Name: アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶ 分析用超遠心機のサンプルセル組み立て法。ウィンドウアセンブリとセンターピースの正確な配置、トルク管理、バランス調整の技術を習得し、精密な生体分子分析実験の再現性を高める。

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我々は、NIBIB、NIHの学内研究プログラムで研究支援を認める。

サンプルセルアセンブリとトルク<ol><li>我々は、2つのウィンドウのアセンブリを一緒に置くことによって、試料セルの建設を開始。 ウィンドウホルダーにウィンドウのガスケットを置きます。ライナーの開口部がホルダーのキー溝の反対側になるようにウィンドウのホルダー内のウィンドウのライナーを（または、それが時々窓のクッションと呼ばれる）に置きます。少し傾けて、ウィンドウのホルダーのキーの方法でウィンドウ上のスクライブマークを合わせてホルダーにウィンドウを配置します。ウィンドウの両側に非常に端に軽く下に押します。 </li><li>適切なシールとサンプルセルの正確なトルクを確保するために、我々軽くコートSpinkote潤滑剤付き住宅のガスケットとねじリング。親指と人​​差し指の間にSpinkoteの非常に少量を広げる。 Spinkoteの薄い、目に見えない薄膜でコーティングスクリューリングスレッドを。同様に、コートハウジングガスケットを。目に見える潤滑剤を拭き取ってください。 </li><li>住宅のキーでキー溝を合わせてセルのハウジング内に、ウィンドウを手前上に向けて、つのウィンドウのアセンブリをスライドさせて、試料セルのアセンブリを開始します。住宅の鍵で目玉のキー溝を合わせ、静かに細胞内でウィンドウアセンブリの上に落としてください。 </li><li>セルのハウジング内に中心をプッシュするためのツールの任意の並べ替えを使用しないでください。これは、実験中にリークが発生CPに永久的な損傷を引き起こす可能性があります。ウィンドウは、あなたから離れて、中心に向かって直面しているように、2番目のウィンドウアッセンブリを回し、住宅の鍵とキー溝を合わせ、センターピースの上にそれを下にスライドさせます。単語&quot;アウト&quot;が表示されるように、その後、上部のネジリングをハウ​​ジングのガスケットを置きます。あなたの指とアライメントツールを使用して、手はスクリューリングを締め付けます。 CPは、住宅のバレルに簡単にスライドしない場合は、最初にそれを合わせ、その後、それの上に別のウィンドウのアセンブリを配置します。ウィンドウアセンブリの穏やかな下方圧力を適用することによって、同時にセルのハウジング内に両方をスライドさせます。このように、我々は、CPで直接押すことは避けてください。 今は埃、糸くずや指紋のセルの内部を見るのに良い時期です。また、CPと窓の間に空気が残っていることを示すニュートンリングに気づくでしょう。これらは、トルクを適用した後に消えます。 </li><li>ネジのリング上と目に見える&quot;アウト&quot;という言葉で、トルクのスタンドのセルトルクコレット内部試料セルのすべての方法を下にして置かない。トルクのスタンドのハンドルを一定の圧力を適用することによって所定の位置にセルを保持する。つの連続した​​動きで、ポンドで120から140の間にネジリングを締め付けます。調整可能なマイクロメータのトルクレンチを使用している場合は、/ポンドで120から140の間にそれを設定し、設定トルクに達したことを示すレンチ&quot;クリック&quot;するまで、ねじリングを締め付けます。トルクのスタンドのハンドルを解放し、慎重に窓を触れることなく、試料セルを削除します。 </li></ol>サンプルセルのロードとシーリング<ol start="6"><li>沈降速度の実験のために、我々は日常的に200ulのピペットを使用して12ミリメートルセンターピースの各部門に400ulのボリュームをロードする。トップと目に見えるネジのリング上で&quot;アウト&quot;という言葉で読み込む穴に試料セルを配置します。ロードの穴を通して左中心の部門にピペットチップを半押しスライドさせ、徐々に標準溶液の200ulを分注する。 400ulを合計して一回繰り返します。同じピペットチップと同じテクニックを使用して、慎重にゆっくりと試料溶液の400ulとRIGHT目玉分野を埋める。 150から180 ULのボリュームは、沈降平衡実験に使用されますが、同じ注意とテクニックに従ってください。 それは、できる限り緊密にリファレンスとサンプルソリューションのボリュームと一致することが不可欠です。ローディングバブルを回避し、両方のソリューションをできるだけ均等にボリュームを維持するのにすべての援助のために同一のピペットチップを使用して、徐々にソリューションをロードし、調剤、しっかりとピペットにピペットチップの取り付け。 </li><li>彼らはセンターピースとアルミ製のハウジングとの間に配置されていることを確認し、各荷重の穴にぴったりと2つの新しい赤い住宅のプラグのガスケットを配置することにより、セルをシール。住宅のプラグをそれぞれカバー。手には小型のマイナスドライバでネジを締めます。 </li></ol>ローターのサンプルセル配置<ol start="8"><li>ローターをロードする前に、対抗勢力がそのサンプルセルのリーク場合に対向する位置に試料セルを超えない0.5未満グラム軽量であることを確認してください。ゼロ残高から始めます。最初のCBは逆の位置になるサンプルセルの重量を量る。サンプルセルの重量を減算する天びんは、その後、CBの重量を量る。カウンターバランスの取付穴からの重量を加算または減算。重みは上からはみ出さないよう確認してください。対抗勢力の最終重量は0.5グラム内に反対の試料セルに比べて軽量であることを保証するために重さを量り直す。 </li><li> 4場所のローターを使用して、白い矢印が表示されるように位置4にカウンターバランスを置いて、tに指し遠心力の彼の方向。それがダウンしてローター内部のすべての方法であることを確認してください。対抗勢力はまだ整列することができる場所にしっかりとあるが、まで、慎重にちょうど白い矢印の向かいにカウンターバランスの上に見られる一連のネジを、締め。ハウジングとバランスのとれたサンプルセルの位置をローターの中心と目に見えるネジリング上の単語&quot;out&quot;を直面しているプラ​​グ。 </li><li>ローターの下から見ると、整列ツールを使用して、カウンター上のスクライブマークと内側のスクライブマークを（ローターの中心に最も近いマーク）に合わせます。場所に並んでカウンターバランスをロックする止めネジを締めます。同じように、ロータ上の位置2に内部のスクライブマークのついた試料セルのスクライブマークを合わせます。 </li></ol>詳細については参照してください<a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol><li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li>
<li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li>
<li>analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm">http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm</a> Forthcoming.</li>
<li>Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from:
 
 <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

ローターの適切なセルアセンブリ、サンプルの挿入、およびセルの配置は、高品質のAUCの実験のための非常に重要です。これは、タンパク質の相互作用を研究し、トレース集計量を決定するなどの高分子の沈降プロファイルの取得したデータを、、の非常に詳細な分析を必要とする実験のために、特に、真です。多くの場合、実験の品質は、AUCの研究の結果の正確さと精度のために制限しています。 3 - 実用的な設計とAUCの実験のさらなる実行の詳細については、参考文献1を参照してください。実用的なセットアップをカバーするワークショップ、理論、およびAUCの実験のデータ解析は、国立衛生研究所の研究室[4] 1年に2回程度開催されている。

<table><tbody><tr><td>4箇所 Ti 分析用ローター</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>トルクスタンドアセンブリ</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>セルアライメントツール</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote 潤滑剤</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>カウンターバランス</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>セルハウジングキット</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>334602</td><td></td></tr><tr><td>ウィンドウガスケット</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>ウィンドウライナー</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>サファイアウィンドウ</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>石英ウィンドウ</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>ウィンドウホルダー</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>12mm ダブルセクター Epon センターピース</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>セルプラグガスケット</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>327022</td><td></td></tr><tr><td>セルハウジングプラグ</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362327</td><td></td></tr></tbody></table>

アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

分析用超遠心器（AUC）は、私たちは高速遠心分離中に高分子の沈降プロファイルを記録することができる強力な生物物理学的なツールです。適切に計画して実行すると、AUCの沈降速度や沈降平衡実験では、サイズと形状に関しての蛋白質、サンプルの純度、沈降係数、オリゴマー化状態とタンパク質間相互作用について多くを明らかにすることができます。 この手法は、しかし、技術的な関心の厳格なレベルを必要とします。サンプルセルは2つのウィンドウのアセンブリの間に挟まれたセクタセンターピースを保持する。これらは、/ポンドで約120から140のトルクの圧力で密封されています。速度で回転しながら光検出システムが、各中核部門を通して、同じラジアルパスの正中線でのサンプルとリファレンスバッファの両方をスキャンするように、リファレンスバッファおよびサンプルは、目玉のセクターにロードされ、その後、シールした後、細胞を正確にチタン製ローターに並んでいる最大60、000 rpmまでと非常に高真空下でのだけでなく、重要な、適切な試料セルのアセンブリは、サンプルの細胞成分は非常に高価であり、されており、彼らが実験中に漏れや破損を避けるために最適な作業状態であることを確認するため、適切に世話をする必要があります。少しでも亀裂や傷が遠心分離機の破損につながることができるため、慎重に窓を扱う。目玉と窓の間の接触はできるだけタイトにする必要があります。トルクの圧力が印加された後、すなわち無ニュートンのリングが見えるはずです。ほこり、糸くず、窓やセンターピースのどちらかの傷や油のすべての妥協この接触と非常に簡単にすべて一緒に1つのセクタから別のソリューションの漏洩または中心から漏れに​​つながることができます。貴重なサンプルは、実験中のソリューションの漏出、失われる多くの場合、壊れた窓やセンターピースにつながる細胞内の圧力の不均衡の原因となるだけでなく。さらに、プラグのガスケットとハウジングのプラグは、遠心分離室内の高真空での読み込み穴から目玉の部門から引き出されているソリューションを避けるために、所定の位置にしっかり必要があります。ウィンドウのライナーやガスケットは、壊れた窓、結果として運動を引き起こす可能性のある休憩やクラックのない状態でなければなりません。 このビデオでは、コンポーネントの損傷、完璧なAUCの実験中に、ソリューション漏れや破損を最小限にするためにサンプルセルアセンブリ、トルク、負荷及びローターの配置の私たちの手順をデモンストレーションを行います。

分析用超遠心器（AUC）サンプルセルは、サンプルとリファレンスバッファを保持し、実験中に、最大60,000 RPMまで高真空およびローター速度にさらされています。このビデオでは、AUCの実験のこの非常に重要なコンポーネントの組立、荷重と位置合わせのために必要な細部への厳格な注意を紹介します。

分析ウルトラセントリフュージ（AUC）は、高速回転中の高分子の沈降プロファイルを記録することが可能な強力な生物物理学的ツールであり、...

こんにちは、アンドレア・バルボです。私は国立衛生研究所（NIH）のピーター・シャックス研究グループに所属しています。このビデオでは、分析用超遠心機サンプルセルの組み立て、充填、およびローター合わせの手順について実演します。それでは始めていきましょう。準備が整いました。こちらが分析用超遠心機サンプルセルの構成部品です。セルハウジングの中には、2つのウィンドウアセンブリの間に挟み込む12 mmのダブルセクター・チャコールフィールド・エポンセンターピースが積み重ねられています。各ウィンドウアセンブリは、ウィンドウガスケット、ウィンドウライナー、およびウィンドウホルダーに固定されたウィンドウで構成されています。次に、これらの部品のキー溝をハウジングバレル内部にあるキーに合わせて、セルハウジングの中に滑り込ませます。ハウジングガスケットを装着し、その後、120から140 inch poundsのトルク圧でスクリューリングを締め、サンプルセルを密閉します。サンプルを充填した後、2つのハウジングプラグガスケットとハウジングプラグを用いてセルの充填孔を封止し、実験中のスキャンアーティファクト、漏れ、および破損を防ぎます。すべてのコンポーネントが清潔で乾燥しており、ほこりがなく、最良の状態にあることが不可欠です。頻繁に点検し、必要に応じて交換してください。また、以下の器具が必要です。分析超遠心機、チタン製4ホールローター、分析天秤、読み取り可能なダイヤル付きトルクレンチおよびトルクスタンド、カウンターバランスおよびカウンターバランスウェイト、マイナスドライバー、ピンセット、長いテーパー付きピペットチップを装着した200 µLピペッター、アライメントツール、およびスピンコート用潤滑剤。まず、2つのウィンドウアセンブリを組み立てることで、サンプルセルの作製を開始します。最初に、ウィンドウホルダーの底部にウィンドウガスケットを配置します。次に、ウィンドウライナー（ウィンドウクッションとも呼ばれます）をウィンドウホルダー内に配置し、ライナーの開口部がホルダーのキーウェイに対してわずかな角度を持って向かい合うようにします。次に、ウィンドウのスクライブマークをウィンドウホルダーのキーウェイに合わせて、ホルダーにウィンドウをセットします。ウィンドウの両端の端を軽く押し下げます。サンプルセルの適切な密閉と正確なねじ込みを確実にするため、スクリューリング内のハウジングガスケットに薄くコーティングを施します。スピンコート用潤滑剤を用いて、ごく少量の潤滑剤を親指と人差し指の間に取ります。スクリューリングのネジ山に、目に見えないほどの薄い膜状に潤滑剤を塗布してください。同様に、ハウジングガスケットにも塗布します。目に見える潤滑剤を拭き取ります。サンプルセルの組み立てを開始します。ウィンドウを上向きにして、キーウェイをハウジングのキーに合わせて、ウィンドウアセンブリ1つをセルハウジングの中にスライドさせます。センターピースのキー溝をハウジングのキーに合わせ、ハウジング内部のウィンドウアセンブリの上にそっと載せてください。センターピースをセルハウジングに押し込むために、いかなる工具も絶対に使用しないでください。センターピースに永続的な損傷を与え、実験中に漏出が発生する原因となります。2つ目のウィンドウアセンブリを回転させ、ウィンドウがセンターピースを向き、自分とは反対側になるようにします。キー溝をハウジングキーに合わせて、センターピースの上にスライドさせて被せます。その上にハウジングガスケットを配置します。次に、"out"という文字が見えるようにスクリューリングをセットします。このとき、指で操作してください。その後、アライメントツールを用いて、スクリューリングを手で締め付けます。センターピースがハウジングバレルにスムーズに挿入できない場合があります。その場合は、まず位置を合わせ、その上に2つ目のウィンドウアセンブリを配置してください。次に、ウィンドウアセンブリを軽く下に押し付けます。両方を同時にセルハウジングにスライドさせて挿入することができます。このようにすることで、センターピースを直接押さえることを避けることができます。ここで、セルにホコリや糸屑、指紋が付着していないか確認してください。また、センターピースとウィンドウの間にまだ空気が残っていることを示すニュートンリングが確認できるはずです。これらは、ネジリングを回して締め付け、文字が見える状態にすることで消失します。サンプルセルをセル内部の最深部まで挿入してください。トルクスタンドのトルクコレットに固定します。トルクスタンドのハンドルに一定の圧力をかけ、セルを固定したままにします。一度の連続した動作で、スクリューリングを120〜140 inch poundsの間で締め付けます。トルクスタンドのハンドルを離し、慎重にサンプルセルを取り出します。通常、12 mmの中心ピースの各セクターに400 µLの容量を充填します。200 µLピペットを使用し、サンプルセルの充填孔が上を向き、スクリューリングの「out」という文字が見えるように配置してください。ピペットチップをロードホールから左側センターピースセクターの中ほどまで差し込み、200 µLのリファレンス溶液をゆっくりと分注します。同じピペットチップと手法を用いて、慎重にゆっくりとさらにもう一度繰り返し、合計400 µLにします。右側センターピースセクターに400 µLのサンプル溶液を満たします。参照溶液とサンプル溶液の容量を可能な限り正確に一致させることが不可欠です。ピペットチップをピペットにしっかりと装着し、溶液をゆっくりと吸引および分注し、気泡の混入を避け、両方の溶液に同じピペットチップを使用してください。これらはすべて、容量を等しく保ち、セルを密閉するために有効です。2つの赤いハウジングプラグガスケットを各ローディングホールにぴったりとはめ込み、センターピースとアルミニウムハウジングの間に慎重に配置してください。各ローディングホールをハウジングプラグで覆い、小型のマイナスドライバーで手締めします。ローターを装着する前に、カウンターバランスと、その対角に位置するセルの重量差が0.5 grams以内であることを確認してください。天秤の値をゼロに合わせます。まず、カウンターバランスの反対側に配置するサンプルセルを量ります。天秤の風袋引き（テア）を行い、サンプルセルの重量を差し引きます。次に、カウンターウェイトを計量します。ここでは、カウンターウェイトがサンプルセルよりも4.193 g軽いことがわかりました。4 gのカウンターウェイトを選択し、上部に突き出ないように注意しながら、カウンターウェイトの取り付け穴にねじ込みます。最終的な重量が0.5 g以内に収まっているか、カウンターバランスを量り直します。4穴ローターを使用し、白い矢印が見え、かつ遠心力の方向に向けられていることを確認して、カウンターバランスを4番目の位置に配置します。アライメントツールを使用して、ローターの内部まで完全に押し込まれていることを確認してください。バランスサンプルセルを、ハウジングプラグがローターの中心を向き、スクリューリングの「out」という文字が見えるように配置します。再びアライメントツールを使用して、ローター内部の最深部まで挿入されていることを確認してください。この際、ローターを下から見て確認します。内部を調整します。アライメントツールを使用し、ローターの中心に最も近い目盛りをカウンターバランスのスクライブマークに合わせて刻印します。同様に、ポジション2にあるサンプルセルを調整します。すべての細胞が整列した後、ローターを遠心分離機のチャンバーに設置する準備が整います。

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生物学

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アセンブリ、読み込み、および分析用超遠心器のサンプルセルの整列

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