Name: LIFの不在下で自己再生MESCをサポートするためのSC1（Pluripotin）の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶ SC1（Pluripotin）を用いたマウス胚性幹細胞の自己維持培養法。LIFを使用せずに多能性マーカー発現を維持するコスト効率の良い代替手法を確立し、幹細胞研究の経済性を向上させる。

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著者は彼らの援助と方向にスクリップス研究所の博士盛鼎と北京大学の博士洪鄧に感謝したい。

1。 MEFフィーダープレートの準備<ol><li>培養ES細胞前日、照射E14.5の雪解け1バイアルCF - 1 MEFフィーダー細胞（ES細胞を解凍する方法で私たちの手順を参照）。 </li><li>プレート12ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの密度でMEFフィーダー細胞。 37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 MEF細胞メディア：DMEM、10％ES - PBS、1Xグルタミンおよび1X非必須アミノ酸を添加した。 </li></ol> 2。マウスES細胞の自己複製の保守<ol><li>トリプシンを用いてES細胞を切り離します。シードSC1を補充/よく増殖培地に予め用意されたMEFフィーダープレート上に50,000個の細胞（15％KSRを添加したノックアウトMEM、4mMのL -グルタミン、0.1mM非必須アミノ酸と1X BME）の密度で細胞所望の濃度での（我々は100nm、300 nm、および1μMを使用）。我々はまた、LIF 1000μ/ mlのを添加した陽性コントロールウェルを追加しました。 37℃、5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 </li><li>文化37細胞℃、5％、各継代で3〜4日間CO 2。リフレッシュメディア毎に48時間。 </li><li>継代細胞の初期播種密度と同様の密度を維持するためにトリプシンで1:10に1：15。 5継代後、細胞は、免疫細胞化学を用いて典型的な多能性マーカーの発現を調べることができます。 </li></ol> 3。多能性マーカーの免疫細胞化学的検討<ol><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>室温で20分間、固定液500μlで細胞を固定する。 </li><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間500μlのブロッキングバッファーで非特異的結合をブロックする。 </li><li>特定の一次抗体を250μl（：1:500、1:2000、1:500、1:500と我々は以下の希釈でNanogの、レトロウイルスベクター、SSEA1、およびOct4のを使用）で細胞をインキュベート</li><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>室温で2時間二次抗体を250μlで細胞をインキュベートし、光から遠ざけること（我々は、1からのAlexa Fluor ® 488で1:2000とロバ抗ウサギ共役でのAlexa Fluor ® 555と結合ロバ抗マウスを使用：2000）。 </li><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>最後の洗浄のためにDAPIを（最終濃度1μg/ ml）を追加し、核を可視化するために5分間インキュベートする。 </li><li>蛍光顕微鏡下で細胞を分析する。 </li></ol> 4。代表的な結果： 1。形態の結果： マウスES細胞（ESC R1）は未分化状態で自己複製を維持するためにLIFまたはSC1のどちらかの存在下でMEFフィーダー細胞上で増殖させた。第2通路の後、分化がLIFまたはSC1（ネガティブコントロール）することなく細胞内で観察することができたし、5継代後、本質的に未分化コロニーが観察されなかった。 LIF（陽性対照）で処理したコロニーは、5セルの通路を通して未分化状態のまま。 300nm以上は100 nMの濃度でSC1で処理した細胞はまた、しかし、細胞が第四継代後に1μMSC1経験豊富な細胞死で処理、5継代の後に未分化のままであった。 （アプリケーションノートの図2）表1は、形態学的観察結果をまとめたものです。 2。多能性マーカーの発現 5継代維持したマウスES細胞はSSEA1、Oct4の、NanogのとSox2のために固定し、免疫細胞化学によって調べた。マーカーの発現は、LIF内に保持細胞に類似していた。 （アプリケーションノートの図3と4） <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="図1" /> 図1：LIFまたはSC1に保持されて細胞の形態の比較。形態に差は認められなかった。 <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="図2および3" /> 図2と図3：Nanogの、SSEA1、レトロウイルスベクター、及びSC1またはLIF（アプリケーションノートの図4）で維持されたES細胞のOct4の染色。 SC1に保持されて細胞はLIFで維持細胞に類似した多能性マーカー発現を示しています。 表1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> 負の制御 </td><td> LIFポジティブコントロール </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300nMの </td><td> SC1 100 nMの </td></tr><tr><td> 第一パッセージ </td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td></tr><tr><td> 第二パッセージ </td><td>いくつかの差別化された形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td></tr><tr><td> 第三パッセージ </td><td>分化した細胞の大部分</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td></tr><tr><td> 第四パッセージ </td><td>いいえESCコロニーなし</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>観察された細胞死</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td></tr><tr><td> 第五パッセージ </td><td>分化した</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>観察された細胞死</td><td>通常のES細胞の形態</td><td>通常のES細胞の形態</td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産するStemgentによって雇用されている。

小分子のSC1は、マウスES細胞の未分化状態で自己複製を維持するために使用することができます。テストされていない細胞株で使用する前に、しかし、それは最適な濃度を決定するために滴定する必要があります。例えば、我々はマウスES細胞株ESC R1の3つの濃度をテストした。 100 nMのと300 nMの濃度は、マウスES細胞を維持することができた、しかし、1μMの濃度では毒性を示した。 SC1は、フィーダーを含まない条件下で使用することができます。

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2抗体</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

lifの不在下で自己再生mescをサポートするためのsc1（pluripotin）の使用

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

マウス胚性幹（ES）細胞は、従来、自己複製を維持するために、白血病阻害因子（LIF）で培養する。<sup&gt; 1</sup&gt;しかし、LIFは高価であり、LIF/JAK/STAT3経路の活性化は絶対的に自己複製の状態を維持する必要はありません。<sup&gt; 2</sup&gt; SC1小分子は、LIFへの経済的な代替可能性があります。 SC1のRas - GAPとERK1のデュアル阻害による機能。<sup&gt; 3</supその作用機序の&gt;イラストは自己再生の基本的な分子メカニズムを研究するために有用なツールとなります。ここでは、SC1の存在下で培養マウスES細胞のための手順を示し、それらがLIFの不在下で自己複製を維持することが可能であることを示している。 SC1で培養された細胞は、LIFを維持した細胞に比べ同様の形態を示した。両方は、5継代後、典型的なマウスのESの形態を示した。典型的な多能性マーカーの発現は（Oct4の、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてSSEA1）SC1の存在の5つの継代後に観察された。また、SC1は、マウスES細胞には明白な毒性を生じなかった。

SC1のRas - GAPとERK1のデュアル阻害による機能。我々は、LIFの不在下でマウスES細胞の自己複製をサポートするにSC1の機能をテストし、SC1は、マウスES細胞培養の自己複製を維持することができることを示した。

LIFの不在下で自己再生MESCをサポートするためのSC1（Pluripotin）の使用

マウス胚性幹（ES）細胞は、通常、自己複製能を維持するために白血病抑制因子（LIF）を用いて培養されます。1 しかし、LIFは高価であり、...

こんにちは、ボストンのSTEM Gen研究所のSarah NAUです。今日は、低分子化合物C1の存在下でマウス胚性幹細胞の自己複製能を維持するための手順をご紹介します。通常、マウス胚性幹細胞は、自己複製能を維持するために白血病阻止因子（leukemia inhibitory factor）の存在下で培養されます。しかしながら、Lは高価です。そこで、ここでは経済的な代替案として、低分子化合物のSC oneをご紹介します。ビデオの最後では、Lで培養した細胞とSC oneで培養した細胞の間で、多能性マーカーの発現を比較して示します。それでは始めましょう。胚性幹細胞を培養する1日前に、照射済みフィーダー細胞のバイアルを解凍します。フィーダー細胞を1ウェルあたり10,000 cellsの密度で播種してください。12ウェルプレートを用いて、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、準備したフィーダープレート上に、SC1を目的の濃度（本実験では100 nM、300 nM、および1 µMを使用）で添加した増殖培地を用い、ES細胞を1ウェルあたり50,000個の密度でMEFフィーダー層上に播種します。コントロールとして、1000 µg/mLのLIFを添加したウェルを加えます。その後、細胞を37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、継続培養のために培地を交換します。48時間ごとに培地を交換し、3〜4日ごとに1対10の割合で細胞を継代して、初期播種時と同程度の密度を維持します。5回の継代後、免疫化学染色を用いて典型的な多能性マーカーの発現を確認し、幹細胞の免疫化学染色を開始します。まず、細胞をPBSで緩やかに3回洗浄します。4%パラホルムアルデヒド 500 µLを用いて、室温で20分間細胞を固定します。細胞をさらにPBSで3回洗浄した後、ブロッキングバッファー 500 µLを用いて、室温で1時間非特異的結合をブロッキングします。次に、250 µLの一次抗体を細胞に加え、4 °Cで一晩インキュベートします。本実験では、nano SOX2、SSEA1、およびOCT4抗体を用いてインキュベートしています。再度洗浄を行った後、蛍光色素標識二次抗体250 µLを細胞に加え、室温・遮光条件下で2時間インキュベートします。最後に細胞を洗浄し、その最終洗浄液にDAPIを最終濃度1 µg/mLとなるように添加します。次に、核を染色するために細胞を5分間インキュベートします。最後に、蛍光顕微鏡下で細胞を解析します。ここでは、未分化状態での自己複製を維持するために、LIFまたはSC oneのいずれかの存在下でフィーダー細胞上で培養したマウスES細胞の明視野画像を示します。ここでは、5代まで継代して維持したマウスES細胞を示します。細胞を固定し、SSEA-1、OCT4、Nanog、およびSOX2について免疫細胞化学染色による検討を行いました。C1で維持した細胞のマーカー発現は、LIFで維持した細胞と同様でした。マウス胚性幹細胞の自己複製能を維持するために、低分子化合物SC1を使用する方法について説明しました。この手順を行う際は、未検証の細胞株に使用する前に、SC1をタイトレーションして最適な濃度を決定することが重要である点に留意してください。以上で解説を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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