Name: 分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-28T07:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学ぶ成人ヒト末梢血からの内皮コロニー形成前駆細胞（ECFC）の分離と大規模拡張法。ヒト血小板溶解物（pHPL）を用いた動物血清フリー培養により、抗ボビン免疫化リスクを低減し、血管恒常性と修復研究の安全性を向上させる。

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著者は優秀な技術支援のためにpHPLとマルガレッタFrühwirthとダニエラターラーを提供するための博士カタリーナSchallmoserに感謝。

A.）ECFC ISOLATON 1日目： <ol><li>あなたが実験を始める前に細胞培養培地内皮増殖培地-2（EGM - 2）を準備する。 、ヘパリン（1000 U / mlの1ミリリットル）、ペニシリン/ストレプトマイシン（すべてSigma社、セントルイス、MO 5mlの100倍液で500ミリリットル内皮基礎培地- 2を補足<a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a> 、L -グルタミン（2mMの最終濃度） ）、および50mlプールされたヒト血小板溶解液（pHPL）。 、0.2 mlのヒドロコルチゾン、2ミリリットルhFGF - B、0.5ミリリットルVEGF、0.5ミリリットルEGF、0.5ミリリットルIGF - 1と0.5ミリリットルアスコルビン酸（SingleQuotsとして提供される、すべてのロンザ、ウォーカー、MDを追加します。 <a href="http://www.lonzabioscience.com/">http://www.lonzabioscience。 COM /</a> ）。無菌ろ過0.2メートル、細孔径500ミリリットルミリポア真空フィルタを通して培地。 pHPLは小さな血栓を形成するので、1つの媒体のための二つのフィルタが必要な場合があります。プリウォームフィルタリングEGM - 2〜37℃の水浴で</li><li> 6ミリリットル防腐剤フリーナトリウムヘパリンの血液バキュテイナ管に肘静脈からのヒト成人末梢血5mlを描画することにより、血液サンプルを収集する。次の2つの時間の最大値内で血液サンプルを処理する必要があります。 </li><li>ベントキャップ、一つ25mlのピペットと層流のベンチで2つ5ミリリットルピペットとフラスコ、一つ75センチメートル2（コスターT75）を準備することから始めます。 </li><li>プレフィル15ミリリットルは、予め温めておいた25mlのピペットとフラスコにEGM - 2を補った。今血液バイアルおよびサンプルフラスコに5 mlのピ​​ペットを用いてすべての5 mlを開きます。目の5 mlのピ​​ペットを用いて追加のEGM - 2の5mlで空の血液バイアルを洗浄します。 T75内の総容積は25 mlです。 37℃インキュベーターにフラスコと場所の通気キャップを閉じ° C、5％CO 2および24時間で95％の湿度。 </li></ol> 2日目： <ol><li>約24時間（一晩）した後は、非接着細胞を取り除くために中期の血液の混合を削除する必要があります。層流でこの準備two 25ミリリットルピペット三5ミリリットルピペット用、プレ暖かい20ミリリットル° Cの水浴中で37にEGM - 2（前日に準備）、30 mlのPBSを補った。 </li><li>インキュベーターからサンプルでフラスコを取り外し、25 mlのピ​​ペットで上清を取り除く。潜在的なコロニーの損傷を防ぐために、フラスコの表面を傷付けないように注意してください。静かに予め温めておいたPBSと傾く一方から他方へのフラスコ10 mlを加えることによって内側のフラスコの細胞接着表面を3回洗浄する。 PBS直ちに毎回と廃棄を削除します。 </li><li>フラスコに新鮮予め温めておいたEGM - 2の20 mlを加え、インキュベーターに戻すに置きます。このプロセスはデ​​タッチしないように接続されたセルに対して可能​​な限り迅速かつ穏やかとして実行する必要があります。彼らは長い間にPBSでまたは室温で保存されている場合ECFCsは容易に切り離す。 </li><li> ECFC伸長を探している光学顕微鏡の低倍率を使用して2日目から始まる全身フラスコ隔日を通じて画面。コロニーは、コロニーの位置を示すフラスコの外側に上にマークを発見された場合。 flaksが5分以上インキュベーターの外であってはならないことに注意してください。 </li></ol> 5日目： <ol><li>五日目に播種した後、非接着細胞を除去する完全培地の変更を行います。 EGM - 2に37℃の水浴中と2つの25 mlのピ​​ペットを準備のこの目的のため事前に暖かい20ミリリットル用。 </li><li> 25mlのピペットを使用して完全培地を取り出して、できるだけ早く、新鮮な、予め温めておいた補充EGM - 2を追加します。細胞が乾燥しないに1分以上のための媒体なしのままにしないでください。インキュベーターに戻して置いて、毎日のフラスコをスクリーニング繰り返す。 </li><li>新鮮な補充EGM - 2で、週に2回培地の30％を置き換えることにより、細胞を養う。 </li></ol> DAY 14から28： <ol><li>石畳の形態を持つ典型的なコロニーは、12日目の周りに表示されます。各コロニーの位置を示すために、フラスコの上部外側にマークを付けます。単一細胞がデタッチを開始しない限り、コロニーは、28日目までに成長することができます。一度、一次コロニーは、それらがその大きさに応じて、14日目と28の間に収穫することができる確認されている。 </li></ol> B.）ECFC HARVEST <ol><li>事前に暖かい5ミリリットルトリプシン0.05％/ EDTA、20 mlのPBSと5ミリリットル新鮮な補充EGM - 2。 </li><li>完全にファルコンチューブ（潜在的なコロニーの損傷を防ぐために、フラスコの表面に触れないように注意を取る）にフラスコから培地を除去し、PBS予熱した10mlで慎重に細胞を洗浄。 </li><li>インキュベーター内で5分間5ミリリットルトリプシン/ EDTAとインキュベートする。それは有毒になるので細胞が以上の7分間トリプシンにさらされるべきではない。徹底的にフラスコの側面をタップすると細胞がデタッチするのに役立ちます。保存され使用される培地の約10mlを加えることによってトリプシンのプロテアーゼ活性を消失。 </li><li> 50ミリリットルファルコに細胞懸濁液を取り除くn個のチューブ。その後収穫された細胞懸濁液に添加されている10 mlのPBSで一回フラスコを洗ってください。 4℃で7分間300gで細胞懸濁液を遠心° Cは、細胞を回収し、トリプシンを除去する。上清を捨て、1mlのPBSですぐに細胞ペレットを再懸濁します。氷上に置きます。 </li><li> R.リカルドとK. PhelaniでJoveのプロトコルで説明されているように細胞数を決定します。5 </li></ol> C.）ECFC EXPANSION <ol><li> 1.1で説明したように）500ミリリットルEGM - 2を補足するものです。 37〜プレ暖かい℃の水浴でC。 </li><li> Nunc社、シカゴ、イリノイ;約2500 cm 2と文化空間を11 T220（225 cm 2）のまたは15 T175（175cm 2の ）またはいずれか4層の細胞の工場を（CF - 4準備<a href="http://www.nuncbrand.com/">http://www.nuncbrand 。com</a> ）。さらに、2つの新鮮なベントキャップと層流ベンチで特別な滅​​菌漏斗が必要になります。 </li><li> 100の開始細胞密度でシードECFCsに細胞数のC / cm 2と計算が必要です。一つはCF - 4 252800細胞を500 mlの新鮮なEGM - 2に再懸濁させ、滅菌漏斗を使用してCF - 4に注いだ。 Closeをベントキャップ付き通気口とすべての4小麦粉との間の媒質の平等な分配を可能にする、CF - 4対1の経度の側に傾けます。その後、バックチャンバーを傾けて、ベントキャップの蓋を開きます。インキュベーターでCF - 4を置きます。 </li><li> CF - 4はコンフルエントになるまで、少なくとも週1回の培地の20％を変更します。 </li><li>収穫の細胞は、トリプシン/ EDTAを70mlと約200 mlのPBSを使用して）Bに説明。 </li></ol>駐在結果この分離法を用いて、我々は、12日目で一次コロニー形成を観察した。以前の研究では4.0の平均値±末梢血中の各MLから派生した0,8 ECFC -コロニーを回復することができた4 ECFCsは、典型的な石畳の外観を示した。大規模な展開の後、100細胞/ cm 2の播種密度で、我々は3雄と雌1匹のボランティア（26と50歳の間の年齢）から約30日間の合計で&gt; 1 × 10 8細胞を得た。 このような条件下で培養ECFCは、増殖、機能およびゲノム的に安定であることが示された4さらに細胞をさらに使用するために液体窒素で（10％DMSOで）保存することができます。3,4

<ol><li>Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+endothelial+cells+in+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia.</a> N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).</li>
<li>Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

この小説の分離と拡張メソッドは、任意のセルの分離を（不要密度勾配）回避することで、より効率的で時間がかかり、簡単で効率的なプロセスであり、従来の手法よりも安価。ウシ抗原と推定されるその後のxenoimmunizationにpHPL接触を使用することによって除外されます。培養期間中に小さな血栓がpHPLによって引き起こされる、形​​成することができる。我々の経験に基づいて、これらの血栓がコロニー形成し、細胞増殖や機能には影響しません。

<table><tbody><tr><td>内皮細胞基礎培地-2</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>500ml</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td>EGF、hFGF-B、VEGF、IGF-1、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸</td></tr><tr><td>保存剤不含ヘパリン</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td>EGM-2あたり10U/ml</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>EGM-2あたり2mM</td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100U/mL ペニシリンおよび&lt;br/&gt;100&amp;#x03BC;g/mL ストレプトマイシンあたり&lt;br/&gt;EGM-2</td></tr><tr><td>トリプシン/1mM EDTA </td><td>Invitrogen</td><td></td><td>T75フラスコあたり7ml&lt;br/&gt;CF-4用 70ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4層セルファクトリー (CF-4) </td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌漏斗</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培養フラスコ（通気性キャップ付き）</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mLバキュテイナーチューブ（保存剤フリーナトリウムヘパリン配合） </td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>108 IU/6mlをあらかじめ充填した&lt;br/&gt;保存剤フリーヘパリンナトリウム</td></tr><tr><td>50ml Falconチューブ</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml ストリペット</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25ml ストリペット</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクイーザー</td><td>Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>孔径0.2μmの滅菌フィルター</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>EGM-2あたり500ml×2</td></tr></tbody></table>

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

本論文では、ヘパリンから内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）のための新規な復旧戦略を導入し、それ以外は12日間の平均値内に成人ヒト末梢血をunmanipulated。大規模な展開の後に&gt; 1 × 10 8 ECFCsは更なる試験のために取得することができます。有利にpHPLを使用してウシ血清抗原とヒト細胞の接触を排除することができます。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学法により単離された細胞はECFCと構造がマトリゲルアッセイで試験することができるように血管を形成するためにin vitroでの機能として特徴づけることができる。さらにこれらの細胞は、皮下、in vivoで機能的、灌流血管を形成するために、マウスモデルに注入することができる。後の長期的な拡大と凍結保存、増殖、機能、ゲノムの安定性が保持されているように見える。3,4 この動物タンパク質フリーの分離と拡張メソッドはECFCsを大量に生成するために容易に適用可能です。

内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。<sup&gt; 1,2</sup&gt;このホワイトペーパーでは、抗ウシ予防接種のリスクを減少させるプールされたヒト血小板溶解液（pHPL）とヘパリン成人ヒト末梢血から分離し、ECFCの拡大のための新しい動物血清フリーの方法を紹介します。

本論文では、ヘパリン投与済みで、それ以外は未操作の成人から内皮コロニー形成能を持つ前駆細胞（ECFC）を回収するための新しい戦略を紹介します。

全血を動物血清不含の最適化培地で培養するだけで、E CFCは75 cm²のフラスコ表面に付着し、大部分の赤血球および白血球が除去されます。1日目にフラスコを洗浄し、5日目に全培地を交換することで、残存する細胞を排除します。2日おき、または都合が良い場合は週に3回、コロニーのスクリーニングを続けてください。12日目あたりに最初のコロニーが観察されるはずです。こんにちは、私はグロッツ医科大学幹細胞研究ユニットのニコル・ホフマンです。本日は、成人ヒト末梢血から血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFC）を単離および増殖させるための簡略化された手順について解説します。当研究室では、in vitro および in vivo における ECFC の機能と生物学的特性を研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。このセクションでは、培養に使用する内皮細胞増殖培地2の調製およびフィルター滅菌から開始します。培地20 mLを37 °Cのウォーターバスで予熱します。成人ヒト末梢血5 mLを、保存剤フリーのナトリウムヘパリン血液採取用真空管（6 mL用）を用いて肘正中静脈から採取します。血液サンプルは、採取後2時間以内にラミナーフローフード内で処理する必要があります。ラミナーフローベンチに、通気性キャップ付きの75 square centimeter flask 1本、25 milliliter ピペット1本、および5 milliliter ピペット2本を準備します。25 milliliter ピペットを使用して、あらかじめ加温したサプリメント添加E GM twoを15 milliliters、フラスコに満たしておきます。血液のファイルを開き、5 mLピペットを使用して、5 mLの血液すべてをフラスコに直接移します。ピペットを用いて、残りの5 mLの予冷したEGM-2で空の血液バイアルを洗浄します。この洗浄液をフラスコに加えます。フラスコのベントキャップを閉じます。この時点でフラスコには 25 milliliters 入っているはずです。フラスコを 37 degrees、5% carbon dioxide、95% humidity に設定したインキュベーターに入れ、24 hours 保管します。翌日、補充済み e GM two 20 milliliters と PBS 30 milliliters を 37 degree のウォーターバスで予熱し、25 milliliter ピペット 2 本と 10 milliliter ピペット 3 本をラミナーフローフード内に準備します。サンプルが入ったフラスコをインキュベーターから取り出し、25 milliliter ピペットを使用して、非接着細胞を含む培地と血液の混合液を除去します。その際、ピペットでフラスコ表面を傷つ

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