ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

このプロトコルは、間葉系幹細胞および実験的移植の目的のために自己のペアを生成するために動物血清を使用することなく、内皮コロニー形成細胞の分離とその後の展開について説明します。

ヒトの臍帯は、前駆細胞の供給源として簡単にアクセスできます。この記事では、内皮前駆細胞の単離とその後の拡大のためのプロトコルについて説明します e CFCs、血管壁内の細胞の亜集団、および間葉系前駆細胞。MSCは単一のヒト臍帯に由来します。

まず、ハサミを縦に使用して、ヒトの臍帯静脈に沿って切断し、血管内表面から細胞を掻き取ります。スクレーパーから細胞をフラスコに移し、コロニーの成長を待ちます。削り取られた細胞の一部は、前駆細胞の表現型を示し、大きなコロニーを形成するために大量に増殖します。

これらの細胞が増殖すると、e CFCを新しいフラスコで増殖させることができます。さらなる解析のために、間葉系細胞集団をヒト臍帯から単離することもできます。コードの一部を細かく切り、滅菌培養プレートに移します。

数日後、間質細胞の成長が血管間組織片の周囲に見えるようになります。これらの細胞を新しいフラスコに移し、さらなる分析のためにそれらを拡張します。このプロトコールでは、3〜4週間以内に1つの出発物質コードから2種類の前駆細胞の系統を取得することができます。

こんにちは、私はオーストリアのグラッド医科大学の幹細胞研究ユニットのDr.T Strongの研究室のAndreas Danishです。本日は、1つのアンビリカルコードからヒト間葉系および内皮チャネル細胞を単離、増殖、および解析する手順をご紹介します。用語について1つだけ注意点があります。

私たちの細胞は、多能性間葉系間質細胞、またはMSEおよび内皮結腸形成プロ細胞またはeCSCと呼ばれます。私たちの研究室では、この手順を使用して、非ヘマティック前駆細胞の機能と生物学を研究しています。それでは始めましょう。

細胞単離ステップの前に、層流組織培養フードをイナジンで拭き取り、滅菌細胞培養プレートを採取します。細胞培養フラスコ、PBS滅菌手術器具、細胞スクレーパー、チューブホルダー、25ミリリットルのストリップペット、鈍い先端針が取り付けられた5ミリリットルの注射器。アルファMEMおよびEGMの2細胞培養培地を37度の水浴で予温することを忘れないでください。

次に、臍帯を層流に移し、PBSで2回洗浄します。汚染された血液を除去するには、滅菌済みの5ミリリットル注射器を使用して、片側の臍帯静脈にカニューレを挿入します。次に、体液が流出するまで臍帯静脈をPBSですすぎます。

コードのもう一方の端は完全に透明になり、赤みがかっていません。75平方センチメートルのフラスコに15〜20ミリリットルのプレウォームEGM 2培地を充填することにより、前駆細胞の単離を形成する内皮コロニーを開始します。滅菌PBSで満たされた新しいプレートにコードを置き、手術用ハサミを使用してコードをそれぞれ約5センチの長さの2つに切断します。

次に、手術用ハサミの1枚の刃を挿入し、静脈を縦方向に切ります。この時点で、助手は鉗子を使用して静脈を保持し、さらに切開を行うことができます。静脈が開いたコードを新しいプレートに入れます。

PBSを使用しない場合は、セルスクレーパーを使用して、静脈の内面を少なくとも1センチメートルの領域にわたってこすります。EGM 2培地でスクレーパーを洗浄し、こすった血管細胞をフラスコに放出します。この手順は、最大10回繰り返す必要があります。

フラスコを閉じ、37度、二酸化炭素5%、湿度95%に設定されたインキュベーターに入れます。e CFCが分離されたので、MSCに移りましょう。内皮層を削り取ったので、滅菌メスを使用してコードを非常に細かく切ります。

1〜2ミリメートル。滅菌鉗子を最大限に活用して、これらの断片を事前に標識された培養プレートに移します。プレートを少なくとも5分間開いたままにしてから、メディウムを充填して、ピースがプラスチック表面に付着できるようにします。

可能な限り低速で、30〜35ミリリットルの温暖アルファ修飾MEMを穏やかに加えます。プレートを閉じ、5%の二酸化炭素と95%の湿度で37度に設定されたインキュベーターに入れます。コード片からの間葉系間質細胞の増殖には3〜7日かかり、その後細胞を増殖させることができます。

一方、ECFCは拡張できますが、これは次のステップで示されます。翌日、倒立顕微鏡を使用して細胞を検査します。スクレイピング手順が適切に行われた場合、最初に増殖した細胞クラスターが完全に見えます。

E GM 2つのメディウムを交換して、付着していないすべてのセルと粒子を取り除きます。細胞を増殖させ続け、培地の3分の1を週に2回交換します。10〜12日後、非常に大きな内皮コロニーが定期的に観察されます。

次に、培地を取り出し、PBSで洗浄して、残りのタンパク質の使用を取り除きます。0.05%トリプシン0.7ミリモルEDTAで細胞を剥離します。細胞を新しい培養容器に移すときは、播種密度を低くするために適切なサイズのフラスコを選択してください。

これにより、さらなる拡大が可能になります。私たちの研究室では、通常、20以上の大きなコロニーから子孫を4つの225平方センチメートルのフラスコに後退させます。週に2回、培地の3分の1を交換することを忘れないでください。

次のセクションでMSC拡張についても同様のプロトコルを使用します。3〜7日が経過したら、倒立顕微鏡を使用して、付着した組織の近くに紡錘形の細胞が出現するかどうかを確認します。細胞の伸長が十分にあると、プラスチックとの接触を失うため、ピースは付着する傾向があります。

10〜12日後、ティッシュペーパー片を取り除きます。トリプシンEDTA溶液を使用してプラスチックからMSCを分離し、細胞を適切なサイズと数の新しい培地プレフィルド培養フラスコに移して、細胞増殖中の低播種密度を保証します。両方の細胞型が増殖した後、培地の3分の1を週に2回交換する必要があります。

染色とそれに続くフローサイトメトリーを行うことで、前駆細胞の表現型を示す細胞表面マーカーの発現を検出し、造血細胞による汚染がないことを判断できます。純粋に収穫された電子CFCsを、細胞培養プレートで1平方センチメートルあたり3細胞または10細胞の非常に低いめっき密度で播種し、単一コロニーの成長を保証します14日後に週に2回、培地の3分の1を交換します。文化の終焉。

メディアを取り外します。PBSで2回洗浄し、氷冷固定液でコロニーを固定します冷蔵庫で15分間、固定液を廃棄し、プレートを開いたままにして10分間乾燥させます。細胞を蒸留水で10分間再水和します。

ハリスヘマチン溶液を添加し、固定コロニーを12分間染色します。ヘマチン溶液を取り除き、プレートを水道水ですすいでください。残った染色液を消すため。

実体顕微鏡を使用して各コロニーの写真を撮り、jpegまたはTIFF形式のファイルをコンピューターにインポートします。画像Jソフトウェアで写真を開き、次のアニメーションに示すように、各コロニーの正確な細胞番号を分析します。画像Jソフトウェアを開き、プルダウンメニューのファイルオープン機能でコロニー画像をインポートします。

プロセスを使用して続行します。背景関数を減算します。画像Jメニューの楕円形またはブラシ選択機能を使用して、コロニーのマージンをマークします。

編集クリアアウトサイド機能を使用して周囲の画像をクリアし、画像の切り抜きを選択して画像をトリミングします。画像調整しきい値機能を使用してしきい値を手動で調整し、すべてのセルが完全に色付けされるようにします。赤い。を選択してコロニーのセル番号をカウントします。

分析、粒子を分析します。各セルタイプに最適化された適切な設定を選択し、[正しく実行された場合]を選択します。このプロトコルは、ヒト内皮細胞および間葉系前駆細胞の特性を共有する細胞の実質的に純粋な集団の単離を可能にし、これらは同じコードに由来するため互いに自家です。

5日目から、紡錘形の間葉系細胞が培養プレートに取り付けられたコード片の下から現れます。1〜2日後、前駆細胞または電子CFCを形成する内皮コロニーの最初のクラスターが倒立顕微鏡下で見えるようになります。この急速に成長するeCFCの巨大なコロニーは、11日後に形成されました。

MSCとEフロンはどちらも継代可能で、さらに拡張できます。その後、フローサイトメトリーを使用してすべての培養産物を分析し、適切な表現型を確認することをお勧めします。内皮系統と間葉系統の両方が、CD 73、CD 1 46、CD 29、およびCD 1 0 5に特異的な抗体に反応することに注意してください。

なお、MSCは大腿部を発現しており、これは抗CD90抗体を用いて検出されました。E CFCは、血小板内皮細胞接着分子またはpcamとも呼ばれるCD 31に対して陽性です。E CFCによるコードでのCD 34免疫反応性発現は、反復培養によって減少させることが十分に確立されています。

CD 45 H-L-A-D-R、および CD 14 などの血球マーカーは、両方の細胞型に対して陰性のままでした。E CFC間の前駆細胞の階層は、Image Jソフトウェアを使用して、各単一コロニーの正確な細胞数をカウントすることで評価できます。この手順を実行する際に、メイスとECEを人間の臍帯コードから分離、拡張、および分析する方法を示しました。

無菌状態で作業し、その後の研究で細胞を使用する前に表現型と純度を確認することが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。