蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

この技術では、ガラスカバースリップは、不活性ペグ分子とビオチンペグ分子の混合物で官能化されます。この機能化された表面でフローセルを作成し、芝生顕微鏡に載せます。ビオチン化ローリングサークルテンプレートは、多価ストレプトアビジンを使用して表面に付着します。

レプリゾーンタンパク質とヌクレオチドを添加して基質を複製すると、得られた二本鎖DNAは層流で伸長され、インターコレーティング色素を使用してリアルタイムでイメージングされます。こんにちは、ハーバード大学医学部生物化学・分子薬理学部のアントワーヌ・ヴァン・イアン研究室のネイサン・タナーです。同じくヴァンノイアン研究室のJoe Laroです。

本日は、DNA複製の蛍光イメージングを1分子レベルでリアルタイムに行う手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を用いて、個々の複製複合体の協調的なDNA合成活動を研究しています。それでは始めましょう。

この手順を開始するには、65°Cに加熱したTBSバッファーに10倍以上のオリゴを添加し、次にヒートブロックをオフにしてゆっくりと冷却し、プライマーを適切に精製することにより、ビオチン化テールオリゴをM 13一本鎖DNAに添加します。プライムM 13の準備ができたので、64ナノモルのT 7 DNAポリメラーゼとD NDPsおよび塩化マグネシウムを含むT 7複製バッファーの混合物にM13を添加し、37°Cで12分間反応をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、100ミリモルEDTAで急冷します。

次に、充填された製品DNAをフェノールイソアミルアルコールクロロホルムで精製し、TEバッファーまたは他の適切な保存バッファーに抽出して透析し、各有機相を逆抽出して、プライミングされた残留物を回収します。透析後のM 13は、UV/vis分光光度計でDNA濃度を測定します。テンプレート調製を1回繰り返すことで、数百から数千の単一分子実験に十分なナノモル濃度のテンプレートを作ることができます。

DNAの準備ができたので、官能基化カバースリップの準備に進みます。複製されるDNAは、Amil Laneで官能化されたガラスカバースリップに付着し、AmilのOxy基がガラスに結合し、ビオチン化ペグ分子に結合するためのアミンが残ります。このコーティングは、表面への非特異的な結合を減らすのに役立ちます。

ガラスカバースリップを完全に洗浄するには、それらを染色瓶に入れ、瓶にエタノール超音波処理剤を充填します。30分間、瓶を洗い流し、1モルの水酸化カリウムSonicateを30分間満たし、両方の洗浄を繰り返します。最初の官能基化反応では、微量の水をすべて除去する必要があります。

染色ジャーにアセトンを充填し、10分間超音波処理します。瓶を空にし、再びアセトンを入れます。サイン試薬を瓶に加え、2分間撹拌します。

次に、大量の水で急冷します。次に、カバースリップをオーブンで摂氏110度で30分間焼いて乾かします。次に、ガラスカバースリップスペーサーを含むインテーテッドペグで体積あたり約0.2%重量でPEG混合物を準備し、カバースリップの分離を可能にし、乾燥したサイロ化されたカバースリップに100マイクロリットルをピペットします。

2枚目のカバースリップを上に置きます。カバースリップをPEG溶液で3時間インキュベートします。次に、カバースリップの各ペアを分離し、水で広範囲に洗います。

カバースリップは機能化された面を上にして、片面のみがペグでコーティングされるため、注意してください。最後に、カバースリップを圧縮空気で乾燥させ、真空下で乾燥させて保存すると、表面は少なくとも1ヶ月間安定したままになります。そのため、数十枚のカバースリップを一括して作成し、必要に応じて使用できます。

カバースリップの準備ができたので、1つは1つの分子実験のための流動室を組み立てることができる。まず、BSAを含む20〜25ミリリットルのブロッキングバッファーを乾燥剤に入れて、後の手順で気泡を取り除きます。次に、25マイクロリットルのストレプトアビジンを100マイクロリットルのPBSに希釈し、溶液をペグの表面に広げます 室温で20分間インキュベートして、ストレプトアビジンが表面ビオチンに結合することを可能にするために、チャンバーの他の部分を準備します。

カバースリップをインキュベートしている間に、フローチャンバーの組み立てに使用した石英スライドのサイズと一致するように、両面に裏地が付いた両面テープをカットします。テープのチューブ穴の位置を鉛筆でマークして、フローチャンバーの輪郭をテープに描くことができるようにします。穴に印をつけた後、印の周りに幅2ミリメートルの長方形を作ります。

この長方形は流路として機能するため、チューブの入口と出口の周囲にはまっすぐな側面を作り、スペースを確保してください。次に、描かれたアウトラインに沿ってマークされたテープをカットし、接着剤がチャネルに突き出ないようにまっすぐにきれいにカットします。アセトンを使用してクォーツスライドを完全に洗浄し、以前の実験で使用したフローセル構造から接着剤を取り除きます。

チャネル アウトラインの最適な配置を見つけます。粘着性の裏地の片面をはがし、テープをコートスライドに慎重に置きます。入口と出口の穴が塞がれないようにする必要があるため、テープを適切に位置合わせするように注意してください。

次に、フローセルの入口と出口に0.76ミリメートルのチューブをカットするチューブを準備します。チューブの端を約30度の角度でカットして、チューブがチャンバーの底部に平らに押されないようにするのに役立ちます。チューブを試験管ラックに吊り下げて、次のステップでフローセルに簡単に取り付けられるようにします。

これで、カバースリップのインキュベーションは終了しました。連鎖球菌の熱心なENCコーティングされたカバースリップを水で十分にすすぎ、圧縮空気を使用して乾かします。カバースリップをひっくり返さないように注意してください。

最後に、テープの裏地の反対側を取り外し、クォーツスライドをカバースリップに載せて、フローチャンバーの組み立てを完了します。カバースリップを軽く押して、接着剤に溜まった空気を押し出します。これにより、気泡が流路に入るのを防ぐことができます。

チャンバーの側面をエポキシで密封します。カットしたチューブを石英の穴に挿入し、エポキシで所定の位置に密封し、数分間乾かします。エポキシシールが乾いたら、表面のブロッキングを開始します。

21ゲージの針を使用。Degas ブロッキング バッファーの一部をチューブの 1 つに通します。数回フラッシュアウトして気泡を取り除き、チャンバーを少なくとも30分間インキュベートしてから、単一分子の複製に移ります。実験。

フローセルが詰まったので、顕微鏡ステージに置きます。ステージクリップでチャンバーを所定の位置に保持し、流路がy軸に沿って位置合わせされていることを確認します。大径のコネクタチューブを使用して、フローセル出口チューブをシリンジポンプに接続します。

インレットをブロッキングバッファーに入れ、シリンジを引き戻してチューブ内の空気を取り除きます。アウトレットチューブを軽くフリックすると、フローセルに閉じ込められた気泡を取り除くのに役立ちます。次に、DNAを添加し、ストックDNAテンプレートを1ミリリットルのブロッキングバッファーフローで25ピコモルに希釈し、0.025ミリリットル/分などの中程度の流量でチャンバーに30分間注入し、DNAの表面を良好にカバーできるようにします。

DNAがチャンバーに入ったら、ブロッキングバッファー洗浄を使用して余分なDNAを少なくとも200フローセルの量で洗い流します。すべての空きDNAを取り除くには、レーザーとカメラの電源を入れます。冷却されたCCDは、使用する前に温度に達する必要があります。

余分なDNAを洗い流し、複製バッファーを脱気した後、複製反応ミックスヌクレオチドDTTとサイトキシンを複製バッファーに調製します。次に、タンパク質を加えて穏やかに混ぜます。次に、反応混合物をフローセルに流します。

ここでの流速は、二本鎖DNAを幅2ミリメートルに伸ばすのに十分な速度である必要があります。高さ100マイクロメートルの流路は毎分0.04ミリリットルで十分です。混合物がチャンバーに入るまで約10分待ちます。

視野をチャンネルの側面に移動し、接着剤に焦点を合わせて、ピントを合わせ、イメージングを開始するために1つが表面近くにあることを確認します。レーザーパワー顕微鏡の焦点と芝の角度を調整します。染色されたDNAの光切断を避けるために、検出力を低く保ちます。

DNA複製の速度に応じて、毎秒1〜5フレームで数分間取得します。これを繰り返して複製の軌跡を長くしたり、新しいフィールドに移動してより多くの分子を確認したりします。ほぼすべての反応混合物が細胞フローに送り込まれ、他の視野を見るためにcytでより多くのバッファーが流れます。異なる複製された分子の複数の画像を撮影すると、生産性を決定するための統計が得られます。

ローリングサークルで。強度合成をリードする複製アッセイは、円と表面をつなぐ尾部を拡張し、尾部は遅れ鎖ポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、層流によって引き伸ばされます。これは、532ナノメートルの励起でcytオレンジ色の視野の例です。

小さな蛍光スポットは、複製されていない基質につながれています。製品の長さが極端に長く、フィールドあたりの製品数が多いことに注意してください。典型的な視野では、37°Cで染色されたDNAE大腸菌実験の成長する明るい線として見える多数の複製分子が、表面密度に応じてフィールドごとに5〜50分子を与えることがわかります。

T seven replaゾーンは、はるかに効率的に開始し、フィールド内の分子の50%以上を複製します。このような高密度では、ここで見るように個々の分子を分離することは困難です。したがって、低タンパク質濃度または表面密度でT 7実験を実行します 大腸菌からの典型的な複製分子のChimeグラフ T 7実験には、大腸菌からの分子のエンドポイント軌道が含まれ、T 7は、軌道が線形回帰で適合されている時間に対してプロットされ、この例では、大腸菌は毎秒467.1塩基対、毎秒99.4塩基対です。

T 7 の場合、1 つのガウス分布に適合する単一分子軌跡の速度分布は、大腸菌で 1 秒あたり 535.5 プラスマイナス 39 塩基対/秒、1 秒あたり 75.9 プラスマイナス 4.8 塩基対になります。T sevenの場合、複製産物の長さ分布は、生産性を得るために単一の指数関数的減衰に適合します(大腸菌では85.3プラスマイナス6.1キロベースペア、Gセブンでは25.3プラスマイナス1.7キロベースペア)。次に、単一分子との協調DNA複製を測定する方法を示しました。

この手順を実行するときは、カバースリップを適切に機能化し、きれいな直線流路を作ることを覚えておくことが重要です。レーザー出力の負荷を維持し、長いDNAの光の切断を最小限に抑えるようにしてください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。