表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

個々の分子のダイナミクスを長期間にわたって研究するためには、まず分子を空間的に局在化させる必要があります。我々は、マイクロ流体セルの表面に分子を固定化することでこれを実現します。手順は、バイオ分子を固定するための4つのチャンバーを備えたセルの組み立てから始まります。

各チャンバーは、入口および出口のキャピラリーを介して外部に接続されています。セルは、パターン化されたPDMSディスクをクオーツカバーグラスに接合して作製します。組み立てたセルを蛍光顕微鏡に載せ、キャピラリーに柔軟なチューブを接続することで、チャンバー内の溶液を容易に交換できるようにします。まず、表面を分子固定化のために活性化させるため、チャンネルのいずれかにビオチン化BSA溶液を流します。

BSAがチャンバーに吸着します。その後、ストレプトアビジンの溶液を流すと、それがビオチンに結合します。最後に、ビオチン修飾オリゴヌクレオチドを流すと、それがストレプトアビジンに結合し、これにより目的の分子がクオーツカバーガラスの表面に固定されます。

蛍光色素の寿命安定性と強度を最大化するように設計されたイメージングバッファーを、全取得期間を通じて一定の速度でチャンバー内に流します。自動セットアップにより、ドナーとアクセプターの両方の蛍光色素を持つ分子を求めて表面の異なるセクションをスキャンし、それらを一つずつプローブ体積内へ移動させ、両方の蛍光色素が光退色するまで、それぞれの蛍光強度時間トレースを取得します。こんにちは、ボストン大学生物医学工学部のミラー教授の研究室のNicholas Dfiです。

本日は、共焦点セットアップを用いて、固定化した核酸から単一分子のFtraceを取得する手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて核酸のダイナミクスや、核酸と酵素の相互作用を研究しています。それでは、始めていきましょう。

Microfluid Excelは、パターン形成された厚さ2 mmのポリジメチルシロキサン（PDMS）ディスクを、洗浄直後の石英カバーガラスに接合して作製します。パターン形成PDMSディスクを作製するには、シリコーンエラストマーベース10部に対して硬化剤1部を混合し、真空中で1時間脱泡します。エラストマーベースの脱泡後、それをマイクロ流体セル金型にゆっくりと注ぎ入れます。

エラストマー混合物をホットプレート上で70 °Cで2時間硬化させます。硬化した後、カミソリを使用してPDMSディスクをモールドから慎重に剥がします。このPDMSディスクには、30 µLの長方形チャンバーが4つ含まれています。

チャンネルのないPDMSディスクの平面側を、両表面を30秒間プラズマ酸化することで、1インチのガラスウィンドウに接合します。このガラスウィンドウには、あらかじめ穿孔されたチャンネルの両端に2mmの穴が8つあります。次に、2インチの長さの柔軟な溶融石英キャピラリーチューブを、各ガラスウィンドウの穴に挿入します。

これを行うには、まず針を挿入し、次にキャピラリートューブがチャネルに到達するまで挿入します。Quick Castなどの速硬化性シリコン鋳造化合物を使用して、ガラス窓の穴を密封します。セルと、ピラニア溶液で洗浄したばかりの1インチ円形クオーツカバーガラスを30秒間プラズマ処理した後、チャネルをエタノールと水で洗浄します。

カバーガラスを、チャネルを含むセルの側面に融着させます。これでチャンバーが密閉されました。組み立てたセルを室温で一晩静置し、硬化させます。

組み立てたマイクロ流体エクセルを一晩キュアした後、特製のホルダーに設置し、共焦点顕微鏡のステージに載せて、セルの表面活性化を開始します。分子を固定化するために、フレキシブルチューブをセルのキャピラリーに接続し、シリンジと針を用いてバッファーを注入できるようにします。次に、バッファーAに溶解した0.1 mg/mLのビオチン化BSA溶液をチャンネル内に注入し、少なくとも30分間インキュベートします。

30分間のインキュベーション後、チャネルから未吸着のビオチン化BSAを除去するために、300〜500 µLのバッファーAを流します。この際、チャンバー内に気泡が混入しないよう注意してください。次に、0.1 mg/mLのSTR dinを含むバッファーA溶液を注入し、15分間インキュベートします。

15分間のインキュベーションフローの後、バッファーAを300～500 µL流し、チャネル内に未吸着のstrep dinを除去します。前述と同様に、チャンバー内に気泡が混入しないように注意してください。最後に、3～5 pMのビオチン化サンプル溶液を流します。

蛍光分子のカバー率を確認するため、サーフェススキャンを行います。ビオチン化サンプルを10分間インキュベートし、バッファーのフローを繰り返します。前述の通り、イメージングバッファー（IB）は、酵素的酸素除去システムと、IBをまず溶解させるためのトロロックスなどのトリプレットクエンチャーで構成されています。

5 mgのtrol lockを10 mLのグルコース緩衝液に加え、数分間ボルテックスし、さらに10分以上振盪して溶解させます。溶液をろ過し、真空状態で10分間脱気します。気泡が混入しないように注意しながら、TRO lock溶液をGlocky酵素溶液と穏やかに混合します。

リザーバーにIB溶液を満たします。次に、メカニカルシリンジポンプを用いて流量を制御し、5 µL/minの一定速度でIBをチャネル内に流します。また、大気中の酸素がバッファーに溶解するのを防ぐため、IBリザーバーにアルゴンガスをバブリングします。表面スキャン、分子の局在化、および単一分子の強度トレースの取得はLabVIEWプログラムによって制御され、20 µm × 20 µmの領域を0.2 µmの分解能、0.1 µm/msの速度でスキャンします。

表面スキャニングから得られたデータは即座に処理され、バックグラウンドカウントを超えるすべてのピクセルの強度加重位置が算出されます。固定化された分子が検出されると、それらを一つずつ共焦点ボリューム内へ移動させ、ドナーおよびアクセプター蛍光色素の両方が光退色するまで、時間関数としてそれぞれの強度を記録します。その後、ステージを100 millimeters離れた新しい原点へ移動するようにプログラムし、スキャニングプロセスを繰り返します。

組み立てられたMICROFLUID Excelをここに示します。これらは、緑色のドナーチャネルと赤色のアクセプターチャネルにおける単一分子を示すサーフェススキャンです。アクセプター強度を赤色、ドナー強度を緑色で示す、代表的な単一分子のトレースがいくつか示されています。

共焦点セットアップを用いて、固定化された生体分子から単一分子トレースを取得する方法について説明しました。この手順を行う際は、非常に難易度の高い実験であるため、各ステップを慎重に時間をかけて行うことが重要です。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。