Name: プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぼう、プロテアーゼ蛍光検出キットを用いたプロテアーゼ活性測定法。FITC標識カゼイン基質を使い、蛍光光度計で微量プロテアーゼ汚染を高感度に検出する品質管理手法です。

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準備の手順インキュベーションバッファー、アッセイバッファー、および0.6 N TCAソリューションは、すぐに使えるソリューションとして提供されています。 FITC -カゼイン基質 - それはアリコートに凍結融解の繰り返しを避けるために到着時に小さなボリュームに分割しFITC -カゼイン基質をお勧めします。 FITC -カゼイン基質が凍結融解の繰り返し印加された場合、バックグラウンドでのわずかな増加は、感度を下げ、それによって、発生します。アリコートを-20℃で保存し、光から保護する必要があります。各サンプル、ブランク、またはコントロールの反応では、FITC -カゼイン基質20μlを必要とします。ミキシングや揺れ活発なだけでなく、融解/凍結とFITCは、プロテアーゼの切断のために利用できるように小さい基板を読み、原因と高いバックグラウンドで生じるカゼインから分離することがあります。 フルオレセインイソチオシアネート（FITC）コントロールソリューション- FITC制御は、適切な濃度にアッセイ緩​​衝液で再構成することができます。このソリューションは、新鮮なものと、光から保護する必要があります。 最終的なトリプシンコントロールソリューション - トリプシン、プロテアーゼ制御（商品コードT 6567）のバイアルに1mMのHClの100μlを追加する。トリプシンが溶解されるように簡単に混ぜる。インキュベーションバッファー900μLを加え、よく混ぜる。アッセイに必要に応じて別の方法として、他のバッファを使用することができます。トリプシンの最終的な作業濃度は20μg/μLのです。ときにトリプシンコントロールソリューションを準備する準備ができて、インキュベーションバッファー（9部のバッファに1部の酸性化トリプシン）の正確な量の酸性トリプシン溶液のアリコートを組み合わせる。酸性条件下でトリプシンを保存すると、トリプシンの安定性を高めます。トリプシン制御ソリューションは、温度に敏感であり、低濃度で安定していないです。 これらの準備のソリューションの貯蔵と安定性のためのキットの技術的なセキュリティ情報を確認してください。 手順<ol><li>一度にすべてのコントロール、空白、およびサンプルを調製するのが最も簡単です。各試験サンプルについて、マイクロ遠心チューブにインキュベーションバッファー20μlを、FITC -カゼイン基質液20μl、試験試料の10μlを加える。高いプロテアーゼ活性を有する試験片の場合は、サンプルの希釈が必要な場合があります。 </li><li>マイクロ遠心チューブにインキュベーションバッファー20μlを、FITC -カゼイン基質液20μl、およびコントロールサンプルの10μlを添加することにより、適切なコントロールのサンプル（コントロールサンプルを参照）を準備。 </li><li>マイクロ遠心チューブにインキュベーションバッファー20μlを、FITC -カゼイン基質液20μl、及び超純水10μlを添加してブランクサンプルを準備します。 </li><li>静かに37 60分間暗所で℃で各チューブとインキュベートを混ぜる。過度の乱流が高い蛍光バックグラウンドの原因とアッセイの感度を減少させる可能性があるので、あまりにも積極的に混合しないように注意してください。 注：インキュベーション時間は、感度を上げるために24時間まで延長することができる。高い蛍光バックグラウンドにつながる、FITC -カゼインが低下し始める可能性があるので24時間を超えないように注意してください。 </li><li>インキュベーション後、各微量遠心チューブに0.6 Nトリクロロ酢酸溶液を150μlを加える。 TCAは、非常に腐食性があり、適切な保護具を着用して処理する必要があります。 </li><li>ゆっくりと37℃で混合し、インキュベート℃で30分間、暗所で。 </li><li> 10,000 × gで10分間チューブを遠心上清は、酸可溶性、FITCラベルされた断片が含まれており、蛍光測定に使用されます。 </li></ol>蛍光測定これらのメソッドは、利用可能な計装の要件に応じて上下に拡大または縮小することができます。適切なコントロールのサンプルで作製した標準曲線との比較のために、各試験サンプルの値（FLUtest）からブランクサンプル（FLUblank）の蛍光測定値を引きます。 キュベット<ol><li>ピペット上清10μl（ステップ7）と適切なキュベットにアッセイ緩​​衝液1mlを、穏やかに混合する。注：最大24時間の蛍光を測定する前に、上清およびアッセイ緩​​衝液の溶液は2〜8℃で暗所に保存されていることがあります。 </li><li> 485nmで励起による蛍光強度を記録および535 nmの発光波長を監視する。 </li></ol>マルチウェルプレート<ol><li>上清（ステップ7）と適切なチューブまたはバイアルにアッセイ緩​​衝液1mlを、穏やかに混合注ピペットを10μl：上清およびアッセイ緩​​衝液の溶液を、最大2〜8℃で暗所に保存することができる蛍光を測定する前に24時間まで。 </li><li>黒色96ウェルプレートのウェルに200μlのを転送する。 485nmで励起による蛍光強度を記録および535 nmの発光波長を監視する。 や</li></ol><ol><li>ピペット上清2μlの（ステップ7）とアッセイB200μlの黒色96ウェルプレートのウェルにuffer。注：最大24時間の蛍光を測定する前に、上清およびアッセイ緩​​衝液の溶液は2〜8℃で暗所に保存されていることがあります。 </li><li> 485nmで励起による蛍光強度を記録および535 nmの発光波長を監視する。 </li></ol>コントロールのサンプルトリプシンコントロールソリューションは、アッセイは、検出限界を決定する、または一般的な標準曲線を作成するには、適切に実行していることを確認するために使用することができます。異なる、特定のプロテアーゼのアッセイのために、それは適切なインキュベーションバッファー中で特異的プロテアーゼを含むコントロール溶液を調製することをお勧めします。 アッセイの検出限界は、ブランク試料で得られた値を上回る大幅な蛍光測定値を生成するプロテアーゼの量です。検出限界は、計測機器の感度によって異なります。トリプシンコントロールソリューションの連続希釈を制御ソリューションを生成するために使用されることがあります。 ブランクサンプルで得られた値の120％に等しい読書を有意とされる。日常的に、トリプシンの5 ngの検出限界は、この手順で得られた。それは、少なくとも一つの5 ngのトリプシンのコントロールがそれぞれのアッセイで実行することをお勧めします。の0.5μg/ mlの濃度でトリプシンの制御ソリューションは、アッセイにおけるトリプシンの所望の5 ngのことになります。トリプシンコントロールソリューションの40倍希釈（20μg/ ml）を0.5μg/ mLと制御ソリューション、インキュベーションバッファーの39部にトリプシンコントロールソリューションの、すなわち一部の結果。 <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="図1"> 図1（トリプシン活性の標準曲線）：トリプシンコントロールソリューション（20μg/ mlのは）また、（図1を参照）連続希釈を行うことによって標準曲線を生成するために使用されることがあります。各コントロールのサンプルの蛍光測定値は、各コントロールのサンプル（FLUcontrol）の値からブランク試料の蛍光読書（FLUblank）を差し引くことによって修正されました。 このキットは0.15μg/ mlの（1.5 ng）を、2.5μg/ mlの（25 ng）をするまで、コントロールサンプルを使用して、トリプシン（製品コードT 6567）の典型的な標準曲線。この曲線は、ステップ4の30分のインキュベーション時間を、記載された手順に従って生成されました。蛍光測定は、マルチウェルプレートで行われた。 フルオレセインイソチオシアネートは、可能な測定器の校正（該当する製造者の指示を参照）またはFITC信号の直線性の範囲の決定のためのコントロールとして提供されています。

<ol><li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li>
</ol>

著者はこの記事で使用する試薬やツールを生成するシグマアルドリッチ社の従業員です。

私達はちょうど生物学的試料中のプロテアーゼ活性を検出するためにプロテアーゼ蛍光検出キットを使用して例の分析を示している。このキットは、生理的なアプリケーションで見られるプロテアーゼの多様な範囲を検出するために最適化されています。それはセリン、システイン、メタロ、およびアスパラギン酸プロテアーゼの検出に適していますが、修正がいくつかの特定のプロテアーゼを検出するために必要となる場合があります。

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PF0100%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">プロテアーゼ蛍光検出キット&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H1758%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">塩酸&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr></tbody></table>

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

プロテアーゼ蛍光検出キットは、既製使用するプロテアーゼ活性の存在を検出するための試薬を提供する。プロテアーゼ活性を検出するためにこの簡単なアッセイは、カゼインを基質としてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識使用しています。 プロテアーゼ活性の酸性条件下で沈殿しないより小さい断片にFITC標識カゼイン基質の開裂の結果。プロテアーゼのサンプルと基質のインキュベーション後、反応をトリクロロ酢酸（TCA）の添加により酸性化する。次いで、混合物をペレットと溶液中に残存する小規模な、酸可溶性フラグメントを形成する未消化の基質を用いて遠心分離する。上清を中和され、FITCラベルされた断片の蛍光を測定する。 記載のキットの手順では、約0.5μg/ mlの（トリプシンの5 ngの検定に追加された）の濃度でトリプシンのプロテアーゼ制御を検出します。この感度は、24時間まで、長いインキュベーション時間を増やすことができます。アッセイは、マイクロ遠心チューブ中で実行され、手続きは、キュベットまたはマルチウェルプレートのどちらかを使用して、蛍光検出のために用意されています。

プロテアーゼ蛍光検出キットは、蛍光を用いたプロテアーゼ活性の測定のために設計されています。また、プロテアーゼのコンタミの微量の検出に適しています。メソッドは、FITC標識カゼイン基質の独自の製剤のタンパク質分解hydroysisに基づいています。

プロテアーゼ蛍光検出キットは、プロテアーゼ活性の存在を検出するための調製済み試薬を提供します。この簡便なアッセイを用いて...を検出します。

このプロトコルでは、まずインキュベーションバッファー、FXIカゼイン溶液、および目的のプロテアーゼを含むサンプルをマイクロ遠心チューブに加え、軽く混ぜた後、暗所にて37°Cで60分間インキュベートします。インキュベーション期間の終了時にプロテアーゼ反応を停止させるため、TCA溶液を加え、軽く混ぜて、再び暗所にて37°Cで30分間インキュベートします。このステップにより、未反応の基質が沈殿します。サンプルを10,000 Gsで10分間遠心分離します。酸可溶性の標識FXIフラグメントを含む上清を除去します。上清をV型またはマルチウェルプレートに移し、アッセイバッファーで希釈した後、フルオリメーターでサンプルを測定します。こんにちは。私はミズーリ州セントルイスにあるSigma Aldridge DeKalb施設の研究員のCarrie Cup Vineyardです。本日は、蛍光法によるプロテアーゼ活性測定の手順をご紹介します。当社の品質管理ラボでは、低レベルのプロテアーゼ活性を測定するためにこの手順を用いています。それでは、手順を開始しましょう。この手順では、インキュベーションバッファー、アッセイバッファー、および0.6 Nトリクロロ酢酸（TCA）溶液が、そのまま使用可能な状態で提供されています。Cainと表記された溶液を小分けにし、-20°Cで保存してください。その際、遮光バイアルを使用するか、透明なチューブをアルミホイルで包んで、光から保護するようにしてください。フィコシアニン基質を分注することで、凍結融解サイクルの繰り返しを最小限に抑えることができます。凍結融解サイクルの繰り返しや、フィコシアニンの激しい振とうまたは混合は、フィコシアニンの乖離を招き、バックグラウンドの上昇につながる可能性があります。フルオリメーターの校正またはフィコシアニン信号の直線範囲を決定する場合は、フィコシアニンコントロール溶液を調製してください。アッセイバッファーで適切な濃度に再構成し、溶液を調製して直ちに使用してください。準備が整いましたら、溶液を遮光してください。最後に、凍結乾燥トリプシンのバイアルに100 µLの1 mM塩酸を加え、トリプシンが完全に溶解するように軽く混ぜて、トリプシンプロテアーゼコントロールを調製します。酸性条件下でトリプシンを保存することで、安定性が向上します。Tripsinコントロール溶液は温度に敏感であり、低濃度では不安定であることに注意してください。次に、テストサンプル、コントロール、およびブランクを含む、アッセイで使用するすべてのサンプル調製を開始します。各テストサンプルは遮光して保存してください。マイクロ遠心チューブに、20 µLのインキュベーションバッファー、20 µLのfit c kian基質、および10 µLのテストサンプルを合わせて混合します。サンプルを暗所でインキュベートするのであれば、透明なマイクロ遠心チューブを使用しても構いません。また、プロテアーゼ活性が高いテストサンプルは希釈する必要があることに注意してください。トリプシンコントロールサンプルは、アッセイが適切に機能しているかを確認するためのポジティブコントロールとして、または検出限界の決定や一般的な標準曲線の作成に使用します。トリプシンコントロールを調製するには、酸性化したトリプシン1部に対し、インキュベーションバッファーまたはテストサンプルに使用したバッファー9部を加え、十分に混合します。トリプシンの最終的な作業濃度は20 µg/mLです。異なる特異的プロテアーゼを使用する場合は、そのプロテアーゼと適切なバッファーを用いてコントロール溶液を調製してください。マイクロ遠心チューブに、20 µLのインキュベーションバッファー、20 µLのfz cain基質、および10 µLのトリプシンコントロールを合わせて、コントロールサンプルを調製し続けます。各アッセイにつき、5 ngのトリプシンを用いたコントロールサンプルを少なくとも1回実行するか、または段階希釈法を用いることが推奨されます。最後のサンプルはブランクであり、マイクロ遠心チューブに20 µLのインキュベーションバッファー、20 µLのFitz Caine基質、および10 µLの超純水を合わせて調製します。3種類のサンプルを準備したら、各チューブを穏やかに混ぜ、37°Cの暗所で60分間インキュベートします。過度な撹拌は蛍光バックグラウンドの上昇を招き、アッセイの感度が低下する可能性があるため、激しく混ぜないように注意してください。感度を高めるために最大24時間までインキュベートすることも可能ですが、FXI caseinが分解し始める可能性があるため、それ以上の長時間のインキュベーションは推奨されません。なお、インキュベーション完了時に蛍光バックグラウンドが高くなるため、適切な保護具を着用し、各マイクロ遠心チューブに150 µLのTCA溶液を加えます。TCAでインキュベートすると、チューブ内に白い霧のようなものが観察されますが、これは沈殿した未消化の不溶性カゼインです。軽く混ぜ、37 °Cの暗所で30分間インキュベートします。TCA溶液でのインキュベーション後、室温にて10,000 Gsで10分間、チューブを遠心分離します。上清には、蛍光測定に使用される酸可溶性fite標識Cain断片が含まれています。ペレット中の沈殿物がピペットチップに吸い込まれると、その後の蛍光検出において偽陽性の結果となるため、チューブの上部から慎重にピペットで分注してください。フルオリメーターを用いてプロテアーゼ活性を測定するため、10 µLのTCA上清と1 mLのアッセイバッファーをチューブ内で混合し、穏やかに混ぜ合わせます。加えて、10 µLのFEを1 mLのアッセイバッファーに加えることで、分析用のFE標準液を希釈します。FEコントロールおよびTrypsin標準液は、サンプルが超えてはならない蛍光レベルを示します。TCA上清とアッセイバッファーの混合溶液は、蛍光測定まで2〜8 °Cの暗所で最大24時間保存可能です。キュベットを用いて測定する場合は、溶液1 mLを適切なキュベットに分注してください。大量のサンプルを処理する場合は、96ウェルプレートと蛍光プレートリーダーを使用して蛍光データを得ることができます。本アッセイでは、機器の校正用コントロールとしてフルオレセインイソチオシアネートを使用します。ここでは、上述の手順に従った後のFITC信号の代表的な直線性の範囲を示しています。本キットを用い、最初のインキュベーションステップの時間を30分とした場合、1.5 nanogramsから25 nanogramsの範囲のtrypsinおよびコントロールサンプルにおいて、このような典型的な標準曲線が得られます。蛍光測定はマルチウェルプレートで行われました。本アッセイの検出限界は、ブランクサンプルで得られた値よりも有意に高い蛍光値を生成するプロテアーゼ量として定義されます。本日は、Sigma Aldridgeプロテアーゼ測定キットを用いて、生物学的試料中のフルオロメトリック・プロテアーゼ活性を検出する方法を解説しました。このキットは最適化されていますが、使用するプロテアーゼの種類によっては、わずかな条件変更が必要な場合があることに留意してください。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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