Name: 使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: 学ぶマウス骨格筋へのインビボ電気穿孔法によるプラスミドDNAトランスフェクション技術。蛍光顕微鏡でタンパク質発現を可視化し、遺伝子治療や筋肉生物学研究に応用可能な効率的な遺伝子導入プロトコールを確立する。

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私達は私達とTPLSM施設を共有するために博士T.オーティス、神経生物学、UCLAの部、感謝、博士C. pEYFP - ClC1プラスミドの種類の寄付のためのFahlke、生理学研究所、アーヘン工科大学、ドイツ、、と氏技術サポートのため。R.セラーノ。この作品は、NIH / NIAMS助成AR047664とAR54816からの補助金によって支えられている。

FDBとIO筋肉の in vivoエレクトロポレーションのための実験手順<ol><li> 生体内エレクトロポレーションプロトコルで開始する前に、哺乳動物発現プラスミドはTEの添加/プラスミド2から5μgまでの範囲で濃度を得るために増幅する必要があります注：我々は日常的に商業的な増幅キットを使用すると、メーカーの手順に従う。 in vivoでトランスフェクションの骨格筋で非常によく、CMVプロモーターの仕事を運ぶ商業発現プラスミド。 </li><li>分注し、必要なプラスミド溶液の量（10〜20μl）を二0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ（マウスの左右の足用）に保存します。 </li><li>無菌タイロードで2 mg / mlのヒアルロニダーゼを含有する溶液を準備します。 </li><li>麻酔ボックスを使用して、深く承認されたガス麻酔器とO2のイソフルランの4％を使用して、マウスを麻酔。加熱パッド（37 ° C）に動物を配置し、齧歯類の顔のマスクを使用して麻酔を維持する。つま先のピンチの反射によって麻酔深度をモニターする。 </li><li>解剖顕微鏡で観察下、1&quot;長い33ゲージ滅菌針を用いてマウスの片足の足蹠の下ヒアルロニダーゼ溶液10μLを注入する。足のかかとに近い時点で皮膚に浸透すると〜1 / 4&quot;のための足の指の基部に向かって皮下注射針を進める。 </li><li>所望であれば他の足で手順を繰り返します。 </li><li>麻酔を外し、ケージの中にマウスを置きます。それは完全に麻酔から回復することができます。 </li><li>一時間後、二度目の動物を麻酔し、加熱パッド上に置きます。ヒアルロニダーゼ溶液について説明したのと同じ手順に続いて、プラスミドDNA（プラスミド構築体のサイズに応じて）の20〜50μgの合計を注入する。総注入量は、20未満μL/フィートにする必要があります注：15〜20μLが必要な場合に、それは組織接着剤とニードルのエントリポイントで皮膚を閉じることをお勧めします 。 </li><li>麻酔を外し、ケージの中にマウスを置きます。それは完全に麻酔から回復し、10〜15分間を待つことができます。 </li><li>三度目の動物を麻酔し、加熱パッド上に置きます。 </li><li>動物の片足を選択してください。片足は金メッキ鍼のかかとの皮膚の下に針、そしてつま先の底部の二番目。電極は足の長軸に互いに平行に配向し、垂直である。 </li><li>マイクロクリップコネクタを使用して電気刺激装置に針（電極）のヘッドを接続します。 1Hzで、20パルス、持続時間/各20ミリ秒を適用することにより、筋肉をエレクトロ。電極の間隔に応じて、パルスは電圧振幅は、〜100 V / cmの電界を生成する（オシロスコープで監視することで）調整されます注：。刺激に対する応答のない収縮は、のレベルなら認めてはならない麻酔で十分です。 </li><li>その必要に応じて、動物の反対の足で上記の手順を繰り返します。 </li><li>そのケージに動物を返し、一度、完全に麻酔から回復した観察の下でそれを維持する。注：この手順が正常に行けば、動物は30分以内に完全な移動性を取り戻し、その後ビバリウムでの動物の部屋に戻って送信する準備ができているはず。足蹠におけるヒアルロニダーゼとDNAの注射は、動物に顕著な悪影響はありません。一度麻酔から回復、マウスがケージの周りには通常アンブルすることができます。追加の予防措置として、鎮痛剤として2日間、0.0027 mg / mlの時の動物のカルプロフェンの飲料水に加える。 </li><li>タンパク質発現は2-8日間トランスフェクション後に測定することができる。しかし、多くのタンパク質の持続的な発現は、月間観察された。 </li></ol> 注：動物福祉法と実験動物の愛護ケアや使用に関するPHS方針で義務付けられてすべての動物の手順はUCLA学長の動物研究委員会によって承認された。 代表的な結果： 上記のin vivoエレクトロポレーションの手順での正しい実装はFDBとIO筋肉におけるプラスミドの効果的なトランスフェクションになるはずです。しかしながら、トランスジェニック蛋白質の変異体の発現の効率は、当社のコントロールのうちタンパク質、タンパク質の機能的特性、および他の変数の数のプラスミド、大きさと複雑さに依存します。 mCherryタンパク質のための市販のプラスミド（PMR - mCherry）符号化の存在下でエレクトロポFDB筋肉のために図1に示すように、それらのほとんどが赤色蛍光を表示するという事実によって示されているように、筋線維のほとんどは、我々のプロトコルをトランスフェクトされています。これにより、個々の繊維は、タンパク質の発現の程度が異なるを示すという可能性を除外しない、またはいくつかの繊維がすべて3でトランスフェクトされていないこと。それはBすべきeはそのようなmCherry、EGFP、ECFP、およびEYFPの蛍光タンパク質の大量の効率的な発現は、筋線維&quot;興奮性と興奮収縮連関の特性を損なわないことを指摘した。実際に、彼らは、偽トランスフェクトした筋肉（結果は示していない）のものと区別がつかない。 骨格筋線維の蛍光タグタンパク質の局所的発現を確認するために使用される実用的なアプローチ。 ディノ ​​ボ発現するトランスジェニック蛋白質の細胞内局在は、日常的に細胞構造のよく同定されたマーカーのそれぞれのタグと画像のTPLSM、蛍光画像を使用して、取得同時によって評価されます。これらの後者の最も典型的には以下のとおりです。）第二高調波発生（SHG）サルコメアのミオシン異方性バンド（M -ラインを中心に）9,10から生じる画像、および、b）のジ- 8 - ANEPPS蛍光表面とこの透過性の電位差dye11と筋線維の膜横断管状（T管）システムを標識することにより得られる画像を、。ジ- 8 - ANEPPSで染​​色した筋線維の蛍光画像では、T -細管は、ファイバーの長軸にほぼ直交する蛍光指向の狭いバンドとして表示されます。これらのバンドは、不均等に互いに離間している：彼らは、M -ラインにまたがる長距離、およびZ - 11行にまたがる短いもので区切られています。 骨格筋線維におけるα-アクチニン- EGFPの発現と局在。 構造的な筋肉の蛋白質α-アクチニンのタグ付きバリアントの発現の例を図2に示されています。このタンパク質は、そのように、日常的にこのstructure12のマーカーとして使用される、Z線の主要なコンポーネントであることが知られており、されています。我々は、EGFPをC末端にタグ付けされた人間（非筋）のためのプラスミドpEGFPN1 -α- actinin1エンコーディングα-アクチニンとFDBとIO筋肉をトランスフェクション。六日間トランスフェクション後、我々は、α-アクチニンがほとんど均等に繊維軸に沿って等間隔に狭い帯域で発現されるEGFP蛍光の分布、によって評価することを見出した。サルコメアごとに単一のバンドが（図2A＆2D）見られている。 Z -ラインと、これらのバンドの共局在は、SHG（図2B）およびジ- 8 - ANEPPS（図2E）画像でEGFP蛍光の分布を比較することによって実証される。として彼らはZ -ラインの位置と一致する、つの連続した​​M -バンドの中間に位置していることを示すオー​​バーレイ画像（図2C）、SHGのバンドと交互にα-アクチニン- EGFPのバンド、で示される。ジ- 8 - ANEPPSで染​​色したトランスフェクトされた筋線維では、α-アクチニン- EGFPのバンドは、側面にZ -ラインを（つまり、より短い距離で区切られた）が知られているT -細管（図2F）の各ペア間に集中見られているしたがって、遺伝子組換えα-アクチニンはZ線を対象としていることを示している。 EGFPとのN末端にタグDHPRα1sの発現 pEGFPC1.1 - DHPRα1Sと筋肉のトランスフェクションの効率は、それを示すTPLSMの画像（図3A）で確認されているほとんどの繊維が発現するEGFP -DHPRα1s（膜貫通型タンパク質）。トランスフェクトされた繊維の最も顕著な特徴は、このタンパク質は、T -細管をターゲットとした場合に予想されるとしてEGFP蛍光（図3A＆3B）の二重の縞模様のパターンです。それはまた別の繊維が蛍光強度の様々なレベルを表示しながら、個々の繊維の縞模様の蛍光パターンは、繊維に沿って均質に維持しているように見えることが図3で観察することができます。より高い倍率（図3B）で、それははっきりとバンドの間で不均等な間隔は、ジ- 8 - ANEPPS（例えば図2E）ステンドグラス繊維で観察されたのと似ていることが分かる。オーバーレイ画像（図3B＆3E）は、このタンパク質は、T -細管に位置していることを裏付ける、SHGのバンドがEGFP -DHPRα1sバンドの間に大きな間隔内に配置されていることを示しています。追加は、非蛍光性親油性陰イオンで測定をFRETのDPA -（データは示さず）さらにEGFPの部分はT -細管&quot;膜の内側リーフレットの数ナノメートルの範囲内であることを示している。 ローカライゼーションとEYFP - ClC1の発現の機能評価 EGFP -DHPRα1sで観察されたものと同様のパターンでEYFP -タグ付けされた骨格筋塩素チャネル（ClC1）の構造（N末端 ​​）、ディスプレイEYFP蛍光のバンド（図4A）をコードするpEYFP - ClC1、でトランスフェクション繊維&quot;表現（図3A）およびジ- 8 - ANEPPS染色（図2E）で示すように、T管の配置に対応する。として期待されるオーバーレイ（図4C）に示すように、EYFP - ClC1（図4A）とSHG画像（図4B）の重畳は、SHGのバンドが大間隔Oを中心としていることを示していますEYFP蛍光バンドの間にfを。 として機能する塩素イオンチャンネルの過剰発現から期待される筋線維の静止コンダクタンスの有意な増加でEYFP - ClC1結果、発現するかどうかを評価するために、我々トランスフェクトされたFDBの筋肉から酵素的に解離筋線維とそれらの電気生理学的特性を研究二微小電極を用いた実験では、以前に6,11,13説明した。標準的な蛍光顕微鏡の世界的な蛍光強度の測定（図示せず）から評価されるようにEYFP - ClC1を大量に発現している一つであり、他は非トランスフェクションのコントロールである：図5は、2ファイバからの結果を示しています。図5Aに電圧レコードが（EYFP - ClC1を発現している筋線維から得られる）過度の安静時のコンダクタンスが原因でそれを示し、繊維はほとんど非興奮です。最大400nA（0.5msの）の現在の刺激パルスは非常に小さいアクティブレスポンスを（オーバシュート、図5A）引き出すために使用する必要がありました。コントロールの繊維に記録されたものよりはるかに遅いと広いもののクロライドチャネルブロッカー9 - ACAの500μMを含むものへの外部タイロード溶液の交換後、200 nAの電流パルスは、活動電位を（図5B）誘発するのに十分であった（図5C）。予想通り、9 - ACAの添加は、このコントロールの繊維（図5D）に最小限の影響を持っていた。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /> 図1 生体内エレクトロポレーション法のトランスフェクション効率が。明（A）および蛍光（B）FDBの筋肉の画像は、PMR - mCherryでトランスフェクション。エレクトロポレーションプロトコルの後の日数：12日。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大版のために。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="図2" /> 図2 の発現とFDBの繊維のα-アクチニン- EGFPの標的。パネルAおよびBは、α-アクチニン- EGFPを発現する繊維で、それぞれ、EGFP蛍光とSHGイメージです。パネルCは、AとBのパネルDとEの画像の重ね合わせであり、それぞれ、ジ- 8 - ANEPPSとα-アクチニン- EGFPとステンドグラスを表現する別の繊維の蛍光イメージです。 6日間：パネルFは、エレクトロポレーションプロトコルの後にDとEの日の画像の重ね合わせです。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="図3" /> 図3 の発現とFDB繊維にEGFP -DHPRα1sの標的 。パネルA、EGFP -DHPRα1sを表現する繊維のグループのEGFP蛍光画像。パネルBは、優れた蛋白質の発現の縞模様のパターンを表示するために、パネル内の正方形の拡大です。パネルCはパネルAのパネルDの画像に対応するSHGイメージなのは画像の重ね合わせであり、C.パネルEは、エレクトロポレーションプロトコルの後にパネルD.の日に示された領域の拡大である：20日。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="図4" /> 図4 の発現とFDB繊維でEYFP - ClC1の標的 。パネルAおよびBは、EYFP - ClC1を表現する繊維のそれぞれEYFPの蛍光とSHG画像、、です。パネルCは、パネルでの画像の重ね合わせであるとB.パネルDは、エレクトロポレーションプロトコルの後にパネルC.の日の画像でハイライトされて白い線に沿って測定された強度のプロファイルです：7日間。 <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="図5" /> 図5 トランス ジェニックEYFP - ClC1。パネルを表現する電気生理学的評価の繊維は、AとBはそれぞれ、9 - ACAによる治療の前と後の電流パルスに応答して、EYFP - ClC1を発現している繊維から電圧レコードです。パネルCとDは電圧レコードである（活動電位）がそれぞれ、9 - ACAによる治療の前と後の非トランスフェクション光ファイバで電流パルスに応答して誘発した。

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著者に開示すべき事項はありません。

ここでは、in vivoでのエレクトロポレーションのことで骨格筋線維へのDNAプラスミドの効果的なトランスフェクションを達成するために従わなければならない詳細な手順を説明します。我々のアプローチの主な利点は、動物にごくわずかの健康被害をもたらすの実装のシンプルさ、そしてその最小限の侵襲です。現実には、上述のエレクトロポレーションプロトコルは、麻酔下の動物で良好な忍容性これらのすべてを電気刺激のプロトコル、それに続くフィート当たり2回の皮下注射、より多くを伴うことはありません。われわれの施設でこれらの操作は完全にそれらが皮膚の開口部を必要としない、ので、非外科的処置であると判断されています。加えて、エレクトロポレーション手順のまろやかさは重要な細胞の損傷を効率的に活性なタンパク質の合成に関与する能力を損なうので、筋線維によって効率的なプラスミドトランスフェクションとその後のタンパク質の発現を達成するために全体的な成功のための重要な要素です。 ここで説明する手順にマイナーな調整ができます（とされている）マウスの足の大きな筋肉（例えば指伸筋</...

使用して哺乳類の骨格筋のdnaトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

細胞生物学への関心の高まりは、内因性の分布と機能的関連性を調べるために必須のタンパク質（例えば、蛍光標識の構造及び/または突然変異体）の遺伝子導入によって修飾された形態を発現させることである。完全に分化した細胞ではこの目的を達成するために実装されている面白いアプローチです<em&gt; in vivoで</em肝臓などの特定の組織への様々な方法により、プラスミドの&gt;トランスフェクション<sup&gt; 1</sup&gt;、骨格筋<sup&gt; 2,3</sup&gt;、とさえ脳<sup&gt; 4</sup&gt;。ここでは、効率の繊維に遺伝物質をトランスフェクトするために従わなければならない手順の詳細な説明を提示する<em&gt;短趾屈筋</em&gt;（FDB）と<em&gt;骨間</em使用して成体マウスの&gt;（IO）の筋肉<em&gt; in vivoで</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ。実験パラメータは、個々の繊維で発現されるタンパク質の質と量を損なうおそれがある組織の損傷を最小限に抑えながら、トランスフェクトされた筋線維の数を最大化するように最適化されています。我々は、このホワイトペーパーで説明されている方法論の実装では、可溶性タンパク質の高収率、すなわち、EGFPおよびECFPをもたらすことが確認されました。<sup&gt; 3</sup&gt;、カルパイン、FKBP12、β2a- DHPR、等、構造タンパク質、すなわちminidystrophinとα-アクチニン、および膜タンパク質、すなわちα1s- DHPR、RyR1、心臓のNa / Ca比<sup&gt; 2 +</supFDB、IOとマウスやラットの他の筋肉に適用される&gt;交換器、NaV1.4ナトリウムチャネル、SERCA1、等、。これらのタンパク質のいくつかの効率的な発現は、生化学的に検証されています<sup&gt; 3</sup&gt;と機能的な証拠<sup&gt; 5</sup&gt;。しかし、はるかに私達が使用する最も一般的な確証的なアプローチは、蛍光標識蛋白質の構造の標準的な蛍光顕微鏡と2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、全体の式ではないだけを識別できるだけでなく、詳細な細胞内局在はです。方法は、均等に（ここに示すように）生理的関連性のタンパク質の発現をコードするプラスミドをトランスフェクトするために使用、または干渉RNA（siRNA）のため、通常は発現されるタンパク質（まだ私たちでテストされていない）の発現を抑制することを目指してすることができます。それはこれらの筋肉から酵素的に解離繊維が下の興奮性と興奮収縮カップリングの基本的なメカニズムを調べるために現在最も適切なモデルの一つであるため、FDBとIO筋線維のトランスフェクションは、哺乳類の筋肉の生理学の研究に特に関連であることに注意する必要があります電流または電圧クランプ状態<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;。

我々は、エレクトロポレーションと蛍光顕微鏡を用いたタンパク質発現のその後の可視化を使用して、生きたマウスの足の筋肉の繊維へのプラスミドDNAの効率的なトランスフェクションのための詳細な手順を説明します。

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

細胞生物学において、必須タンパク質の形質転換改変体（例：蛍光タグを付加した構築物や変異体など）を発現させることへの関心が高まっています。

電気穿孔法をin vivoで実施することにより、成マウスの短趾屈筋（FDB）および骨間筋（IO）にDNAやプラスミドを導入し、外来遺伝子を発現させることができます。手順は、まずマウスを麻酔することから始めます。片足の足底面を準備し、針をかかとに刺入し、足に沿って皮下的に誘導してヒアルロニダーゼの初回注射を行います。1時間後、動物を再び麻酔し、ヒアルロニダーゼを注入した足の同一皮下領域に血漿を注入します。10分後、図に示すように金メッキのアキュパンクチャ針を皮下に刺入します。必要に応じて針を刺激装置に接続し、エレクトロポレーションパルスを印加します。この手順を対側足でも繰り返すことができます。2日から8日の期間を経て動物を安楽死させ、筋肉を摘出し、顕微鏡下で蛍光を観察して目的タンパク質の導入を確認します。こんにちは、私はUCLAのデイビー・ゲフェン医学部生理学教室、フリオ・ベラ研究室のマリノ・デフランコです。本日は、成マウスの筋細胞へ転写遺伝子発現プラスミドをInbivo法でトランスフェクションする手順をご紹介します。当研究室ではこの手法を用いて、転写遺伝子タンパク質の発現と局在の解析、およびタンパク質の過剰発現が筋細胞の生理学的に及ぼす影響を研究しています。それでは始めましょう。in vivo エレクトロポレーションプロトコールを開始する前に、哺乳類発現プラスミドを増幅させ、TEバッファー1 µLあたり2〜5 µgのプラスミド濃度にする必要があります。通常、Qiagen社の増幅キットを使用し、製造元の指示に従って操作を行います。CMVプロモーターを搭載した市販の発現プラスミド（例：Invitrogen社のpEGFP-C1またはpEGFP-N1）の使用を推奨します。このプロモーターは骨格筋で非常に効率よく機能するため、in vivoでの切断手順を実演します。P EEG FPNを用いて、滅菌タイロ溶液に2 mg/mLのヒアルロニダーゼを含む溶液をあらかじめ調製しておきます。この溶液は、動物の準備に使用するまで室温で保持します。トランスフェクションには、承認済みのガス麻酔機に接続した麻酔ボックスを使用し、4%ISO fluorineを含む酸素で動物を深く麻酔させます。麻酔後、その後の麻酔操作中にマウスの目が乾燥するのを防ぐため、眼軟膏を塗布します。動物を37 °Cに設定したヒートパッドの上に置き、口腔・鼻面マスクを用いて麻酔を維持します。足指のピンチリフレックスを確認し、麻酔深度をモニターします。動物が深く麻酔されたら、解剖顕微鏡で観察しながら、33ゲージの1インチの滅菌針を用いて、マウスの片足の足底の皮下にhigh UR溶液を10 µL注入します。足のかかとに近い位置で皮膚を貫通させ、針を皮下で指の付け根に向かって進めてください。皮膚が過度に盛り上がるのを防ぐため、約1/4インチにわたって溶液をゆっくりと注入します。もう一方の足でも同様の手順を繰り返します。必要に応じて、注入された酵素がヒアルロン酸を加水分解することで、約1時間かけて筋線維周囲の結合組織を軟化させます。これにより、後に繊維間の間質腔に注入されるDNAプラスミドの拡散が促進されます。ヒアルロニダーゼを注入した後、麻酔を解除し、マウスをケージに戻します。動物は3〜4分で麻酔から回復します。1時間後、動物に再度麻酔をかけます。プラスミド溶液を10 µL採取し、清潔な小型ウェーボートの背面に1滴落とします。注射用シリンジでその液滴を吸い上げ、足底に注入します。より大きなタンパク質向けに記載されたヒアルロニダーゼ溶液と同様の手順に従い、より大量の血漿を注入することができます。15 µL以上の注入が必要な場合でも、20 µLを超えて注入しないことを推奨します。穿刺部位からDNAが漏出するリスクを防ぐため、組織用接着剤を使用して針の刺入部の皮膚を閉鎖することを推奨します。麻酔を解除し、マウスをケージに戻します。麻酔から完全に回復するまで待ち、エレクトロポレーションの準備のために10～15分間待機します。その後、前述の手順に従って動物に再度麻酔をかけます。動物の片方の足を前方に選び、金メッキの鍼または電極を1本はかかとの皮下に、もう1本は足指の付け根に刺入します。鍼は互いに平行に、かつ足の長軸に対して垂直に配置します。使用する鍼の直径は160 micrometers、長さは13 millimetersです。これらは個別に包装された滅菌済み状態で販売されています。電極針の間隔に応じてパルス振幅を調整し、電圧パルスを印加します。これにより、約100 volts per centimeterの電場を形成します。パルス幅を20 millisecondsに、周波数を1 hertzに調整します。マイクロクリップコネクタを用いて、電極のヘッドを電気刺激装置に接続します。20回の電気パルスを印加し、足の筋肉を刺激します。オシロスコープで電圧波形をモニターします。刺激に対する大きな収縮が観察されないことを確認してください。麻酔レベルが適切であれば、必要に応じて麻酔下で操作を行います。もう一方の足でも上記のエレクトロポレーション手順を繰り返します。エレクトロポレーション後、動物をケージに戻し、観察下に置きます。麻酔から完全に回復するまで、動物は5分以内に完全に可動性を回復させる必要があります。有害反応がなく、手順が正常に完了した場合、さらなる予防策として、0.027 milligrams per milliliter の carfin を動物の飲用水に2日間添加します。鎮痛タンパク質として、発現はトランスフェクションの2日から8日後にアッセイできます。しかし、多くのタンパク質において、数か月にわたる持続的な発現が観察されています。市販のプラスミドP EEG FPN one（EGFPタンパク質をコードする）を用いて電気穿孔したFDB筋肉のトランスフェクション効率は、ハンドヘルドUVランプまたは高輝度UVダイオードからのUV光によって容易に可視化できます。解剖顕微鏡でマウスの足を観察すると、大部分の筋線維が緑色蛍光を発していることから、本プロトコルによってほとんどの筋線維にトランスフェクションが導入されたことがわかります。解剖顕微鏡では、筋肉における全体的なトランスフェクションパターンを確認できます。この観察を繰り返します。落射蛍光顕微鏡を使用することで、筋線維束内または個々の筋線維におけるEGFPの発現パターンの可視化が可能になります。FDB筋線維におけるmCherryタンパク質の発現効率は、筋肉の明視野像と蛍光像を対比させることで評価できます。また、新たに発現した導入タンパク質の細胞内局在を評価するには、二光子レーザー走査顕微鏡を用いることができます。蛍光タグ付きタンパク質の画像と、細胞構造の同定済みマーカーの画像が同時に取得されます。細胞構造マーカーの中で最も代表的なものは、サルコメアのA帯のM線を中心とするミオシンフィラメントに由来する、第二高調波発生（SHG）画像です。筋線維の表面および横管（t tubule）系の膜を、膜電位感受性染料であるdye eight anepで標識することで得られた筋線維の蛍光画像です。t tubuleは、線維の長軸に対してほぼ直交するように配置された、狭い蛍光帯として現れます。これらの帯の間隔は不均等です。これらは、M線にわたる長い距離と、Z線にわたる短い距離によって隔てられています。ここでは、構造筋肉タンパク質であるalpha actininのタグ付き変異体の発現例を示しています。このタンパク質はZ線の主要成分であり、この構造のマーカーとして日常的に使用されています。我々は、C末端にEGFPをタグ付けしたヒト非筋型α-アクチニンをコードするプラスミドP-E-G-F-P Fpn one alpha actininを、FDB筋およびIO筋に導入し、導入から6日後に観察しました。その結果、α-アクチニンは主に、筋線維軸に沿って等間隔に配置された狭いバンド状に発現していることが分かりました。サルコメアあたり1本のバンドが観察されます。これらのバンドとZ線の共局在は、オーバーレイ画像に示されるように、EGFP蛍光の分布をSHGまたはD8アネックス画像と比較することで証明されます。α-アクチニンとEGFPのバンドはSHGバンドと交互に現れており、これは、d-アップα-アクチニンで染色された形質転換筋線維において、これらが2つの連続するMバンドの中間、すなわちZ線の位置に一致して存在していることを示しています。EGFPバンドは、Z線を挟んでいることが知られている各T管のペアの中央に位置して観察されます。このことは、導入されたα-アクチニンがZ線に標的化されていることを示しています。N末端にEGFPタグを付加したDHPR α1sの発現とターゲティングを図3に示します。EGFPの蛍光は、主にT2ESと類似したパターンの間隔を持つ一対のバンドとして観察されます。SHG画像とEGFP-DHPR α1s画像を重ね合わせると、連続する2つのSHGバンドの間に2つのEGFP蛍光バンドが存在することが示され、DHPR α1sがT2ESのD8およびabstainingに正しくターゲティングされていることが唆されます（図示せず）。これはDHPR α1sのT管ターゲティングの確実な証明となります。骨格筋塩化物チャネルCLC1のC末端にEYFPタグを付加したコンストラクトをコードするPEYFP CLC1を transfection した線維では、EYFP蛍光の帯状構造が見られ、これはD8およびabstainingで示されたT管の配置と一致しています。予想通りであった。オーバーレイに示されているEYFP CLC oneとSG画像の重ね合わせにより、SHGバンドがEYFP蛍光バンド間の大きな間隔の中心に位置していることがわかる。機能的なクロライドチャネルの過剰発現から予想されるように、EYFP CLC oneの発現が筋線維の静止コンダクタンスを有意に増加させるかを確認するため、トランスフェクションしたFDB筋肉から筋線維を酵素的に解離させ、2電極法を用いて電気生理学的特性を検討した。この画像は2本のファイバーの結果を示しています。1本は大量のEYFP clcを発現しており、標準的な蛍光顕微鏡による全般的蛍光強度の測定で評価されています。もう1本は非導入のコントロールです。この電圧記録は、EY FP CLC-1を発現している筋線維から得られたものである。対照線維を興奮させるのに必要な強度よりも大きな電流パルスを印加しても、外部のタイロ溶液を500 µMのクロライドチャネル遮断剤である9-Racine carboxylic acid（9-ACA）を含む溶液に置換すると、導入された線維では小さな再生反応しか誘発されない。より小さいパルスでは活動電位が誘発されたが、予想通り、対照線維で記録されたものよりも大幅に遅く、幅広であった。9-CAの添加は、対照群の筋線維にほとんど影響を与えませんでした。これにより、EY FP CLC1を発現している筋線維は、過剰な静止塩化物イオンコンダクタンスのため、ほぼ興奮しなくなっていると結論付けられます。以上で、エレクトロポレーションを用いて生きた骨格筋線維に外来タンパク質発現プラスミドを導入する方法と、導入効率および導入タンパク質の局在と機能の評価方法について説明しました。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

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