Name: 表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶ表面固定化DNA分子の単一分子FRET測定法。自動走査共焦点顕微鏡を用いて、マイクロ流体細胞内で生体分子を固定化し、蛍光強度時間トレースを取得する手法です。核酸動態と酵素相互作用の研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々はシステム、マイクロ流体デバイスの設計上のアドバイスやセットアップの機械加工部品のハーバード大学のロー​​ランド研究所のスタッフのためのジョシュアエデルの開発に彼の助けのためにチャンドラSabanayagamに感謝。我々は、有用な情報については、UIUCで便利ローランド研究所とボストン大学のメラーのグループのメンバーとのディスカッション、そしてT.ハのグループのメンバーを認識する。最後に、我々は、国立科学財団（PHY - 0701207）と国立衛生研究所（GM075893）から財政支援に感謝。

1 - マイクロ流体セルの組み立てマイクロセルを融合させることにより行われる模様の、新鮮な洗浄石英カバースリップに厚さ2mm、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ディスク。 PDMSのディスクには、バッファの制御フローについては、それぞれ、バッファのリザーバーとシリンジポンプに接続されている入口と出口柔軟な毛細血管によってアクセスされる4つの30μlの長方形のチャンバーが含まれています。フローセルは、ガラス窓で、その裏側でサポートして温度を調節する熱電素子冷却水を含むカスタムメイドのセルホルダーに配置されます。 <ol><li>パターニングされたPDMSディスク、1部硬化剤と混合し10重量部のシリコーンエラストマーの基盤を作るために、よく混合し、真空中で1時間脱気したままにします。 </li><li>ゆっくりとマイクロセルの金型上にエラストマーミックスを注ぐ。私たちのケースでは、これは、ネガ型フォトレジストから作られたfourストリップ（1 × 4 × 1 × 3 ×300μm以下）1&quot;シリコンウェハである。70℃のホットプレート上で治すためにこれを残す℃で2時間。 </li><li>慎重にカミソリの刃を使用して金型から硬化PDMSのディスク皮。 30秒間の両方の表面を酸化してプラズマ1 &#39;&#39;ガラス窓（チャネルの両端に8 × 2mmの直径プレドリル穴を含む）の上にディスクを融合。 PDMSのディスク（チャネルを含んでいない側）の平らな側面にガラス窓を融合。 </li><li>それはチャンネルに達するまで、各ガラスの窓の穴から2インチの長いフレキシブルフューズドシリカキャピラリーチューブを挿入します。第一針を挿入し、毛細管と続くのは、このプロセスを容易にすることができる。クイックキャストのような高速硬化型シリコーン鋳造の化合物を使用してガラス窓の穴を密封する。 </li><li>エタノールと水でチャンネルをすすぎ、30秒たての洗浄、1インチの円形の石英カバースリップと一緒に細胞をプラズマが非アクティブにする。私たちは、ピラニアを使用して、このカバーガラスを清掃示唆している*.チャンバーを密閉する、チャネルを含むセルの側面にカバースリップを融合。 </li><li>室温で一晩硬化させるために組み立てられたセルのままにします。 </li></ol> *ピラニアは、H 2 O 2とH 1:2.5の比率で2 SO 4のソリューションです。カバーガラスをクリーニングするには、90ピラニアでそれらを浸す℃で20分間。 2 - 分子の固定化のために表面をアクティブにする核酸の研究については、最も単純な表面固定化スキームは、最初にコーティングのガラスまたはビオチン化ウシ血清アルブミン（BSA）とその後ストレプトアビジンとを有する石英カバースリップをされています。これにより、ビオチン化サンプルは室温で日間高い特異性で固定化することができます。 <ol><li>注射器と針を使って簡単にバッファの注入のために毛細血管にフレキシブルチューブを接続します。 </li><li> 0.1バッファのビオチン化BSAのmg / mlの液を注入（10mMトリス- HCl、pH8.0の、50mMのNaClは、0.02μmのフィルターを使用してフィルタ処理された）、少なくとも30分間チャネルとインキュベートに。 </li><li>バッファの流れ300から500μlを、チャンバー内の気泡をトラップするように注意しながら、チャンネルから任意の空きビオチン化BSAを除去する。 </li><li>バッファ内のストレプトアビジンの0.1 mg / mlの液を注入し、15分間インキュベートする。次に、ステップ3を繰り返します。 </li><li>ビオチン化サンプルの3-5 pmのソリューションを介して流れ。蛍光分子のカバレッジをチェックするために表面スキャンを実行します。必要に応じて、より良いカバレッジを取得するサンプルの濃度を増加させる。 10分間インキュベートし、ステップ3を繰り返します。 </li></ol>マイクロセルは光学的に符号化されたDCモータを使用して粗（最大25 mm）の動きを可能にする電動XYステージに搭載された、と細かい（1 nm）の動き二つクローズドループピエゾアクチュエータを使用している（Physik InstrumenteモデルM - 014または類似の）。これは、前またはサンプルの固定化のための表面を活性化後に行うことができます。 3 - イメージングバッファ（IB）を準備 IBは、酵素的酸素掃気システムや、トロロックスのような三重項消光剤、から構成されています。 IBは常に一晩を通してフラッシュされるので、少なくとも10 mlを事前に準備する必要があります。 <ol><li> 0.8パーセントw / vのD -グルコースを10ml、少なくとも35 mMのトリス- HCl pH 8.0にし、脱イオン水のNaCl 50mMのを準備します。バッファの高濃度は、2つの理由から重要です：溶解トロロックスは、ソリューションを酸性化し、酵素反応は、また時間をかけて溶液のpHが低下します。このソリューションは、長い貯蔵寿命を持っているので、それは、原液として保存することができます。 </li><li>数分間ボルテックスしてから、&gt; 10分間振とうすることにより、ステップ1で調製した緩衝液中でトロロックスの5mgを溶解する。トロロックスは、pH&gt; 7で水に溶けにくいので、このステップを急がせることはありません。 0.2μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングし、10分間真空下で脱ガスしておきます。 </li><li> 60μlの瓦を混合することにより、&quot;gloxy&quot;酵素溶液を調製R、5X緩衝液20μl、カタラーゼ、1mgのグルコースオキシダーゼおよび10 mg / mlのBSAを100μl、20μlの。 0.22μmの遠心フィルターを使用してソリューションをフィルタリングする。 </li><li>ゆっくりと気泡の形成を回避手順3から&quot;gloxy&quot;ソリューションでステップ2からバッファを混ぜる。 </li><li>流量を制御する機械式シリンジポンプを使用して、5μl/分の一定速度でチャンネルを介してIBが流れます。バッファーに再溶解から大気中の酸素を防止するためにIBの貯水池にバブルアルゴンガス。 </li></ol>表面スキャン、単一分子の強度のトレースの分子の局在や買収は、自動データ収集1を許可するLabVIEWプログラムによって制御されます。プログラムは、0.1μm/秒の速度で、0.2μmの解像度で20 × 20μmの2つのエリアをスキャンします。データはすぐにバックグラウンドカウント上記の全ての画素の輝度加重の位置を得るために処理されます。固定化分子が発見されれば、それらは共焦点体積中に一つずつ移動され、ドナーとアクセプターフルオロフォアの強度は、両方の蛍光体の光退色するまでの時間の関数として記録されます。ステージは、100μmの離れて新たな原点に移動するようにプログラムされ、スキャンプロセスが繰り返されます。 4 - 代表的な結果下記の表面活性化の前と分子の固定化の準備ができて顕微鏡にマウントされた後、組み立てられたマイクロセルを示すいくつかの画像があります。チャネルが正常にアクティベートされている場合は、表面のスキャンが直接ドナーの励起後にドナー色素（緑）とアクセプター（赤）の発光を示す下図のスキャンのようになります。これらの分子は、プローブのボリュームに一つずつ移動され、単一分子のトレースに示すように蛍光が、両方の染料の光退色するまで時間をかけて記録されます。これらのような痕跡から順番に生物学的興味の分子の構造とダイナミクスを探求するために使用される瞬間的なドナー - アクセプター分離、上知らせるFRETの効率を得ることができます。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" /> 図1：4つのチャンネルを持つマイクロ流体セル、入口/出口毛細血管それぞれ。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="図2" border="0" /> 図2：測定の準備ができて顕微鏡に搭載されたセル。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="図3" border="0" /> 図3：SM - FRETの測定のセットアップ。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">ここをクリックして</a>図3の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="図4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="図5" border="0" /> 図4および図5：固定化の表面のスキャンの赤と緑のチャンネルは、緑色のレーザーで励起分子のFRET。大きいのバージョンを確認するにはクリックしてください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">図4</a> 、または<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">図5</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="図6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="図7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="図8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="図9" border="0" /> 図6、7、8、9：ドナーの強度の軌跡（緑）とDNA分子8、10、16と離れて18塩基対に標識された受容体（赤色）蛍光体。の拡大バージョンを確認するためにクリックしてください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">図6</a> 、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">図7</a> 、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">図8</a> 、または<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">図9</a> 。

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

上記のプロトコルは、私たちの特定のシステムのために、染料（TMRとATTO647N）の特定の選択のための最適化されていますが、それは決して唯一の証明方法を意味することです。最近、プロトカテク酸（PCA）/ protocatechuate -3,4 -ジオキシゲナーゼ（PCD）で構成される代替酸素掃気システムは、特定の染料4の光安定性を向上させることが示された。これらは特定のCy5で5に、いくつかの色素の点滅長期的な抑制されない場合がありますが、同様に、このようなβ-メルカプトエタノール（BME）のような他の三重項状態の消光剤は、トロロックスの代わりに使用できます。 （BSA）ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン化ウシ血清アルブミンを介して固定化核酸の研究のための好ましい選択肢ですが、それが非特異的接着1をしなくなるため、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされた表面は、より良いタンパク質の研究に適しています。さらに、サブ回折限界サイズの小胞は、それが表面の相互作用6によって影響を受けることができる場合に関心の生体分子をカプセル化するために使用することができます。 この記事では、蛍光強度のトレースを取得するためにシリコンアバランシェフォトダイオードを搭載した共焦点セットアップを使用している。このプロトコルは、CCDカメラを搭載した全反射蛍光顕微鏡（全反射）でも同様に動作します。に関係なく使用される顕微鏡の、SM - FRETドナーとアクセプターの信号が適切に7を修正されると、オングストロームに近づいて空間分解能で通知することができます。

<table><tbody><tr><td>石英キャピラリーチューブ</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>石英カバーガラス</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 エラストマーキット</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>シリコンエラストマーキット</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Cast シーラント</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>シリコンキャスティング化合物</td></tr></tbody></table>

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、広くそのような核酸やタンパク質などの生物学的興味の分子の構造とダイナミクスを研究するために使用されています。単一分子が（SM - FRET）FRETを固定化した分子の測定は、両方の色素が分にミリ秒から時間スケールの広い範囲での生体分子のダイナミクスを報告する、時間トレースに退色-生じるまで、効率よくシステムの長期観測を許可する。統計分析にトレースの多数の買収を容易にするために、プロセスを自動化する必要があり、サンプルの環境をしっかりと全測定時間（〜12時間）で制御することがあります。これは、一晩、単一分子の数千人の尋問を可能にする自動化された走査型共焦点顕微鏡、および制限された酸素含有量を、バッファの制御された交換を可能にし、全体の測定期間を通じて一定温度を維持するマイクロセルを使用して行われます。ここでは、マイクロ流体デバイスを組み立てるための方法およびDNA固定化のためにその表面を活性化する方法を示します。その後、我々は、フルオロフォアの光安定と寿命を最大化するためにバッファを準備する方法について説明します。最後に、我々は時間分解単一分子の自動収集のためのセットアップの準備に必要な手順は、DNA分子の痕跡をFRETを示す。

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。

蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）顕微鏡法は、生物学的に重要な分子の構造やダイナミクスの研究に広く利用されており、...

個々の分子のダイナミクスを長期間にわたって研究するためには、まず分子を空間的に局在化させる必要があります。我々は、マイクロ流体セルの表面に分子を固定化することでこれを実現します。手順は、バイオ分子を固定するための4つのチャンバーを備えたセルの組み立てから始まります。各チャンバーは、入口および出口のキャピラリーを介して外部に接続されています。セルは、パターン化されたPDMSディスクをクオーツカバーグラスに接合して作製します。組み立てたセルを蛍光顕微鏡に載せ、キャピラリーに柔軟なチューブを接続することで、チャンバー内の溶液を容易に交換できるようにします。まず、表面を分子固定化のために活性化させるため、チャンネルのいずれかにビオチン化BSA溶液を流します。BSAがチャンバーに吸着します。その後、ストレプトアビジンの溶液を流すと、それがビオチンに結合します。最後に、ビオチン修飾オリゴヌクレオチドを流すと、それがストレプトアビジンに結合し、これにより目的の分子がクオーツカバーガラスの表面に固定されます。蛍光色素の寿命安定性と強度を最大化するように設計されたイメージングバッファーを、全取得期間を通じて一定の速度でチャンバー内に流します。自動セットアップにより、ドナーとアクセプターの両方の蛍光色素を持つ分子を求めて表面の異なるセクションをスキャンし、それらを一つずつプローブ体積内へ移動させ、両方の蛍光色素が光退色するまで、それぞれの蛍光強度時間トレースを取得します。こんにちは、ボストン大学生物医学工学部のミラー教授の研究室のNicholas Dfiです。本日は、共焦点セットアップを用いて、固定化した核酸から単一分子のFtraceを取得する手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて核酸のダイナミクスや、核酸と酵素の相互作用を研究しています。それでは、始めていきましょう。Microfluid Excelは、パターン形成された厚さ2 mmのポリジメチルシロキサン（PDMS）ディスクを、洗浄直後の石英カバーガラスに接合して作製します。パターン形成PDMSディスクを作製するには、シリコーンエラストマーベース10部に対して硬化剤1部を混合し、真空中で1時間脱泡します。エラストマーベースの脱泡後、それをマイクロ流体セル金型にゆっくりと注ぎ入れます。エラストマー混合物をホットプレート上で70 °Cで2時間硬化させます。硬化した後、カミソリを使用してPDMSディスクをモールドから慎重に剥がします。このPDMSディスクには、30 µLの長方形チャンバーが4つ含まれています。チャンネルのないPDMSディスクの平面側を、両表面を30秒間プラズマ酸化することで、1インチのガラスウィンドウに接合します。このガラスウィンドウには、あらかじめ穿孔されたチャンネルの両端に2mmの穴が8つあります。次に、2インチの長さの柔軟な溶融石英キャピラリーチューブを、各ガラスウィンドウの穴に挿入します。これを行うには、まず針を挿入し、次にキャピラリートューブがチャネルに到達するまで挿入します。Quick Castなどの速硬化性シリコン鋳造化合物を使用して、ガラス窓の穴を密封します。セルと、ピラニア溶液で洗浄したばかりの1インチ円形クオーツカバーガラスを30秒間プラズマ処理した後、チャネルをエタノールと水で洗浄します。カバーガラスを、チャネルを含むセルの側面に融着させます。これでチャンバーが密閉されました。組み立てたセルを室温で一晩静置し、硬化させます。組み立てたマイクロ流体エクセルを一晩キュアした後、特製のホルダーに設置し、共焦点顕微鏡のステージに載せて、セルの表面活性化を開始します。分子を固定化するために、フレキシブルチューブをセルのキャピラリーに接続し、シリンジと針を用いてバッファーを注入できるようにします。次に、バッファーAに溶解した0.1 mg/mLのビオチン化BSA溶液をチャンネル内に注入し、少なくとも30分間インキュベートします。30分間のインキュベーション後、チャネルから未吸着のビオチン化BSAを除去するために、300〜500 µLのバッファーAを流します。この際、チャンバー内に気泡が混入しないよう注意してください。次に、0.1 mg/mLのSTR dinを含むバッファーA溶液を注入し、15分間インキュベートします。15分間のインキュベーションフローの後、バッファーAを300～500 µL流し、チャネル内に未吸着のstrep dinを除去します。前述と同様に、チャンバー内に気泡が混入しないように注意してください。最後に、3～5 pMのビオチン化サンプル溶液を流します。蛍光分子のカバー率を確認するため、サーフェススキャンを行います。ビオチン化サンプルを10分間インキュベートし、バッファーのフローを繰り返します。前述の通り、イメージングバッファー（IB）は、酵素的酸素除去システムと、IBをまず溶解させるためのトロロックスなどのトリプレットクエンチャーで構成されています。5 mgのtrol lockを10 mLのグルコース緩衝液に加え、数分間ボルテックスし、さらに10分以上振盪して溶解させます。溶液をろ過し、真空状態で10分間脱気します。気泡が混入しないように注意しながら、TRO lock溶液をGlocky酵素溶液と穏やかに混合します。リザーバーにIB溶液を満たします。次に、メカニカルシリンジポンプを用いて流量を制御し、5 µL/minの一定速度でIBをチャネル内に流します。また、大気中の酸素がバッファーに溶解するのを防ぐため、IBリザーバーにアルゴンガスをバブリングします。表面スキャン、分子の局在化、および単一分子の強度トレースの取得はLabVIEWプログラムによって制御され、20 µm × 20 µmの領域を0.2 µmの分解能、0.1 µm/msの速度でスキャンします。表面スキャニングから得られたデータは即座に処理され、バックグラウンドカウントを超えるすべてのピクセルの強度加重位置が算出されます。固定化された分子が検出されると、それらを一つずつ共焦点ボリューム内へ移動させ、ドナーおよびアクセプター蛍光色素の両方が光退色するまで、時間関数としてそれぞれの強度を記録します。その後、ステージを100 millimeters離れた新しい原点へ移動するようにプログラムし、スキャニングプロセスを繰り返します。組み立てられたMICROFLUID Excelをここに示します。これらは、緑色のドナーチャネルと赤色のアクセプターチャネルにおける単一分子を示すサーフェススキャンです。アクセプター強度を赤色、ドナー強度を緑色で示す、代表的な単一分子のトレースがいくつか示されています。共焦点セットアップを用いて、固定化された生体分子から単一分子トレースを取得する方法について説明しました。この手順を行う際は、非常に難易度の高い実験であるため、各ステップを慎重に時間をかけて行うことが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マイクロパターン化表面を使用することにより、タンパク質 -...

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

TIRF顕微鏡を用いて大規模なドナー・アクセプターネットワークからsmFRETデータを取得するためのセットアップと実験手順を提示します。ベイズ推論ソフトウェアFast-NPSを使用したこれらの測定値の段階的な解析では、適応色素モデルの適用により、高解像度の構造情報が得られます。...

ファストナノ位置決めシステムを用いた単一分子FRET実験から構造情報

ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ...

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

この記事では、オープンソースの安価なsmfBoxを使用して、スイッチオンからアライメント、フォーカス、データ収集と分析まで、個々の生体分子を自由に拡散して、個々の正確なFRET測定を行うためのステップバイステップの手順を説明します。...

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

本稿では、広視野蛍光顕微鏡を用いた移動式単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)ベースのプローブの時空間解析方法を紹介する。新開発のソフトウェアツールキットは、正しいFRET効率や分子位置を含む移動プローブのsmFRET時間トレースを時間の関数として決定することを可能にします。...

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。...

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

ここでは、共焦点顕微鏡モードで単一分子レベルでの時間分解蛍光異方性を使用して、生体分子の局所的な柔軟性とダイナミクスを研究するためのプロトコルを紹介します。...

生体分子の局所柔軟性を特徴付けるための単一分子からの時間分解蛍光異方性

このプロトコルは、細胞膜タンパク質のナノスケール空間的組織を解消するための単一抗体標識(SAL)を記述しています。抗体とエピトープの累積相互作用を単一分子レベルで活用することで、膜SAL(mSAL)は局所的なエピトープ分布をマッピングしつつ、同時にネイティブ細胞環境における抗体結合挙動を捉えます。...

膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法

学ぶ表面固定化DNA分子の単一分子FRET測定法。自動走査共焦点顕微鏡を用いて、マイクロ流体細胞内で生体分子を固定化し、蛍光強度時間トレースを取得する手法です。核酸動態と酵素相互作用の研究に応用できます。

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

さらに動画を探す