動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製
2009年10月30日
ヒト血小板溶解液は、増殖因子や細胞培養における強力なサプリメントの豊富な情報源となります。このプロトコルは、多血小板血漿から始まるいくつかの凍結融解サイクルを実行し、血小板の断片を枯渇させることによってヒト血小板溶解物の大規模なプールを準備するプロセスを示します。
本プロトコルでは、多血小板血漿から大量のヒト血小板溶解物を調製するプロセスについて説明します。1回の凍結融解サイクルを行うことで、血小板を溶解させます。その後、少なくとも10単位のヒト血小板溶解物を1つのバッチにまとめ、プールヒト血小板溶解物（PHPL）を作成します。
この約3リットルの液量をさらに分注し、血小板断片を除去するために再度凍結させます。これらの分注液を融解してバイアルに移し、遠心分離にかけます。上澄み液が、細胞培養の補充に使用される血小板由来成長因子を含む、血小板断片除去済みPHPLとなります。
残りの血小板断片ペレットは廃棄します。こんにちは、Grads医科大学幹細胞研究ユニットのDr.TRO研究室のカディナ・シャルモです。本日は、ヒト血小板分離プールの調製手順について解説します。
まず血小板豊富血漿（PRP）を用意し、凍結融解サイクルを数回繰り返した後、血小板断片を除去します。当研究室では、胎児牛血清の代替として細胞培養に十分なサプリメントを得るためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。
本プロトコルでは、PRPと呼ばれる多血小板血漿を使用します。この血漿は、サイフェレーシス（成分採血）によって調製されたか、バフィーコートから誘導されたものである可能性があります。輸血医学の専門外の方は、地域の血液センターやその他の認定提供元からPRPを購入してください。
各PRPユニットから20 millilitersを接続された小型バッグに分注し、ウェルダーを用いてバッグを切り離すことで、PRPユニットの無菌性を確認します。この分注サンプルは、調製後すぐに微生物検査室へ送り、無菌試験に供することができます。PRPユニットは、元の保存バッグに入れた状態で、少なくとも-20 degreesまで凍結させることが重要です。
細菌検査の結果が陰性になったら、次のステップに進みます。ヒト血小板溶解物（以下、HPLと呼ぶ）が過度に加熱されないよう注意しながら、氷結した凝塊が消失するまで、HPLユニットを37°Cの恒温水槽に入れます。各血小板溶解物プールで標準化された製品を調製するため、この凍結融解ステップの後に血小板を溶解させる必要があります。
解凍済みのPRPユニットを10〜15個収集します。連続する各HPLバッグをプーリング用ダブルバッグに接続し、HPLをこれら2つのバッグに転送します。空になったHPLバッグをウェルダーで切り離します。
2つのバッグの内容物を混ぜ合わせ、プールヒト血小板溶解物（pooled human platelet lysate）の最終容量を3〜4 Lにします。以降、これをPHPLと呼びます。小型バッグを接続し、プールした製品の無菌性を確認するためにPHPLのサンプルを20 mL採取します。
プーリング用ダブルバッグに小型バッグを接続し、PHPLサンプルを分注します。小型保存バッグに約250 millilitersずつ移し、ウェルダーを用いて充填済みバッグを切り離します。次に、血小板の断片化率と放出される成長因子の量を増加させるため、さらに1回の凍結融解サイクルを行います。
分注したPBMCの小袋を-20°Cで凍結させます。その後、ラミナーフローフード内で、37°Cのウォーターバスを用いて袋を融解させます。
滅菌済みハサミを使用して各バッグのチューブを切断して開き、PHPLを50 milliliterバイアルに注ぎます。血小板断片は血小板を凝集させる傾向があり、同種免疫を誘導する場合もあります。これらの状況を避けるため、冷却遠心機を用い、4, 000 GSで15分間遠心分離してPHPLから断片を除去します。
次に、血小板ペレットが細胞培養液の凍結時に断片として混入するのを防ぐため、血漿上清を最終保存容器に分注し、血小板ペレットは廃棄してください。PHPLを50 mLずつ分注し、次回の使用まで再び-20 °Cで凍結保存します。これで血小板断片除去PHPLが作成されたため、溶解物の特性を分析することができます。
プールした血小板溶解物の機能と品質は細胞培養にて試験されており、細胞増殖の効率的な促進、間葉系ストローマ細胞（MSCs）および血管内皮コロニー形成細胞（E CFCs）の増殖において、血小板断片を除去したPHPLを用いて成功することが証明されています。培地の組成については、こちらの書面によるプロトコルをご参照ください。プールしたヒト血小板溶解物の2つのアプリケーション。
間葉系ストローマ細胞の培養において、ドナー1由来のMSCをPHPLまたは血小板フラグメント除去PHPLを用いて培養した結果を示します。示されている通り、フラグメント除去PHPL単独と比較して、ここではより多くのフラグメント混入が認められます。血小板フラグメントでは、MSCの増殖を十分にサポートすることはできません。
3枚の画像はすべて培養13日後に撮影されたものである。ドナー2由来のMSCは、血小板豊富血漿（PRP）ではなく、血小板断片を除去したPHPLで9日間培養された。血小板溶解を行っていないPRPでは、MSCの増殖を十分に維持できないことに留意されたい。
また、ヒト臍帯血由来MSCの分離および培養にフラグメント除去PHPLを使用する方法について記述したAndreas ReishによるJoVEプロトコルも参照してください。幹細胞培養において動物血清を完全に代替するためのPHPLの作製方法について説明しました。この手順を行う際は、培養液にヘパリンとPHPLを添加する前に、血小板フラグメントを除去することが重要です。
以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。
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概要
本プロトコルでは、多血小板血漿（PRP）からヒト血小板溶解液（HPL）を調製する方法について詳述します。このプロセスでは、凍結融解サイクルを用いて血小板を溶解させ、細胞培養のサプリメントとして適した、成長因子が豊富で血小板断片の少ない溶解液を作製します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 細胞培養
- 血小板生物学
- 成長因子研究
背景
- ヒト血小板溶解物は、細胞培養において強力なサプリメントとなります。
- これには、細胞の増殖と分化に不可欠な様々な成長因子が含まれています。
- 溶解物の品質と有効性を確保するためには、調製プロセスが極めて重要です。
- HPL調製の出発物質として、血小板豊富血漿が用いられます。
研究目的
- ヒト血小板溶解液（HPL）調製の詳細なプロトコルを提供すること。
- 血小板断片を除去し、より純度の高い溶解液を確保すること。
- さまざまな細胞培養アプリケーションにおけるHPLの利用を促進すること。
使用された手法
- 多血小板血漿（PRP）から開始する。
- 凍結融解サイクルを行い、血小板を溶解させる。
- プールヒト血小板溶解物（PHPL）の調製。
- 遠心分離により、上清から血小板断片を除去する。
主な結果
- ヒト血小板溶解液の大量プール調製の成功。
- 遠心分離による血小板断片の除去。
- 約3 Lの血小板由来成長因子の回収。
- 細胞培養のサプリメントに適した調製物。
結論
- 本プロトコルは、ヒト血小板溶解物の調製における信頼性の高い手法を提供します。
- HPLは、細胞培養の結果を大幅に改善させることができます。
- 今後の研究により、さまざまな研究分野におけるHPLの応用を探索することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
動物血清不使用の培養システムは、幹細胞治療を臨床応用および規制遵守へと進めるために不可欠です。本プロトコルでは、間葉系ストローマ細胞の増殖および血管内皮コロニー形成細胞の伝播をサポートする、定義済みのゼノフリーサプリメントとして、ヒト血小板溶解物（pHPL）をスケールアップして製造する方法を提示します。血小板の溶解およびフラグメント除去を標準化することにより、ロット間のばらつきを抑え、初期探索および前臨床ワークフローにおける再現性を向上させます。
バイオファーマ R&Dにおける戦略的活用
初期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値：幹細胞の増殖および分化経路のメカニズム研究を支援する、定義されたヒト由来のサプリメントを提供します。
- 運用的価値：実験間で一貫した培養条件を可能にし、標的検証アッセイにおけるばらつきを低減します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 機能的幹細胞アッセイにおいて信頼性の高い結果を得るために不可欠な、成長因子を豊富に含み標準化された培地を提供します。
- 運用的価値： フラグメント除去済みのライセートを使用することでアッセイの標準化を促進し、スクリーニングプラットフォームにおける血小板凝集物による干渉を最小限に抑えます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 異種成分フリー（xeno-free）条件下での疾患関連幹細胞の増殖を可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカーおよび前臨床モデルの要件に適合します。
- 実用的価値： プールされたドナーソースからのスケーラブルな製造を可能にし、技術移転およびGMP準拠のプロセス開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のターゲット検証から前臨床段階での拡大培養に至るまで、幹細胞培養用の無血清サプリメントを提供することで、リード化合物の同定およびメカニズム的なリスク低減を支援し、創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 発見生物学：一貫性のある定義された微小環境を提供することで、幹細胞の増殖および分化に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：標準化され、断片が除去されたライセートを用いることで、幹細胞ベースのアッセイにおける化合物または条件の再現性のある試験を可能にします。
- 分析：細胞増殖率やコロニー形成能などの定量化可能なアウトプットを得ることができ、培養条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：臨床的に関連のあるアニマルフリーな条件下で、間葉性ストローマ細胞および血管内皮前駆細胞の拡大をサポートし、基礎研究を前臨床研究へとつなげます。
- エンタープライズ再利用：日常的に調達される多血小板血漿から臨床グレードのサプリメントを製造するための、再利用可能でスケーラブルなプロセスを確立し、変動性の高い動物血清への依存を低減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 未定義の動物血清成分を排除し、成長因子の投与を標準化することで、幹細胞培養結果の予測信頼性を高めます。
- 運用的価値： プールドドナー処理および標準化された凍結融解・遠心分離ステップを通じて、再現性とスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値： ウシ胎児血清に代わるヒト由来のゼノフリー（xeno-free）な代替手段を提供することで、細胞治療開発における生物学的リスクを軽減します。
- ポートフォリオへの影響： 定義された培養システムにおいて一貫性のある前臨床データの生成を可能にし、リスク調整後の推進決定を支援します。
実施上の検討事項
- 無菌的な細胞培養技術、血小板の取り扱い、および遠心分離プロトコルの専門知識が必要です。
- 認定された血液銀行または輸血サービスからの血小板豊富血漿（PRP）へのアクセス、およびバッグ操作のための無菌溶接または封印装置が必要です。
- 培養の安全性を確保するため、処理前後の投入PRPおよびプールした溶解液の標準的な無菌試験が必要です。
- プール戦略を導入しているものの、ロット固有の成長因子濃度を考慮した培養プロトコルの調整が必要です。
- 複数回の凍結融解サイクルと遠心分離工程が必要であり、処理時間の増加と専用の設備が必要となるため、制約があります。
