Name: StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-08T19:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学ぶレンチウイルスベクターを用いたヒト線維芽細胞からのiPSC誘導法。多能性マーカー発現を確認し、再生医療への応用基盤を構築する実験プロトコルです。

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1。再プログラミング<ol><li> 6ウェルプレートのウェル当たり1 × 10 5細胞の密度でシードのBJ細胞。成長培地2mlで培養細胞を（450ミリリットルEMEM 50ミリリットルES修飾FBS、5 mlの10 mMの非必​​須アミノ酸、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5ミリリットルに200mM L -グルタミンと0.9ミリリットル55 mMのβを添加した37℃で一晩-メルカプトエタノール）℃、5％CO 2。 </li><li>同じ日に、6ウェルプレートに水で希釈した0.1％ゼラチンを追加し、一晩37℃、5％CO 2をインキュベートすることにより、MEFフィーダープレートの準備を開始。 </li><li>インキュベーション後、BJ細胞から培地を除去し、ポリブレン6μg/ mlのを添加した2 mlの増殖培地を追加し、500μlのhOct4 -レンチウイルス、50μlのhSox2 -レンチウイルス、各ウェルに50μlのhNanog - レンチウイルスと50μlのhLin28 -レンチウイルス。ゆっくりと培地のさえコーティングを確保するためにプレートを揺らし。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。 </li><li>同じ日に、液体窒素や融解からCF - 1 MEF細胞の1バイアルを取り外します。ゼラチンコートしたウェルから液体を取り除く（ステップ1.2参照）と0.2 × 10 5細胞/ウェルの密度でMEFフィーダー細胞を加える。ウェルあたりの総体積は（450ミリリットルDMEMに50ミリリットルFBS、5mlの非必須アミノ酸を補充）MEFの増殖培地中の細胞の2ミリリットルにする必要があります。 </li><li>翌日、5分間、200 xgで0.05％トリプシン/ EDTAと遠心機でBJ細胞を切り離します。増殖培地で培地に懸濁するを吸引除去する。 MEFフィーダープレート（ステップ1.4参照）からメディアを削除し、/ウェルBJ細胞懸濁液2 mlを加える。細胞の濃度は約5 × 10 4細胞/ウェルにする必要があります。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。 </li><li>ヒトES / iPS細胞の培養液で再播種後培地24時間を取り付けます（400ミリリットルDMEM/F12は100mlのノックアウト血清代替物は、5 mlの10 mMの非必​​須アミノ酸5 mlの200 mMのL -グルタミン、0.9ミリリットルを添加した55 mMのβ-メルカプトエタノールと20 ng / mLのヒト組み換えbFGFを）。 7日間24時間ごとに培養液を交換する。 </li><li> 7日後に、（セクション2を参照）MEF条件培地に培地に変更。 </li></ol> 2。 MEF条件培地の調製<ol><li>シードCF - 1 2 × 10 5細胞におけるMEFフィーダー細胞/ウェルの2ミリリットルMEFの増殖培地中で6ウェルプレートで。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。 </li><li>ヒトES / iPS細胞の培養液に培地を変更します。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。 </li><li>四日間のために24時間毎に上清を集める。 0.22μmのフィルターを介して上清をフィルターします。 </li><li> bFGFの50 ng / mlの上清を補完する。 </li></ol> 3。 iPS細胞のコロニーの選択と継<ol><li> Stemolecule Y27632の1​​0μMを添加したヒトES / iPS細胞培養培地中でES細胞様コロニーと再シードを選択して細胞培養皿にCF - 1 MEFフィーダー細胞を事前に播種。 37℃および5％CO 2を一晩インキュベートする。 </li><li>最初の7日間の24時間ごとに（Stemolecule Y27632で補足することなく）培地を変更してください。 7日後、（準備のためのセクション2を参照）MEF条件培地に培地に変更。彼らは典型的なヒトES形態を示すまで我々は、細胞を継代続いた。 </li></ol> 4。多能性マーカーの免疫細胞化学的検討<ol><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>室温で20分間、固定液500μlで細胞を固定する。 </li><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間500μlのブロッキングバッファーで非特異的結合をブロックする。 </li><li>一晩4特定の一次抗体を250μlで細胞をインキュベート° C（我々は1:100でTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、SSEA - 3、Oct4の、レトロウイルスベクター、NanogのとLin28を使用希釈）。 </li><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>光から遠ざけることは、室温で1時間二次抗体を250μlで細胞をインキュベートする（我々はヤギ抗マウスIgM Cy3の共役を使用、ヤギ抗マウスIgG Cy3の共役、ヤギ抗ラットIgM抗体Cy3の共役とヤギ抗1:300希釈でウサギCy3の共役）。 </li><li>細胞をPBSで穏やかに3回洗浄する。 </li><li>最後の洗浄のためにDAPIを（最終濃度1μg/ ml）を追加し、核を可視化するために5分間インキュベートする。 </li><li>倍率で細胞を分析する。 </li></ol>パート5：代表的な結果 1。形態の結果： ヒト包皮線維芽細胞（BJ）細胞は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28 Oct4のと共同で導入した。形態学的変化は、4日後の伝達は早くも観察し、細胞のクラスターは、より緊密に17日目（図1）で満員となった。コロニーは、手動で25日目でピックアップし、CF - 1 MEFフィーダー細胞上で培養した。再プログラミング後のiPS細胞のコロニー形成を容易にするために、我々はStemolecule Y27632を用い各継代時の初期晩播のため、ROCK阻害剤、。良い形態でのiPS細胞コロニーは植民地の3つの連続した​​ラウンド、ピッキングと継代後に観察された。 2。多能性マーカーの発現： さらに分離されたiPS細胞のコロニーを特徴付けるために、我々はES細胞に発現し、共通の多能性マーカーの存在を探した。コロニーは、強いアルカリホスファターゼ（AP）活性（図2）を示した。さらに、免疫細胞化学（ICC）は、表面マーカーTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、SSEA - 3と同様に核のマーカーを含む、多能性マーカー特異的抗体のパネルでiPS細胞のコロニーを行ったOCT4、Sox2、及びNanogの。分離されたiPS細胞のコロニーは、全てのマーカー（図3）陽性であった。 ICCの結果は、iPS細胞は、これらのiPS細胞が密接に未分化ヒトES細胞に似ていることを示している、適切な多能性マーカーの発現パターンを示したことを示している。 <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：形質BJ細胞の形態学的変化。典型的なiPS細胞で形成されたコロニー（）4日間と（B）17日後に形質導入​​の明視野像。 <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：再プログラムBJ細胞のAP活性。三つの異なるコロニーはStemgentアルカリホスファターゼ染色キットで染色。 <img src="/files/ftp_upload/1553/1553fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：表面マーカーTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、SSEA - 3、及び核のマーカー10月4日、NanogのとSox2：ヒトiPS細胞は、以下のES細胞特異的マーカーの高いレベルを表現する。

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (1917).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Rho%2FROCK+pathway+reduces+apoptosis+during+transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors.</a> J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).</li>
</ol>

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産するStemgentによって雇用されている。

これらの結果は、ヒト線維芽細胞での転写因子を形質導入StemgentヒトTFのレンチセットが効率的に異所性発現を誘導することにより、iPS細胞のコロニーを生成するために使用できることを示している。プログラミングの実験を設計するとき、いくつかの変数がリプログラミングの効率を最適化するために考慮されるべきである。最初に、アクティブなウイルス対ターゲットの比率（感染MOIの多重度は）最適な導入効率を達成するために主要な情報伝達の段階で変更が必要になることがあります。第二に、標的細胞の成長条件は、リプログラミングに影響する可能性があります。健康と増殖細胞は、リプログラミングに適している。第三に、異なる細胞数のプロトコルを変更する際に、それが標的細胞数が培養皿の表面積に比例して調整することをお勧めします。最後に、このようなY27632として適用するROCK阻害剤は、最近の研究では強化ヒトESコロニーの生存にその有用性が示されたために成功したリプログラミングを確保するために考慮する必要があります。4,5

<table><tbody><tr><td>ヒトTFレンチウイルスセット</td><td>Stemgent</td><td>00-0005</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-81抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0012</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0009</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0003</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-3抗体</td><td>Stemgent</td><td>09-0014</td><td></td></tr></tbody></table>

stemgentヒトtfのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

2006年には、山中氏らは最初のOct4のレトロウイルス媒介送達および発現、レトロウイルスベクター、c - MycおよびKLF4はマウスの線維芽細胞の多能性状態を誘導できることを示した。1同じグループはまた、ヒトの体細胞の正常なリプログラミングへの報告レトロウイルスベクターが提供する同じ転写因子の人間のバージョンを使用して人工多能性幹（iPS）細胞が2さらに、ジェームズトムソンらは報告している要因の別のセットのレンチウイルスを介した共発現（Oct4の、レトロウイルスベクター、NanogのとLin28 ）iPS細胞にヒトの体細胞をリプログラミングすることができた3。 iPS細胞は、形態、増殖と身体のすべての組織型に分化する能力のES細胞に類似しています。彼らは胚の破壊の倫理的ジレンマなしでES細胞の主要な特性を示すようにヒトiPS細胞はES細胞上の明確な利点がある。患者固有のiPS細胞の生成は、非自己移植細胞の免疫拒絶反応の可能性を排除することにより、パーソナライズされた再生医療の治療に重要な障害を回避することができます。 ここではStemgentヒトTFのレンチセットを使用して、ヒト線維芽細胞を再プログラミングするためのプロトコルを示す。我々はまた、このセットで再プログラム細胞は形態四日後の伝達のiPSを表示するために始めることを示している。 Stemolecule Y27632を使用して、我々は植民地の3つの連続した​​ラウンド、ピッキングと継代後にiPS細胞と観測された正しい形態のために選択。我々はまた、多能性マーカーAP、表面マーカーTRA - 1 - 81、TRA - 1 - 60、SSEA - 4、およびSSEA - 3、及び核のマーカーOct4の、Sox2、及びNanogのを表示する細胞をリプログラミング後のことを示しています。

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

2006年、山中らによって、レトロウイルスを介したOct4、Sox2、c-MycおよびKlf4の導入と発現により、...を誘導できることが初めて実証されました。

こんにちは、ブラッド・ハミルトンです。私はSTEM Gen社の研究開発部門で研究員を務めています。本日は、レンチウイルスを用いてリプログラミング因子を導入し、ヒト線維芽細胞をリプログラミングさせる手順をご紹介します。この手順は、iPS細胞の作製とリプログラミングプロセスの研究の両方に利用できます。iPS細胞は、形態、増殖能、および体内のあらゆる組織型への分化能においてES細胞と類似しています。ヒトiPS細胞は、細胞を得るために胚を破壊するという倫理的ジレンマを伴わずにES細胞の主要な特性を示すため、ES細胞よりも明確な利点があります。患者特異的なiPS細胞の作製は、非自己由来の移植細胞による免疫拒絶反応の可能性を排除することで、個別化再生医療における重要な障壁を解消します。それでは、手順を開始しましょう。本プロトコルのいくつかの段階で、分化中のiPS細胞（人工多能性幹細胞）の培地を、mTeSR1条件培地で交換します。この培地の調製には6日かかります。そのため、実験開始の少なくとも1週間前から準備を始めてください。まず、6ウェルプレートの各ウェルに播種します。2×10⁵ CFUのMEFフィーダー細胞を2 mLのMEF増殖培地と共にウェルプレートに入れ、37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、培地をヒトESiPS細胞培養培地に変更します。培地を37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。上清を回収し、24時間ごとに新しい培地と交換することを4日間繰り返します。回収した上清を0.22 µmフィルターでろ過します。回収した上清に15 nanograms per milliliterのBFGF (basic fibroblast growth factor)を添加します。これにより、約16 millilitersのMeth条件化培地が得られます。毎日回収した上清は、それぞれ4 °Cで保存してください。Meth条件化培地は、4 °Cで1〜2週間、または-20 °Cで数ヶ月間保存することが可能です。meth調節培地が必要な時に準備できていることが確認できましたので、次に細胞の調製について説明します。iPSC作製における最初のタスクは、レンチウイルスを用いて、ヒト包皮線維芽細胞（BJ細胞）に幹細胞に特徴的な4つの転写因子を導入することです。導入の準備として、BJ細胞を6ウェルプレートに1 × 10⁵ cells/wellの密度で播種し、培養してください。細胞を2 mLの増殖培地で37 °C、5% CO2条件下で一晩培養します。同日に、6ウェルプレートに水で希釈した0.1%ゼラチンを2 mLずつ加え、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートして、MEFフィーダープレートの準備を開始します。ゼラチンがウェルをコーティングし、細胞の基質として機能します。次に、BJ細胞をレンチウイルス導入に備え、導入用のウイルスを調製します。2 mLの新鮮な培地に、6 µg/mLのpolybreneと、ヒト転写因子T4、SOX2、Nanog、Lin28をそれぞれ発現する4種類のレンチウイルスを、それぞれ同一の感染多重度（MOI）となるように添加します。これらのレンチウイルスはすべて、ヒト初期化因子レンチウイルスセットに含まれています。導入を行うには、BJ細胞の増殖培地をウイルス含有培地に入れ替えます。培地が底面に均一に広がるように、プレートを静かに揺らしてください。37 °C、5% carbon dioxide の条件下で一晩インキュベートします。同日に、液体窒素から cf one meth フィーダー細胞のバイアルを1本取り出し、融解させます。meth フィーダープレートからゼラチン溶液を除去します。これにより、各プレートにゼラチンコーティングが施されます。0.2 × 10⁵個の細胞を2 mLのmeth growth Mediumに加えます。このMESを37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、0.05% trypsin EDTAを用いてBJ細胞を剥離し、200 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、細胞を増殖培地で再懸濁します。methフィーダープレートから培地を除去し、BJ細胞懸濁液を1ウェルあたり2 mLずつ加えます。BJ細胞の濃度は、1ウェルあたり約5×10⁴個になるようにしてください。37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。BJ細胞をメスフィーダープレートに播種してから24時間後、培地をヒトESiPS（胚性幹細胞または人工多能性幹細胞培養）培地に交換します。その後7日間、24時間ごとに培地交換を継続します。7日目に、ES細胞培養液を2 mLのmeth条件付き培地に交換します。methフィーダー細胞は、iPS細胞の増殖に必要な可溶性因子を提供してきました。しかし、培養の状態を良好に維持するためには、さらにこれらの因子を追加する必要があります。Methコンディショニング培地には、37 °C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートしたmethフィーダー細胞から分泌されたすべての可溶性因子が含まれています。顕微鏡で観察し、細胞コロニーを選択します。24時間前にccf one methフィーダー細胞を播種した新しい24ウェルプレートにおいて、小さくコンパクトなドーム状の外観で区別される、選択したコロニーをヒトE-S-I-P-S培養で回収します。10 µMのstem molecule Y 2 7 6 3 2を添加した培地。これはdependent kinase阻害剤である。最初の7日間は、24時間ごとにstem molecule Y 2 7 6 3 2を添加しない新鮮な培地に交換する。7日後、培地をmeth. Condition培地に変更します。ヒトES細胞特有の形態を示すまで、細胞の継代を継続してください。エッジが鮮明で、小さく緻密なドーム状のコロニーを確認します。コロニーは均一で、細胞質に対する核の比率が高いはずです。この時点で、ES細胞の形態を持つコロニーが形成されましたが、ES細胞に特徴的な遺伝子も発現しているでしょうか。それを確かめるために、TRA 180、TRA 1 60、SSEA 4、SSEA 3、T 4、sox 2、nanog、SSEA 1などの多能性マーカーでコロニーを染色します。まず、PBSで細胞を3回静かに洗浄します。次に、500 µLの4%パラホルムアルデヒドまたはその他の固定液を用いて、室温で20分間細胞を固定します。20分後、PBSでさらに3回細胞を洗浄し、過剰な固定液を除去します。続いて、1ウェルあたり500 µLのブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートし、非特異的結合をブロックします。ブロッキングステップの後、ブロッキングバッファーで1:100に希釈した一次抗体250 µLをそれぞれに加えます。細胞を一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートし、翌日に、未結合の一次抗体を除去するためにPBSで3回洗浄します。1/300に希釈した二次抗体とブロッキングバッファーの混合液250 µLを加え、室温で1時間インキュベートします。この際、光退色を防ぐため、遮光条件下で保持してください。PBSで細胞を3回洗浄します。3回目の洗浄後、核を染色するためにDPIを1 µg/mL添加します。最後に、iPS細胞の遺伝子発現を解析します。顕微鏡下での形態観察の結果、T4、SOX2、Nanog、およびLin28を共導入したヒト皮膚線維芽細胞において、導入後4日目という早い段階で形態的な変化が観察され、17日目には細胞クラスターの凝集がより密になりました。単離されたiPS細胞コロニーをさらに特性解析するため、ES細胞で発現する一般的な多能性マーカーの有無を確認したところ、コロニーは強いアルカリフォスファターゼ活性を示しました。さらに、表面マーカーであるTA 180、TRA-1-60、SSEA-4、SSEA-3、および核マーカーであるT-fosc、SOX2、Nanogを含む多能性マーカー特異的抗体パネルを用いて、iPS細胞コロニーの免疫化学染色またはICCを実施した。分離されたiPSコロニーは、すべてのマーカーに対して陽性であった。ICCの結果から、iPS細胞が適切な多能性マーカーの発現パターンを示したことが分かり、これらのiPS細胞が未分化ヒトES細胞に酷似していることが実証された。ヒト線維芽細胞をstem genを用いてリプログラミングし、iPS細胞を作製する方法について解説しました。ヒトリプログラミング因子レンチウイルスセットを使用しています。この手順を行う際は、いくつかの要因を考慮することが重要です。第一に、最適な導入効率を達成するために、一次導入ステップにおいて活性ウイルスと標的細胞の比率を調整する必要がある場合があります。第二に、標的細胞の増殖条件が影響を及ぼす可能性があります。健康で増殖性の高い細胞をリプログラミングする方が、よりリプログラミングに適しています。第三に、異なる細胞数に合わせてプロトコルを修正する場合、目的の細胞数を培養皿の表面積に比例して調整することを推奨します。最後に、最近の研究でヒトiPSコロニーの生存率を高める有用性が示されているため、リプログラミングを確実に成功させるために Y 2 7 6 3 2 などのROCK阻害剤の使用を検討すべきです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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