プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

このプロトコルでは、まずインキュベーションバッファー、FXIカゼイン溶液、および目的のプロテアーゼを含むサンプルをマイクロ遠心チューブに加え、軽く混ぜた後、暗所にて37°Cで60分間インキュベートします。インキュベーション期間の終了時にプロテアーゼ反応を停止させるため、TCA溶液を加え、軽く混ぜて、再び暗所にて37°Cで30分間インキュベートします。このステップにより、未反応の基質が沈殿します。

サンプルを10,000 Gsで10分間遠心分離します。酸可溶性の標識FXIフラグメントを含む上清を除去します。上清をV型またはマルチウェルプレートに移し、アッセイバッファーで希釈した後、フルオリメーターでサンプルを測定します。

こんにちは。私はミズーリ州セントルイスにあるSigma Aldridge DeKalb施設の研究員のCarrie Cup Vineyardです。本日は、蛍光法によるプロテアーゼ活性測定の手順をご紹介します。当社の品質管理ラボでは、低レベルのプロテアーゼ活性を測定するためにこの手順を用いています。

それでは、手順を開始しましょう。この手順では、インキュベーションバッファー、アッセイバッファー、および0.6 Nトリクロロ酢酸（TCA）溶液が、そのまま使用可能な状態で提供されています。Cainと表記された溶液を小分けにし、-20°Cで保存してください。その際、遮光バイアルを使用するか、透明なチューブをアルミホイルで包んで、光から保護するようにしてください。

フィコシアニン基質を分注することで、凍結融解サイクルの繰り返しを最小限に抑えることができます。凍結融解サイクルの繰り返しや、フィコシアニンの激しい振とうまたは混合は、フィコシアニンの乖離を招き、バックグラウンドの上昇につながる可能性があります。フルオリメーターの校正またはフィコシアニン信号の直線範囲を決定する場合は、フィコシアニンコントロール溶液を調製してください。アッセイバッファーで適切な濃度に再構成し、溶液を調製して直ちに使用してください。

準備が整いましたら、溶液を遮光してください。最後に、凍結乾燥トリプシンのバイアルに100 µLの1 mM塩酸を加え、トリプシンが完全に溶解するように軽く混ぜて、トリプシンプロテアーゼコントロールを調製します。酸性条件下でトリプシンを保存することで、安定性が向上します。

Tripsinコントロール溶液は温度に敏感であり、低濃度では不安定であることに注意してください。次に、テストサンプル、コントロール、およびブランクを含む、アッセイで使用するすべてのサンプル調製を開始します。各テストサンプルは遮光して保存してください。

マイクロ遠心チューブに、20 µLのインキュベーションバッファー、20 µLのfit c kian基質、および10 µLのテストサンプルを合わせて混合します。サンプルを暗所でインキュベートするのであれば、透明なマイクロ遠心チューブを使用しても構いません。また、プロテアーゼ活性が高いテストサンプルは希釈する必要があることに注意してください。

トリプシンコントロールサンプルは、アッセイが適切に機能しているかを確認するためのポジティブコントロールとして、または検出限界の決定や一般的な標準曲線の作成に使用します。トリプシンコントロールを調製するには、酸性化したトリプシン1部に対し、インキュベーションバッファーまたはテストサンプルに使用したバッファー9部を加え、十分に混合します。トリプシンの最終的な作業濃度は20 µg/mLです。異なる特異的プロテアーゼを使用する場合は、そのプロテアーゼと適切なバッファーを用いてコントロール溶液を調製してください。

マイクロ遠心チューブに、20 µLのインキュベーションバッファー、20 µLのfz cain基質、および10 µLのトリプシンコントロールを合わせて、コントロールサンプルを調製し続けます。各アッセイにつき、5 ngのトリプシンを用いたコントロールサンプルを少なくとも1回実行するか、または段階希釈法を用いることが推奨されます。最後のサンプルはブランクであり、マイクロ遠心チューブに20 µLのインキュベーションバッファー、20 µLのFitz Caine基質、および10 µLの超純水を合わせて調製します。

3種類のサンプルを準備したら、各チューブを穏やかに混ぜ、37°Cの暗所で60分間インキュベートします。過度な撹拌は蛍光バックグラウンドの上昇を招き、アッセイの感度が低下する可能性があるため、激しく混ぜないように注意してください。感度を高めるために最大24時間までインキュベートすることも可能ですが、FXI caseinが分解し始める可能性があるため、それ以上の長時間のインキュベーションは推奨されません。

なお、インキュベーション完了時に蛍光バックグラウンドが高くなるため、適切な保護具を着用し、各マイクロ遠心チューブに150 µLのTCA溶液を加えます。TCAでインキュベートすると、チューブ内に白い霧のようなものが観察されますが、これは沈殿した未消化の不溶性カゼインです。軽く混ぜ、37 °Cの暗所で30分間インキュベートします。TCA溶液でのインキュベーション後、室温にて10,000 Gsで10分間、チューブを遠心分離します。

上清には、蛍光測定に使用される酸可溶性fite標識Cain断片が含まれています。ペレット中の沈殿物がピペットチップに吸い込まれると、その後の蛍光検出において偽陽性の結果となるため、チューブの上部から慎重にピペットで分注してください。フルオリメーターを用いてプロテアーゼ活性を測定するため、10 µLのTCA上清と1 mLのアッセイバッファーをチューブ内で混合し、穏やかに混ぜ合わせます。加えて、10 µLのFEを1 mLのアッセイバッファーに加えることで、分析用のFE標準液を希釈します。FEコントロールおよびTrypsin標準液は、サンプルが超えてはならない蛍光レベルを示します。TCA上清とアッセイバッファーの混合溶液は、蛍光測定まで2〜8 °Cの暗所で最大24時間保存可能です。

キュベットを用いて測定する場合は、溶液1 mLを適切なキュベットに分注してください。大量のサンプルを処理する場合は、96ウェルプレートと蛍光プレートリーダーを使用して蛍光データを得ることができます。本アッセイでは、機器の校正用コントロールとしてフルオレセインイソチオシアネートを使用します。ここでは、上述の手順に従った後のFITC信号の代表的な直線性の範囲を示しています。

本キットを用い、最初のインキュベーションステップの時間を30分とした場合、1.5 nanogramsから25 nanogramsの範囲のtrypsinおよびコントロールサンプルにおいて、このような典型的な標準曲線が得られます。蛍光測定はマルチウェルプレートで行われました。本アッセイの検出限界は、ブランクサンプルで得られた値よりも有意に高い蛍光値を生成するプロテアーゼ量として定義されます。

本日は、Sigma Aldridgeプロテアーゼ測定キットを用いて、生物学的試料中のフルオロメトリック・プロテアーゼ活性を検出する方法を解説しました。このキットは最適化されていますが、使用するプロテアーゼの種類によっては、わずかな条件変更が必要な場合があることに留意してください。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。