natural+immunoglobulin+M+in+immediate+defense+against+systemic+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection.</a> J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).</li>
<li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li>
<li>Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B1+B+lymphocytes+play+a+critical+role+in+host+protection+against+lymphatic+filarial+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites.</a> J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).</li>
<li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1%2B+%28CD5%29+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline%3A+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li>
<li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly-1+B+%28B-1%29+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li>
<li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica%3A+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li>
<li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+colony-stimulating+factor%2C+CSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).</li>
<li>Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B-1+and+B-2+cells+in+immune+protection+from+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).</li>
<li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li>
<li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li>
</ol>

腹腔細胞の分離は、異なる免疫細胞、主としてマクロファージおよび特定のB細胞サブセットの研究のための重要なテクニックです。これは単純なプロセスですが、関係するいくつかの重要なステップがあります。採取したサンプル中の血液を汚染の存在は純粋な腹腔内の細胞集団を得るために避けるべきである。頚椎脱臼による安楽死は、腹腔内の血液の汚染を避けるために慎重に行う必要があります。あるいはCO 2を使用することができます。さらに、手順の間に適切なケアは、膀胱や腹腔内の他の臓器を穿刺しないように注意してください。注入された流体のほとんどを回復すると、セルの歩留まりに重要です。 この手順は、広く住民の中程度の数字からマクロファージ生物学を研究するために使用され、刺激されていないマクロファージを簡単にマクロファージコロニー刺激因子（8を使用して、in vitroで成熟したマクロファージに骨髄性前駆細胞を分化させる骨の折れる作業とは対照的に、腹腔から得ることができます。 、9）。チオグリコール酸の使用は、マクロファージ（7）の生理学的特性を変えるかもしれませんが、腹腔からマクロファージの収率は、チオグリコール酸誘発法を用いて改善することができます。 B細胞は自然免疫と獲得免疫の両方において重要な役割を担う私たちの免疫システムの重要な部分です。異なるB細胞亜集団の中で、B1細胞は自然免疫、自己免疫と免疫調節に関与するB細胞のユニークなサブセットで構成されています。 B1細胞は主に腹腔内に位置しており、自己補給がありますされています。彼らは、ウイルスと細菌の数に対する保護の最初の行を提供する（10-12）自然IgMの主要生産国の一つです。 B1細胞は、免疫調節に関与する重要なサイトカインであるIL - 10（6）、の主要な源です。いくつかの研究がB1細胞と追求されているが、まだ特別に、その対照的な機能のさらなる評価のために彼らの調節の役割範囲があります。腹腔細胞の単離方法は、B1細胞の機能を研究するユニークな機会を提供します。

<table><tbody><tr><td>チオグリコール酸培地（Brewer改変）</td><td>BD Biosciences</td><td>211716</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス腹腔細胞の分離

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

腹腔、肝臓、脾臓、消化管や他の内臓のほとんどが含まれている哺乳類の膜結合型と液体で満たされた腹腔内、です。それは、マクロファージ、B細胞とT細胞を含む免疫細胞の数を庇護する。腹腔内のナイーブなマクロファージの数が多いの存在は、そのナイーブな組織の常駐マクロファージ（1）のコレクションのための好ましいサイトです。腹膜腔には、理由、従来のB2セルに加えて、B1細胞として知られているユニークな腹腔内に常駐するB細胞のサブセットの存在のB細胞の研究に重要である。 B1細胞はCD11bとCD5の表面発現により区別することができますB1AとB1B細胞に分割されています。 B1細胞は病原体（2-4）の様々な早期保護を提供する自然IgMの重要な源です。これらの細胞は、自然（5）の自己反応性であるが、それらが自己免疫を防ぐために制御される方法はまだ完全には解明されていない。逆に、CD5について<sup&gt; +</sup&gt; B1A細胞はそのIL - 10産生能力（6）のおかげで、いくつかの規制性質を有している。したがって、腹腔内のB1セルのは、その多様な機能とそれらの発展と規制に関連する多く取り組まれていない問題の研究に興味深い細胞集団です。腹腔内居住者の免疫細胞の分離が原因腹腔内部に定義された構造の不足の注意が必要です。我々のプロトコルは、フローサイトメトリーにより、異なる生化学的および免疫学的アッセイのための表現型解析に使用できるマウスの腹膜腔、より現実的な免疫細胞を得るための手順を説明します。

哺乳類の腹腔内には、自然免疫応答のための重要な別の免疫細胞集団が含まれています。効率的な単離法は、これらの細胞の生化学と機能解析のために必要です。ここでは、マウスの腹腔内細胞の単離のための包括的な方法を提供する。

腹腔は、哺乳類の膜に囲まれ液体で満たされた腹部の空洞であり、肝臓、脾臓、および胃腸管の大部分が含まれている。

腹腔細胞の単離は、安楽死させたマウスを仰向けに固定することから始まります。腹膜の外皮を切開し、ゆっくりと引き上げて内皮を露出させます。3% FBSを含むPBSを腹腔内に注入し、腹膜を優しくマッサージします。腹腔細胞を含む液体を回収し、氷上の15 mLチューブに移します。細胞を一度洗浄し、血球計数器でカウントします。こんにちは。ウィスコンシン血液センター血液研究所のDr. Bonの研究室のOjiです。本日は、マウスの腹腔から細胞を単離する手順をご紹介します。当研究室では、さまざまな表現型解析、生化学的解析、および免疫学的アッセイに用いる細胞を得るために、本手順を使用しています。主に、腹腔B細胞集団に関心を持っています。それでは、始めていきましょう。腹腔から免疫細胞を分離し始める前に、必要なすべての材料を準備します。まず、氷バケツ、27ゲージ針付きの5 mLシリンジ、25ゲージ針付きの5 mLシリンジ、発泡スチロールブロック、およびマウスを固定するためのピンを用意します。解剖前に、固定ブロックを置くトレー、はさみ、ピンセット、および回収チューブを準備してください。3%胎児牛血清を含むPBSをあらかじめ冷却しておく。これらおよび回収チューブは、実験を通して氷上に保持する。麻酔投与および適切な安楽死処置の後、マウスに70%エタノールをスプレーし、スチロールブロックまたは解剖パッドの上に仰向けに固定する。ピンセットとハサミを用いて、腹膜の外皮を切開する。皮膚を優しく引き下げ、腹腔の内壁を露出させます。臓器を穿刺しないよう注意しながら、27ゲージの針を腹腔内にゆっくりと刺入します。氷冷したPBS 5 mLを腹腔内に注入します。次に、腹膜を優しくマッサージし、細胞が腹膜壁から剥離してPBS溶液中に落下するように促します。その後、25ゲージの針を斜面（ベベル）を上にして装着した5mLシリンジを用意し、針を腹膜内に挿入します。細胞収量を高めるため、可能な限り多くの液体を回収してください。この操作を行う際は、脂肪組織や他の臓器が針に詰まるのを防ぐため、チップをゆっくりと動かしてください。針を抜き、細胞懸濁液をポリプロピレン製の回収チューブに移します。腹膜の内皮を切開し、体腔内に残っている液体を回収してください。ピンセットで皮膚を広げながら、プラスチック製の後方ピペットを使用して残りの液体を回収します。最後に、細胞懸濁液を1500 RPMで8分間遠心分離し、上清を捨ててから、5 mLのPBSで細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。トリパンブルー排除法を用いることで、細胞数を決定できます。通常、未処置のマウスから500万から1000万個の腹腔細胞を単離することが可能です。全細胞集団の50〜60%がB細胞となります。約40%がマクロファージおよび顆粒球であり、5〜10%がT細胞となります。ここでは、マウスから腹腔細胞を分離する方法を説明しました。この手順を用いる際は、マウスを慎重に安楽死させ、腹腔内の臓器を穿刺しないようにすることで、腹腔細胞集団に含まれる血液量を制限することが重要です。血液で汚染されたサンプルは必ず廃棄してください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしています。

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