染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

はじめに。こんにちは。私たちはブラジルのファジャ連邦大学バイオメトリカル科学研究所です。このビデオでは、起こりうる染色体異常を検出するために、ヒト胚性幹細胞の染色体展開標本を作製します。ヒト胚性幹細胞は安定した核型を維持することが示されていますが、多くの研究において、培養条件によっては、染色体全体または一部の追加などの染色体異常を獲得しやすくなることが報告されています。

HASSのin vitroにおける遺伝的完全性の特性評価は、胚発生研究や薬剤試験における不可欠なツールとして検討されるため、極めて重要です。さらに、将来的な治療法の提案において、染色体変化は発がん性と関連していることが多いことから、深刻な懸念事項となります。それでは、始めていきましょう。

細胞の処理において、本手順ではこれを使用します。8〜9日間、20%の無血清置換物および80〜9 g/mLの線維芽細胞増殖因子を添加したF12培地で培養します。まず、インキュベーターから培養フラスコを取り出し、ラミナーフローフードの下で、最終濃度が0.1 µg/mLになるように添加します。

Colcemidを培地に添加することで、細胞を前中期、休止期、および中期に誘導します。染色体が十分に凝縮し、顕微鏡下でより容易に観察できるようになったら、コンタミネーションを避けるため、必ず無菌操作を行ってください。Colcemidを添加した後、フラスコを保持し、細胞をインキュベーターに戻します。

インキュベーション期間後の細胞の固定についてですが、この時点では細胞はまだ固定できる状態ではありません。無菌条件下で作業する必要はありません。まず、培地を吸引し、完了したらトリプシンを添加してください。

0.05%のDTAをフラスコに加えます。細胞の底面を十分に覆うだけの量を加えるようにしてください。フラスコのキャップを閉め、穏やかに揺らして均一に分散させます。

トリプシンを加え、室温で5分間インキュベートします。室温で5分間インキュベートした後、細胞はフラスコの底面から剥離しているはずです。血清を含む完全培地を加えるか、血清を緩やかに添加することで、トリプシンを不活化させる必要があります。フラスコのキャップを慎重に外し、完全培地または血清を加え、液体が細胞のあるフラスコ底面に広がるようにします。

細胞懸濁液をピペッティングし、細胞を完全に分散させます。細胞を15 mLコニカルチューブに移しますが、その前に細胞が十分に分散しており、目に見える細胞凝集塊が懸濁液に含まれていないことを確認してください。移し替えが完了したら、チューブに蓋をして遠心分離します。

懸濁液を5分間撹拌します。遠心分離後、800 RPMではチューブの底に細胞ペレットが形成されているはずです。細胞ペレットを乱さないように注意してください。

P 1000を用いて、約200 µLが残るまで上清を吸引します。この容量をResusに合わせます。ペレットをResusに懸濁します。

パレットを懸濁させます。チューブを指で数回軽く弾きます。溶液中に細胞の凝集塊が残っていないことを確認し、細胞が十分に懸濁されていることを確かめてください。

この時点で、溶液は濁っているはずです。次に、37°Cに予熱した75 mMの塩化カリウム溶液5 mLを添加します。低張溶液は、チューブを回転させながら、チューブの下方から非常にゆっくりと加えてください。

最初の3mLを添加した後、チューブのキャップをしっかりと丁寧に閉めます。チューブをゆっくりと水平方向に回転させながら、低張液を用いて細胞懸濁液を均質化させます。

同様の手順で、残りの2 mLをゆっくりと加えます。低張液を用いる目的は、細胞体積を増大させて染色体をほどきやすくすることです。したがって、5 mLすべてを加えた後、チューブに蓋をして37 °Cの水槽で15分間インキュベートするこの工程は、良好な染色体展開を得るために不可欠です。

15分間のインキュベーションが完了したら、チューブをウォーターバスから取り出します。固定液から発生する煙は毒性があるため、ここからの操作はドラフトチャンバー内で行ってください。ドラフトチャンバーが利用できない場合は、必ず換気の良い場所で作業してください。

チューブのキャップを取り外し、固定液を3滴加えます。固定液はメタノールと酢酸を3:1の比率で混合したもので、使用当日に調製してください。チューブのキャップをしっかりと閉め、まず時計回りに、次に反時計回りにゆっくりと回転させながら、チューブを静かに水平に動かします。

チューブを800 RPMで5分間、ブレーキをかけずに遠心分離します。遠心分離後の細胞の摩耗による試料の損失を防ぐため、回転をゆっくりと停止させることが非常に重要です。この心細胞は約200で生存します。

ペレットを懸濁させるため、チューブを指で数回軽く叩きます。細胞の凝集塊が残っていないことを確認し、細胞が十分に懸濁されていることを確かめてください。3 mLの固定液をチューブの壁面に沿ってゆっくりと加えます。最初の3 mLを加えた後は、チューブを回転させながら加えてください。

チューブTのキャップをしっかりと締め、チューブを水平に傾けてゆっくりと回転させながら、細胞懸濁液を丁寧にホモジナイズします。必ず1回転以上させてください。この混合プロセスを最大限に高めるには、回数を増やしてください。

細胞を回収するため、チューブ壁に沿って固定液を2 mL加えます。細胞懸濁液を4 °Cで一晩保存します。この固定済み細胞は、固定液中で4 °Cに数ヶ月間保存することが可能です。

翌日に細胞を洗浄し、ブレーキをかけずに800 rpmで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、約200 µLの液体で再懸濁します。チューブを指で数回弾いて、ペレットを懸濁させてください。

細胞が十分に分散し、懸濁液中に目視で確認できる細胞の凝集塊がないことを確認してください。新鮮な固定液 5 mL を、チューブの壁面に沿ってゆっくりと加えます。チューブにキャップをし、チューブをゆっくりと回転させながら、水平方向に優しく回して細胞を均質化します。

固定液は、細胞を保護するだけでなく、脂質を除去し、次いでタンパク質を溶解させることで、染色体の展開を容易にします。チューブを800 RPMで5分間、休止させることなく遠心分離します。スライドの作製において、遠心分離の段階で細胞ペレットを均質化するのに十分な量の溶液を残しておいてください。

液量は細胞数によって異なります。チューブを指で数回軽く弾きます。視覚的に細胞の凝集がないことを確認し、細胞が十分に分散していることを確かめてください。

この時点で、ピペットをスライドガラスの表面に平行に動かし、20から30 µLの細胞懸濁液を清潔で乾燥したスライドガラス上に滴下します。固定液が蒸発すると、表面はすぐに粒状になります。この面を上にして30秒間温水蒸気にさらし、細胞を膨張させます。

これらのスライドを解析します。スライドを準備した後、位相差顕微鏡を用い、10倍および40倍の対物レンズで観察し、細胞密度がさらなる解析に適しているかを確認します。このスライドは、濃度が高すぎる例です。

細胞核が中期分散像に近すぎないように注意してください。細胞密度が高すぎるスライドがある場合は、固定液をさらに加えて細胞懸濁液を希釈してください。このスライドは、適切な細胞密度を示しています。

メタフェーズ（中期）の分散が良好で、個々に独立していることに注意してください。最適な細胞密度のスライドが得られたら、染色し、解析を行います。染色体が見えなくなっていたり、遮られたりしている可能性があるため、核の近くにあるメタフェーズは避けて選択してください。

形態が円形である中期相を探しますが、染色体が中期相から離れていないことを確認し、円形で十分に孤立した中期相を選択してください。次のスライドに示すように、2つ以上の細胞質が重なったことによる染色体数の増加や、染色体が直線状に伸びたことによる染色体数の減少といった、誤ったIESを報告しないようにしてください。

このビデオが今後の実験のお役に立てれば幸いです。ご不明な点がございましたら、お気軽にお問い合わせください。それでは、研究に励んでください。ご健闘をお祈りいたします。