表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

個々の分子のダイナミクスを長時間にわたって研究するためには、まず分子を空間的に局在化させる必要があります。これは、マイクロ流体セルの表面に分子を固定することで実現します。手順は、生体分子を固定するための4つのチャンバーを備えたセルの組み立てから始まります。

チャンバーは、入口および出口のキャピラリーを通じて外部と接続されています。セルは、パターニングされたPDMSディスクをクォーツカバーガラスに接合して作製します。組み立てたセルを蛍光顕微鏡にマウントし、キャピラリーに柔軟なチューブを接続することで、チャンバー内の溶液を容易に交換できるようにします。まず、分子固定化のための表面活性化として、チャネルのいずれかにビオチン化BSA溶液を流します。

BSAがチャンバーに吸着します。次に、ストレプトアビジン溶液を流すと、これがビオチンに結合します。最後に、ビオチン化オリゴヌクレオチドを流すと、それがストレプトアビジンに結合し、これにより目的の分子がクオーツカバーガラスの表面に固定されます。

蛍光分子の寿命安定性と強度を最大化するように設計されたイメージングバッファーを、全取得期間を通じて一定の速度でチャンバー内に流します。自動化されたセットアップにより、表面のさまざまなセクションをスキャンしてドナーとアクセプターの両方の蛍光分子を持つ分子を検出し、それらを一つずつプローブ体積内に移動させ、両方の蛍光分子が光退色するまでそれぞれの蛍光強度時間トレースを取得します。こんにちは、ボストン大学生物医学工学科のミラー教授の研究室から来ました、Nicholas Dfiです。

本日は、共焦点セットアップを用いて、固定化された核酸から単一分子Fトレースを取得する手順を解説します。当研究室では、核酸のダイナミクスや、核酸と酵素の相互作用を研究するためにこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。

Microfluid Excelは、パターン形成された厚さ2 mmのポリジメチルシロキサン（PDMS）ディスクを、洗浄直後のクオーツカバーガラスに接合して作製します。パターン形成PDMSディスクを作製するには、シリコーンエラストマーベース10部と硬化剤1部を混合し、真空状態で1時間脱気します。エラストマーベースの脱気が完了した後、それをマイクロ流体セル金型にゆっくりと流し込みます。

エラストマー混合物をホットプレート上で70 °Cで2時間硬化させます。硬化後、カミソリを使用してPDMSディスクをモールドから慎重に剥がします。このPDMSディスクには、30 µLの矩形チャンバーが4つ形成されています。

チャンネルのない方のPDMSディスクの平坦な面を、両表面を30秒間プラズマ酸化させることで、1インチのガラスウィンドウに接合します。このガラスウィンドウには、あらかじめ開孔されたチャンネル両端の2 mmの穴が8つあります。次に、長さ2インチの柔軟な溶融石英キャピラリーチューブを、各ガラスウィンドウの穴に挿入します。

これを行うには、まずニードルを挿入し、次にキャピラリーチューブをチャネルに到達するまで挿入します。Quick Castなどの速硬化性シリコン鋳造化合物を使用して、ガラスウィンドウの穴を密封します。プラズマ処理を施したセルと、ピラニア溶液で洗浄したばかりの1インチ円形クオーツカバースリップを30秒間処理した後、チャネルをエタノールと水で洗浄します。

カバースリップを、チャネルを含むセルの側面に接合させます。これでチャンバーが密封されました。組み立てたセルを室温で一晩硬化させます。

組み立てたマイクロ流体セルを一夜かけて硬化させた後、特製のホルダーに設置し、共焦点顕微鏡のステージに固定して、セルの表面活性化を開始します。分子を固定化するために、フレキシブルチューブをセルのキャピラリーに接続し、シリンジと針を用いてバッファーを注入できるようにします。次に、0.1 mg/mLのビオチン化BSAを含むバッファーAの溶液をチャネル内に注入し、少なくとも30分間インキュベートします。

30分間のインキュベーション後、未吸着のビオチン化BSAをチャネルから除去するために、バッファーAを300〜500 µL流します。この際、チャンバー内に気泡が混入しないように注意してください。次に、0.1 mg/mLのSTR din溶液（バッファーA調製）を注入し、15分間インキュベートします。

15分間のインキュベーションフロー後、300～500 µLのバッファーAを流し、チャネル内から吸着しなかったstrep dinを除去します。前述と同様に、チャンバー内に気泡が混入しないように注意してください。最後に、3～5 pMのビオチン化サンプル溶液を流します。

蛍光分子の被覆状態を確認するため、表面スキャンを行います。ビオチン化サンプルを10分間インキュベートし、バッファーのフローを繰り返します。既述の通り、イメージングバッファー（IB）は、酵素的な酸素除去システムと、IBを先に溶解させるためのtrol locksなどのトリプレットクエンチャーで構成されています。

5 mgのtrol lockを10 mLのグルコース緩衝液に加え、ボルテックスで数分間撹拌し、さらに10分以上振盪して溶解させます。溶液をろ過し、真空状態で10分間脱気します。気泡が混入しないように注意しながら、TRO lock溶液をGlocky酵素溶液と穏やかに混合します。

リザーバーにIB溶液を満たします。次に、メカニカルシリンジポンプを用いて流速を制御し、IBを5 µL/minの一定速度でチャネル内に流します。バッファーへの大気中の酸素の溶解を防ぐため、IBリザーバーにアルゴンガスをバブリングさせます。表面スキャン、分子の局在化、および単一分子の強度トレースの取得はLabVIEWプログラムによって制御され、20 µm × 20 µmの領域を0.2 µmの分解能、0.1 µm/msの速度でスキャンします。

表面スキャンのデータは直ちに処理され、バックグラウンドカウント以上のすべてのピクセルの強度加重位置が算出されます。固定された分子が検出されると、それらは一つずつ共焦点体積内へ移動され、ドナーおよびアクセプター蛍光色素の強度が、両方の蛍光色素が光退色するまで時間の関数として記録されます。その後、ステージは100 mm離れた新しい原点に移動するようにプログラムされ、スキャンプロセスが繰り返されます。

組み立てられたMICROFLUID Excelがここに示されています。これらは、緑色のドナーチャネルと赤色のアクセプターチャネルにおける単一分子を示すサーフェススキャンです。アクセプター強度を赤色、ドナー強度を緑色で示した、いくつかの代表的な単一分子トレースが示されています。

共焦点セットアップを用いて、固定化された生体分子から単一分子トレースを得る方法について解説しました。この手順を行う際は、非常に困難な実験であるため、各ステップを慎重に行い、時間をかけて取り組むことが重要です。以上で解説を終わります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。