Name: 蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: 学ぶ単分子蛍光顕微鏡法によるDNA複製の可視化手法。機能化ガラスカバースリップとフローセルを用いて、個々のレプリソームによるリアルタイムDNA合成を観察する方法です。

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サミールハムダンは、この技術の開発に支援。E.を大腸菌のタンパク質は、教授ニックディクソンの研究室からウーロンゴン大学であり、T7タンパク質は、教授チャールズリチャードソン、ハーバードメディカルスクールからです。作品は、国立衛生研究所（AMvOにGM077248）とジェーン棺チャイルズ財団（JJL）によってサポートされています。

単一分子の複製の実験を行う前に、いくつかの材料は、事前に準備する必要があります。 1。 DNA複製のテンプレート複製反応の基質は、標準的な分子生物学技術の1,2を用いて調製したビオチン化、両側M13ローリングサークルです。 材料：M13mp18一本鎖DNA、ビオチン尾のオリゴヌクレオチドプライマー（5&#39; -ビオチン- T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT - 3&#39;）、T7 DNAポリメラーゼ、ヒートブロック、アミルフェノール/アルコール/クロロホルム<ol><li> TBSバッファー（330 nMの尾オリゴ、33 nMのM13）のオリゴの10倍過剰を追加することでM13にビオチン尾オリゴをアニール。 </li><li>混合物に65℃のヒートブロックで加熱する。一度加熱し、ヒートブロックをオフにし、徐冷が適切にプライマーをアニールすることができます。 </li><li> 64 nMのT7 DNAポリメラーゼやdNTPおよびMgCl 2を含有する T7レプリケーションバッファの混合物にプライミングM13を追加。 </li><li> 12分間37℃で反応をインキュベートし、100mMのEDTAで急冷。 </li><li>精製記入済みの製品のDNAフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出し、TE緩衝液または他の適切な保存バッファーに透析し、DNA濃度（M13をプライム、残留を回復するために、各有機相を逆抽出）を決定した。 </li><li>テンプレートの準備の1回の繰り返しは容易に単一分子実験の数百〜数千のために十分な、ナノモル濃度のテンプレートのいくつかのミリリットルを行うことができます。 </li></ol> 2。官能化されたカバーグラスガラスのカバースリップにDNAを取り付けるために、ガラスはまずビオチン化PEGの分子に結合されてアミノシラン、で官能れる。このコーティングは、表面1,3とDNAと複製タンパク質の非特異的な相互作用を低減することができます。 材料：ガラスのカバーガラス、染色瓶、3 -アミノプロピルトリエトキシシラン、メトキシPEG5k - NHSエステル、ビオチン- PEG5k - NHSester、アセトン、1M KOH、エタノール、オーブン、バス音波処理<ol><li> jarファイルを染色し、エタノールで瓶を充填に配置することにより、ガラス製カバースリップを徹底的に清掃してください。 30分間超音波洗浄し、瓶を洗浄し、1 M KOHで埋める。両方の洗浄を繰り返して30分間超音波洗浄器にかけます。 </li><li>第一機能化反応の場合は、水のすべての痕跡を削除する必要があります。 10分間アセトンと超音波処理してjarを埋める。アセトンで再びjarをすすいでください。 </li><li>アセトンでシラン試薬の2％v / v溶液を準備します。染色瓶に追加し、2分間振とうする。この反応は、カップルガラスにアミノシランのアルコキシ基を、次のカップリングステップの反応性アミンを残して。水の大過剰の反応をクエンチ。 </li><li> 110℃で30分間オーブンで焼成することによってカバースリップを乾かします。 </li><li> 100mMのNaHCO 3で pHを8.2にビオチンPEGの混合物：50:1メトキシを準備します。約0.2％w / vのビオチン化PEGを目指す。 </li><li>乾燥したシラン化カバースリップと場所の上に別のカバースリップ上にPEG混合物の100μL添加します。ガラスのカバースリップのスペーサーを含めると、カバースリップの分離が可能になります。 </li><li> 3時間のPEG溶液中でカバーグラスをインキュベートし、カバーガラスの各ペアを分離し、水で広範囲に洗ってください。一度だけの側として側を上に官能カバースリップがPEGでコーティングされるように十分注意してください。 </li><li>真空下でカバースリップとストアを乾かします。表面は、少なくとも月には安定なので、カバースリップの数十はバッチで行われ、必要に応じて使用することができます。 </li></ol>これらの材料は、事前に行われ、その後、各実験に使用する必要があります。すべての単一分子実験を開始するには、フローチャンバーを組み立てることから始めます。 3。フローチャンバーの準備実験は、官能カバー、両面テープ、石英スライドとチューブで構成されたシンプルなフローチャンバーを使用して実行されます。つのフローチャンバーは、それぞれの単一分子実験1,4のために準備されます。 材料：両面テープ、レーザーブレード、チューブ、クイックドライエポキシ用の穴を持つ石英スライド、官能カバースリップ（上記参照）、ストレプトアビジン溶液（PBS中の1 mg / mLの25μL）、チューブ、ブロッキング緩衝液（20mMトリスpH7.5、2mMのEDTA、50mMのNaCl、0.2 mg / mLのBSA、0.005％のTween - 20） <ol><li>後の手順については、気泡を除去するデシケーター中でブロッキングバッファーの20-25 mLを置くことによって始めます。 </li><li>表面上のPBSに希釈したストレプトアビジン液のPEG -官能化されたカバースリップと広がり125を取る。ストレプトアビジンは、表面のビオチンを結合させること、チャンバーの他の部分を準備しながら20分間インキュベートするために、このままにしておきます。 </li><li>ダブルサイドの部分をカットdは、テープ石英スライドのサイズを一致させる。フローチャンバーの概略をテープ（1 mg / ml）の上に描画できるように、鉛筆とテープ上のチューブの穴の位置をマークします。 </li><li>穴の周囲2mmの幅の長方形を作る。これは、流路として機能するので、チューブの入口と出口の周りにストレート側面を作り、部屋を出るようにしてください。必要に応じて、複数のチャネルまたは異なるサイズを使用することができます。 </li><li>チャンネルに無接着剤突出していることを確認してまっすぐ、きれいな削減を行って、描かれた輪郭に沿ってカット。 </li><li>徹底的に前のフローセルの構造から接着剤を除去するためアセトンまたはエタノールを用いて石英を清掃してください。 </li><li>チャンネルの概略の最高のアラインメントを見つける、粘着の片側を取り外し、慎重に石英スライドの上にテープを配置。入口と出口の穴がブロック解除を維持する必要があるとして、適切にテープを揃えるように注意してください。 </li><li>フローセルの入口と出口のためにチューブの長さをカット。それは、チューブがチャンバーの底部に対して平らに押ししないように約30 °の角度でチューブの端をカットするのに役立ちます。次のステップでフローセルに簡単に添付ファイルのためにそれらを中断するためのサポートのいくつかの並べ替えにチューブを置きます。 </li><li>水で十分ストレプトアビジンでコートしたカバースリップをリンスし、圧縮空気を用いて乾燥させる。片側のみに官能されていることを思い出してください。カバーを裏返しにしないように注意してください。テープの裏の反対側を外し、カバーグラスの上に石英スライドを配置。 </li><li>軽く接着剤に閉じ込められた空気を押し出すためにカバースリップを押してください。これは、流路に入る気泡を防ぐことができます。 </li><li>エポキシ樹脂とチャンバーの両側をシール。エポキシ樹脂と場所の石英とシールの穴にカットチューブを挿入します。これには数分間乾燥させる必要があります。 </li><li>一度乾燥、真空管のいずれかを使用して脱気ブロッキングバッファーの一部を引っ張って表面をブロッキングを開始。 21ゲージの針は0.76 mmのチューブの内部に完全に適合しています。気泡を除去するために数回はフラッシングを行ってください、とチャンバーは少なくとも半時間インキュベートすることができます。 </li></ol> 4。単一分子の複製実験 材料：準備されたフローチャンバー、SYTOXオレンジ、全反射顕微鏡、532nmのレーザー、CCDカメラ、画像取得ソフトウェアとコンピュータ、ローリングサークルDNA基質、複製タンパク質<ol><li>フローセルがブロックされた後、すべてが単一分子実験を開始する準備が整いました。 </li><li>フローセルを取ると、顕微鏡のステージ上に置きます。ステージのクリップのある場所でチャンバーを持ち、流路が直線y軸に沿って配置されていることを確認してください。 </li><li>より大きな直径のコネクタチューブや注射針を使用してシリンジポンプにフローセルの出口管を接続します。ブロッキング緩衝液で口を配置し、チューブ内の空気を除去するために注射器を後方に引いて。出口管の穏やかな映画は、フローセル内に閉じ込められた気泡をクリアするのに役立ちます。 </li><li>ブロッキング緩衝液1mLに25午後の株式DNA鋳型を希釈する。 DNAの良好な表面被覆率を可能にするために適度な流量でチャンバーに流入。 30分間0.025 mL / minではうまく動作します。これは、カバースリップまたはどのように多くの実験のために望まれているのバッチごとに表面にどのように多くのDNA分子に基づいて変化させることができる。 </li><li> DNAがになると、ブロッキング緩衝液を使用して余分なDNAを洗浄。すべての遊離DNAを取り除くために少なくとも200フローセルボリューム用洗浄する。 </li><li>レプリケーションバッファを脱始める。 E.用大腸菌の複製実験、37℃でこれを行う° C加熱されたフローチャンバーで泡のリスクを軽減する。 </li><li>レーザーとカメラの電源を入れます。冷却CCDは、それが使用できる前に温度に到達する必要があります。 </li><li> 37℃の実験を行う場合、上ヒーターの電源を入れます。目的は、フローセルに接触しているか、後でヒートシンクになることを確認してください。 </li><li>洗濯して脱気した後、反応を調製することができる。ミックスヌクレオチド、DTT、およびレプリケーションのバッファにSYTOX。その後、タンパク質を加え、穏やかに混合する。 </li><li>フローセルに反応混合物を流し込む。この流れの速度は、dsDNAを伸ばすのに十分である必要があります。 2 mm幅、100μmの背の高い流路の場合は0.04 mL / minではうまく動作します。 </li><li>混合チャンバーを入力し、イメージングを開始するための時間を確保します。良いヒントは、チャネルの側面に視野を移動し、接着剤に焦点を当てることです。これは、収束するための表面の近くにあるようにします。 </li><li>レーザパワー、顕微鏡のフォーカス、および全反射の角度を調整します。ステンドDNAの任意のphotocleavageを避けるために、低消費電力を維持する。 DNA複製の速度に応じて、数分間の手順1-5フレーム/秒で取得する。必要に応じて、より長いレプリケーション軌跡を得る以上の分子を見るために新しいフィールドに移動するには繰り返す。 </li><li>反応混合物がほとんど空になった後、それはSとより多くのバッファに流れるように良いアイデアです。ビューの他のフィールドを参照するYTOX。別の複製された分子の複数の画像を取ることはprocessivityの決定のための統計情報を提供します。 </li></ol> 5。代表的な結果積極的に複製する分子が容易に染色されたDNAの成長線として見られている。我々の実験では、M13基板25 PMを流れると、ビューの60倍、125μmの× 125μmのフィールド（図1）で100から1000までの分子を与える。 E.を使用して、レプリケーションの実験を行う37 ° C（詳細は資料を参照）で大腸菌 replisomeタンパク質は、視野当たり50から50を複製する分子が得られます。はるかに効率的に基板上に開始するT7 replisome、同等の濃度では、我々はフィールドの複製の分子の&gt; 70％を観測。これらの条件は、個々の分子が解決し、分析することが困難であることが非常に高く、製品の密度を得るため、T7の実験は、より低いタンパク質濃度で実行されます。 データ解析：率のデータを取得するには、単にDNA対時間のエンドポイントをプロットし、傾き（図2）を計算する。 processivityの場合は、DNAの全長を決定する。これらの数字の両方が塩基対に変換する必要があります。実験を行う前に、適切な倍率でカメラのピクセルサイズを知っている必要があります。塩基対の変換、良好な推定のために単に2.9 BP / NM、DNAの結晶長さに基づいて変換しています。しかしながら、層流が完全にDNAを伸ばししません、DNAの長さのキャリブレーションは、既知の長さのDNA、例えば、48502 bpのλDNAを取ってビオチン化オリゴとフローセルに装着し、で、そのSYTOX染色した長さを測定することによって実行する必要がありますので、複製の実験に使用する流量。塩基対/ピクセルの数を決定する複製率とprocessivitiesの正確な計算が可能になります。多数の画像や動画を取ることは速度とprocessivity分布（図2）1のプロットできるように、製品の分子の多数を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：（文献から1。）ローリングサークル複製アッセイの）漫画。 （SA、ストレプトアビジン）。リーディング鎖合成は、円と表面を結ぶ尾を拡張します。尾は、ラギング鎖のポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、層流によって引き伸ばされている。 SYTOXオレンジと532nmの励起とビューのb）の例のフィールド。小さな蛍光スポットが繋留、非レプリケート基質である。製品の極端な長さと、フィールドごとの製品（各フローセル&gt; 5000そのようなフィールドを含む）の数が多いことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：T7（）とEからの典型的な複製の分子の（。文献から適応1）、b）のKymographs 大腸菌 （b）の実験。 C））とb）から分子のエンドポイントの軌跡は、時間に対してプロット。軌道は、レプリケーションの速度を得るために線形回帰が取り付けられています。示した例は99.4塩基対s -1とし、467.1 bpのs -1となります。 D）長さレプリケーション製品のディストリビューション、processivityを得るために、単一の指数関数的減衰に合う：25.3 ± 1.7 kbpの（T7）、85.3 ± 6.1 kbpの（ 大腸菌 ）。 e）は、単一の分子軌道の速度分布は、単一ガウス分布でフィット。手段：75.9 ± 4.8 BPの-1（T7）、535.5 ± 39 BP s -1の（ 大腸菌 ）。

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

一つの重要な制御は、関心の複製蛋白質で、汚れ、SYTOXオレンジの効果を検討している。これを行う簡単な方法は、前述のようにフローセルではなくSYTOXの省略を使用したレプリケーションの実験を行うことです。反応混合物は、チャンバを通って流入した後、DNAを染色し、複製された分子の長さの分布を調べるためにSYTOXでバッファを追加します。また、標準的なバルクの反応は、レプリケーションの速度と効率上SYTOXの任意の効果を確認するために使用することができます。 ここで説明する実験は、単一の流路を使用しています。これは、マルチチャネルのフローチャンバーを作成またはPDMSまたは類似のマイクロ流体デバイスを用いて容易に変更することができます。チャネルの数を増やすと、大幅にタンパク質濃度、変異体、または阻害剤の分子のスクリーニングを容易にし、レプリケーションデータ収集の迅速性を向上させます。 前述のとおり、我々はE.を行います37 大腸菌の複製実験° C、自作アルミフローセルのヒーター、抵抗加熱要素（カートリッジヒーター）と可変電源を使用する。これにより、良好な温度安定性を与え、客観的なヒーターの購入を避けることができます。ヒーターを校正するために、我々は、単に、石英フローセルの上部の中央に穴をあけ流路に熱電対を挿入し、通常どおりバッファを流れた。増加する電圧でフローセルのバッファの温度を測定することは、正確な加熱が可能になります。

T7レプリケーション ：5mMジチオスレイトールと40mMのトリスpH7.5、50mMのグルタミン酸カリウム、10mMの塩化マグネシウム、100μg/ mlのBSA、、600μMのdNTP、300μMATP、300μMのCTP、および15nmのSYTOXオレンジは、直前に追加使用してください。 5nMのGP4（量体）、40 nMのポリメラーゼ（1:1 gp5をサポート：：チオレドキシン）、360 nmのgp2.5 1,5タンパク質として追加しました。 大腸菌の複製：50mMのHEPES pHは7.9、12mMの酢酸マグネシウム、80mMの塩化カリウム、10mMのジチオスレイトールとの100μg/ mLのBSA、40μMのdNTP、200μMrNTPs、および15nmのSYTOXオレンジは、使用直前に加える。タンパク質は、追加として：30 nMのDnaB（量体）、180 nMのDnaC（モノマー）、30 nMのαεθ、15nmのτ2γ1δδ&#39;χψまたはτ3δδ&#39;χψ、30nmのβ（ダイマー）、300 nMのDnaG、250 nMのSSB（四量体）、20nMのPRIA、40 nMのPriB、320nmのPriC、480nmのDNAT 1,6

蛍光顕微鏡による可視化単分子のdnaの複製

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

我々は、単一分子レベルでのDNA複製を観察するためのシンプルな蛍光顕微鏡ベースのリアルタイム方法を説明します。環状、分岐したDNAテンプレートは、官能ガラスのカバースリップに結合し、複製タンパク質とヌクレオチド（図1）の導入後に広範囲に複製されます。成長している製品の二本鎖DNA（dsDNAが）層流で拡張し、インターカレート色素を用いて可視化される。リアルタイムで成長しているDNAの端の位置を測定することにより、レプリケーションの速度（図2）を正確に決定することができます。さらに、完成したDNA産物の長さは複製のprocessivityに報告します。この実験は非常に容易かつ迅速に実施し、合理的に高感度カメラでのみ蛍光顕微鏡を必要とすることができます。

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

単一分子レベルでDNA複製を観察するための、蛍光顕微鏡を用いた簡便なリアルタイム法について解説します。環状のフォーク状DNAを...

この手法では、不活性なPEG分子とビオチン化PEG分子の混合物を用いて、ガラスカバースリップを機能化します。この機能化された表面を用いてフローセルを作製し、TIRF顕微鏡上に設置します。次に、多価ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化されたローリングサークルテンプレートを表面に結合させます。repli zoneタンパク質とヌクレオチドの添加により基質が複製されると、得られた二本鎖DNAは層流によって伸長され、インターカレーション染料を用いてリアルタイムでイメージングされます。ハーバード大学医学部生物化学・分子薬理学部のAntoine Van Nostrand研究室のNathan Tannerです。同じくVan Nostrand研究室のJoe Laroです。本日は、単一分子レベルでのDNA複製をリアルタイムで観察する蛍光イメージングの手法について解説します。当研究室では、個々の複製複合体による協調的なDNA合成活性を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。本手順を開始するために、TBSバッファー中で10倍量のオリゴを加え、65 °Cまで加熱した後、ヒートブロックの電源を切って徐冷させることで、ビオチン標識テイルオリゴをM 13一本鎖DNAにアニールさせます。プライマーをアニールさせたM 13が準備できたら、これをdNTPsと塩化マグネシウムを含むT7複製バッファーおよび64 nMのT7 DNAポリメラーゼの混合液に加え、反応液を37 °Cで12分間インキュベートします。インキュベーション終了後、100 mM EDTAで反応を停止させます。次に、充填された産物DNAをフェノール・イソアミルアルコール・クロロホルム抽出で精製し、TEバッファーまたはその他の適切な保存バッファーで透析します。各有機相を逆抽出して、残留しているプライミング済みM13を回収してください。透析後、UV-vis分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。テンプレート調製を1回行うことで、数百から数千回の単一分子実験に十分なナノモーラー濃度のテンプレートを作製することが可能です。DNAの準備が整いましたので、機能化カバーガラスの作製に進みます。複製されるDNAは、Amil Laneで機能化されたガラスカバーガラスに結合させます。AmilのOxy基がガラスに結合し、アミノ基がビオチン化PEG分子との結合に利用可能な状態で残ります。このコーティングにより、表面への非特異的結合を低減させることができます。ガラスカバースリップを十分に洗浄するため、染色瓶に入れてエタノールを満たし、30分間ソニケーションします。その後、瓶の中をすすぎ、1 M 水酸化カリウム溶液を満たして30分間ソニケーションします。これら両方の洗浄工程を繰り返します。最初の機能化反応を行う前に、すべての水分を完全に除去する必要があります。染色瓶にアセトンを満たし、10分間超音波処理します。瓶の中身を捨て、再びアセトンを満たします。続いて、染色瓶にsine試薬を加え、2分間撹拌します。次に、大過剰の水でクエンチします。その後、カバーガラスをオーブンで110 °Cで30分間加熱して乾燥させます。次に、約0.2% w/vのPEG混合液を調製します。ガラスカバーガラススペーサーを含めることでカバーガラスを分離させることができ、乾燥したシリライズドカバーガラス上に100 µLをピペットで滴下します。2枚目のカバーガラスを上に重ねます。カバーガラスをPEG溶液中で3時間インキュベートします。その後、カバーガラスのペアをそれぞれ分離し、水で十分に洗浄します。PEGがコーティングされているのは片面のみであるため、カバーガラスの機能化された面を上に向けて保持するように注意してください。最後に、圧縮空気でカバーガラスを乾燥させ、デシケーター内で真空保存します。表面は少なくとも1か月間は安定したまま維持されます。したがって、一度に数十枚のカバーガラスを作製し、必要に応じて使用することが可能です。カバーガラスの準備が整いましたので、単一分子実験用のフローチャンバーを組み立てます。まず、後の工程で気泡を除去するため、BSAを含むブロッキングバッファー 20～25 mLをデシケーターに入れます。次に、25 µLのストレプトアビジンを100 µLのPBSで希釈し、PEG修飾されたカバーガラスの表面に溶液を広げます。チャンバーの他の部品を準備している間に、ストレプトアビジンが表面のビオチンに結合するように、室温で20分間インキュベートします。カバーガラスのインキュベーション中に、フローチャンバーの組み立てに使用した石英スライドのサイズに合わせて、両面に剥離紙がある両面テープをカットします。フローチャンバーの輪郭がテープ上に描けるよう、チューブ穴の位置を鉛筆でテープにマークします。穴の位置をマークした後、その印の周囲に幅2 mmの長方形を描きます。この長方形が流路となりますので、側面を直線的にし、チューブの入口と出口の周囲に十分なスペースを確保してください。次に、描いた輪郭に沿って印を付けたテープを切り、接着剤がチャネル内に突き出さないよう、直線的にきれいにカットします。アセトンを使用して石英スライドを徹底的に洗浄し、以前の実験で使用したフローセルの構築時に付着した接着剤を除去してください。チャンネル外形の最適な位置を確認します。粘着面の一方の剥離紙を剥がし、コートスライドの上にテープを慎重に貼り付けます。入口および出口の穴が塞がらないよう、テープの位置を正確に合わせることに注意してください。次に、フローセルの入口および出口に使用する0.76 millimeterのチューブを適切な長さに切断して準備します。チューブの端を約30度の角度で切断すると、チューブがチャンバーの底に押し付けられて平らになるのを防ぐことができます。次以降のステップでフローセルに簡単に取り付けられるよう、チューブを試験管ラックに吊るしておきます。これでカバーガラスのインキュベーションが完了しました。ストレプトアビジンENCコーティングされたカバーガラスを水で十分に洗浄し、圧縮空気を用いて乾燥させます。機能化されているのは片面のみであるため、カバーガラスを裏返さないように注意してください。最後に、テープの裏面のもう一方を剥がし、クオーツスライドをカバーガラスの上に配置して、フローチャンバーの組み立てを完了させます。カバーガラスを軽く押し、粘着剤に閉じ込められた空気を押し出します。これにより、フローチャネル内に気泡が混入するのを防ぐことができます。エポキシ樹脂を用いてチャンバーの側面を密封します。切断したチューブを石英の穴に挿入し、エポキシ樹脂で固定して数分間乾燥させます。エポキシ樹脂の密封が完了したら、表面のブロッキングを開始します。21ゲージの針を使用します。Degasブロッキングバッファーをチューブのいずれかから吸い上げます。気泡を取り除くために数回フラッシュし、単一分子複製実験に進む前に、チャンバーを少なくとも30分間インキュベートしてください。フローセルを封止したので、顕微鏡ステージ上に配置します。ステージクリップでチャンバーを固定し、フローチャネルがy軸に沿って配置されていることを確認してください。フローセルの流出口チューブを、より大径のコネクターチューブを用いてシリンジポンプに接続します。インレットをブロッキングバッファーに浸し、シリンジを引いてチューブ内の空気を除きます。アウトレットチューブを軽く弾くと、フローセル内に閉じ込められた気泡を除去しやすくなります。次にDNAを添加します。ストックDNAテンプレートをブロッキングバッファーで25 picomolarに希釈し、1 milliliter分を、DNAが表面を十分にカバーできるよう、0.025 milliliters per minuteなどの適度な流速で30分間チャンバー内に流します。DNAをチャンバーに導入した後、ブロッキングバッファーを用いて、フローセル容積の少なくとも200倍量で過剰なDNAを洗い流します。遊離DNAを完全に除去するため、レーザーとカメラをオンにします。冷却CCDは、使用前に設定温度に達する必要があります。過剰なDNAを洗い流し、複製バッファーの脱気を行った後、ヌクレオチド、DTT、cytoxin、および複製バッファーを用いて複製反応混合液を調製します。次に、タンパク質を加えて穏やかに混合します。その後、反応混合液をフローセルに流します。ここでの流速は、幅 2 mm、高さ 100 µm のフローチャネル内で、2本鎖 DNA を伸長させるのに十分である必要があります。0.04 mL/min が適しています。混合液がチャンバーに流入するまで、約 10 分間の時間を設けてください。視野をチャネルの側面に移動させ、接着剤にピントを合わせることで、フォーカシングのための表面近辺に位置していることを確認し、イメージングを開始します。レーザー強度、顕微鏡のフォーカス、およびturf angleを調整してください。染色されたDNAの光切断を避けるため、レーザー強度は低く維持してください。DNA複製の速度に応じて、1秒間に1〜5フレームの速さで数分間撮影します。より長い複製軌跡を得るにはこの操作を繰り返し、反応混合物のほぼすべてが細胞内に注入された場合は、cytを含むバッファーをさらに流して新しい視野に移動し、より多くの分子を観察します。異なる複製分子の画像を複数撮影することで、生産性を決定するための統計データを得ることができます。ローリングサークル複製アッセイにおいて、リーディング鎖の合成により、サークルと表面を連結するテールが伸長します。このテールは、ラギング鎖ポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、図に示すように層流によって引き伸ばされます。ここでは、532 nanometerでの励起によるCy3 orangeの視野例を示します。小さな蛍光スポットは、係留された未複製の基質です。産物の極めて長い長さと、1視野あたりの産物の多さに注目してください。典型的な視野では、染色されたDNAが明るい線として伸長していく、多数の複製分子が観察されます。37 °CでのE Coli実験では、表面密度に応じて、1視野あたり5〜50個の分子が観察されます。T7複製領域はより効率的に開始され、視野内の分子の50%以上が複製されます。これほど高密度になると、ここで見られるように個々の分子を識別することが困難になります。そのため、T7の実験はより低いタンパク質濃度または表面密度で実施してください。E. coliおよびT7実験における典型的な複製分子のChimeグラフには、時間に対するE. coliおよびT7分子のエンドポイント軌跡が含まれています。これらの軌跡を線形回帰でフィッティングして複製速度を算出しており、この例ではE. coliが467.1 base pairs per second、T7が99.4 base pairs per secondとなっています。T7について、単一分子トラジェトリの速度分布を単一ガウス関数でフィッティングした結果、平均速度はe coliで535.5 ± 39 base pairs per second、G7で75.9 ± 4.8 base pairs per secondとなりました。T7における複製産物の長さ分布は、単一指数関数減衰でフィッティングして生産性を算出したところ、e coliで85.3 ± 6.1 kilobase pairs、G7で25.3 ± 1.7 kilobase pairsとなりました。以上で、単一分子を用いた協調的DNA複製の測定方法について説明しました。この手順を行う際は、カバーガラスを適切に機能化し、クリーンで直線的なフローチャネルを作成することが重要です。レーザー出力は低く抑え、長いDNAの光切断を最小限にするようにしてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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