StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成
December 8th, 2009
我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。
こんにちは、私の名前はブラッド・ハミルトンです。私はここSTEM Genの研究開発部門の科学者です。本日は、レンチウイルス送達リプログラミング因子を使用してヒト線維芽細胞を再プログラムする方法の手順をお見せします。
この手順は、IPS細胞の生成とリプログラミングプロセスの研究の両方に使用できます。IPS細胞は、形態、増殖、分化能力、および体のすべての組織タイプにおいてES細胞と似ています。ヒトIPS細胞は、ES細胞の主要な特性を示すため、ES細胞よりも明確な利点があります。これは、胚を破壊することで細胞を得るという倫理的ジレンマに悩まされることなく、ES細胞です。
患者特異的なIPS細胞の作製は、非自家移植細胞の免疫拒絶反応の可能性を排除することにより、個別化再生医療治療の重要な障害を回避します。それでは始めましょう。このプロトコルのいくつかのポイントで、発生中のIPSCまたは人工多能性幹細胞の培地を覚せい剤で調整した培地に置き換えます。
この培地の準備には6日かかります。ですから、実験を始めたいと思う少なくとも1週間前に始めてください。6の各井戸に種をまくことから始めます。
ウェルプレートは、2ミリリットルのメス増殖中に1つのメスフィーダー細胞を10〜5番目のcfで2回入れます。ミディアムインキュベートは、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、培地をヒトE-S-I-P-S細胞培養物に変更します。
ミディアムインキュベートは、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。上清を収集し、4日間24時間ごとに新しい培地と交換します。0.22マイクロメートルのフィルターで上清をろ過します。
収集した上清に、1ミリリットルあたり15ナノグラムのBFGF塩基性線維芽細胞成長因子を補給します。.あなたは、覚せい剤で調整された媒体の貯蔵量の約16ミリリットルを毎日別々に収集した上澄みを4度SIUで得ることになります。覚せい剤に馴染ませた培地は、摂氏4度で1〜2週間、または摂氏マイナス20度で数ヶ月間保存できます。
さて、覚せい剤で調整された培地が必要なときに準備ができていることを確認したので、次は細胞の準備について話しましょう。IPSCを作製する最初の課題は、レンチウイルスを用いて、ヒト包皮線維芽細胞、または幹細胞に特徴的な4つの転写を持つBJ細胞を形質導入することです。1ウェルあたり10〜5細胞の密度でBJ細胞を6ウェルプレートで培養するトランスダクションシードを調製する。
細胞は2ミリリットルの成長で、同じ日に摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩中中。覚せい剤フィーダープレートの準備を開始するには、水で希釈した0.1%ゼラチンを2ミリリットル加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。ゼラチンはウェルをコーティングし、それらのマトリックスとして機能します。
これで、BJ細胞はレンチウイルス形質導入の準備ができており、ウイルスを形質導入するための準備が整っています。2ミリリットルの新鮮な培地に、1ミリリットルあたり6マイクログラムのポリブレインと、それぞれヒト転写因子の1つを発現する4つのレンチウイルスを補給します。T 4、SO two nanogおよびlin 28、それぞれが同じ感染またはMOIの多重度にあるような。
これらのレンチウイルスはすべて、ヒトリプログラミング因子レンチウイルスセットに含まれています。形質導入を行うには、BJ細胞増殖培地をウイルス含有培地に置き換えるだけです。メディウムが底を均一にコーティングするように、プレートをそっと揺らします。
摂氏37度と二酸化炭素5%で同じ日に一晩インキュベートします。液体窒素からcf one methフィーダー細胞のバイアル1つを取り出し、解凍します。メスフィーダープレートからゼラチン溶液を取り出し、それぞれにゼラチンがコーティングされています。
よく2ミリリットルの覚せい剤増殖中の5番目の細胞に0.2倍の10を加えます。中程度。MESを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、BJ細胞を0.05%トリプシンEDTAで剥離し、200Gで5分間遠心分離します。
遠心分離後、上清を吸引し、細胞を増殖培地に再懸濁します。メスフィーダープレートから培地を取り出し、BJ細胞懸濁液のウェルあたり2ミリリットルを追加します。BJ細胞濃度は、ウェルあたり10〜4番目の細胞の約5倍である必要があります。
摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。メスフィーダープレート上のBJ細胞を後退させてから24時間後、培地をヒトE-S-I-P-S、つまり胚性幹細胞または人工多能性幹細胞培養液に交換します。中程度。7日間、24時間ごとに媒体を交換し続けます。
7日目に、ES細胞培養培地を2ミリリットルの覚せい剤馴染培地と交換します。覚せい剤フィーダー細胞は、IPS細胞の増殖に必要な可溶性因子を提供してきました。しかし、今では、文化を健全に保つために、これらの要素をさらに追加する必要があります。
メス馴化培地には、メスフィーダー細胞が分泌するすべての可溶性因子が含まれており、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートされます。スコープ全体を見て、細胞コロニーを選択します。24時間前にccf 1つのメスフィーダー細胞がヒトE-S-I-P-S培養で選択されたコロニーを後退させる新鮮な24ウェルプレートで、小さなコンパクトなドームのような外観が特徴です。
10マイクロモルのステム分子Y 2 7 6 3 2を補充した培地。依存性キナーゼ阻害剤。最初の7日間は、幹細胞分子Y 2 7 6 3 2を24時間ごとに補充せずに培地を交換します。
7日後、ミディアムを覚せい剤に変更します。培地への条件は、細胞が典型的なヒトES細胞の形態を示すまで細胞を継代し続けます。鋭利なエッジを持つコロニーのような小さくてコンパクトなドームを探してください。
コロニーは均一で、細胞質に対する核の比率が高い必要があります。ここまでで、ES細胞のような形態のコロニーができましたが、ES細胞に特徴的な遺伝子も発現しているのでしょうか?TRA 180、1、TRA one、60、SSEA four s、SE、3 T、4 sox、two nanog、SSEA oneなどの多能性のマーカーについてコロニーを染色し、PBSで細胞を3回穏やかに洗浄し始める。
次に、500マイクロリットルの4%パラフォーム、アルデヒド、またはその他の固定剤で細胞を室温で20分間固定します。20分後、細胞をPB S3でさらに洗浄し、余分な固定液を取り除きます。次に、ウェルあたり500マイクロリットルのブロッキングバッファーに細胞をインキュベートすることにより、室温で1時間ブロッキングステップの後で、ブロッキングバッファーで1〜100に希釈した一次抗体250マイクロリットルをそれぞれに加えます。
翌日、一次抗体中の細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、結合していない一次抗体を除去します。250マイクロリットルの二次抗体を1〜300に希釈し、ブロッキングバッファーを室温で1時間インキュベートし、二次抗体とのインキュベーション後の光退色を避けるために光を避けて細胞をインキュベートします。
細胞をPBSで3回洗浄し、3回目の洗浄を行います。DPIを1ミリリットルあたり1マイクログラムで添加して、核を染色します。最後に、見よ、IPS細胞の遺伝子発現を解析します。
顕微鏡下では、ヒトの4つの皮膚線維芽細胞の形態学的結果は、T、SOX、2ナノグラム、およびlin 28で形質導入されたヒト4つの皮膚線維芽細胞の形態学的変化が、形質導入後4日目という早い時期に観察され、細胞のクラスターは17日目に複数の効力マーカーの発現により密集しました。単離されたIPS細胞コロニーをさらに特徴付けるために、ES細胞に発現する一般的な多能性マーカーの存在を探しました。コロニーは強アルカリホスファターゼ活性を示した。
さらに、表面マーカーTA 180 1 TRA one 60 SSEA 4およびSS EEA 3、ならびに核マーカーT 4、SOX 2、およびNanogを含む多能性マーカー特異的抗体のパネルを用いて、IPS細胞コロニーに対して免疫化学またはICCを行った。単離されたIPSコロニーは、すべてのマーカーに対して陽性であった。ICCの結果は、IPS細胞が適切な多能性マーカー発現パターンを示したことを示しており、これらのIPS細胞が未分化のヒトEes細胞によく似ていることを示しています。
ヒト線維芽細胞を幹遺伝子で再プログラミングすることにより、IPS細胞を生成する方法を示しました。ヒトリプログラミング因子レンチウイルスセット。この手順を実行するときは、いくつかの要素を考慮に入れることが重要です。
まず、最適な形質導入効率を達成するために、一次形質導入ステップ中に活性ウイルスとターゲットの比率を変更する必要がある場合があります。次に、標的細胞の増殖条件が影響を与える可能性があります。リプログラミングは、健康で増殖する細胞の方がリプログラミングに適しています。
第三に、異なる細胞数に対してプロトコールを変更する場合、標的細胞数を培養皿の表面積に比例して調整することが推奨される。最後に、Y 2 7 6 3 2などの岩石阻害剤を適用することは、最近の研究がヒトのyesコロニー生存率を高める上での有用性を実証しているため、リプログラミングを成功させるために考慮する必要があります。というわけで、これだけです。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、レンチウイルスベクターを使用してヒト線維芽細胞から誘導多能性幹細胞（iPSC）を生成するための詳細なプロトコルを紹介します。このプロセスには主要な転写因子の導入が含まれ、結果として得られる多能性細胞は、その形態と特異的なマーカーによって特徴づけられます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞生物学
- 細胞リプログラミング
- 再生医療
背景
- 誘導多能性幹細胞（iPSC）は、胚性幹細胞（ESC）と類似した特性を持ちます。
- iPSCは、ESCに関連する倫理的懸念なしに体細胞から生成できます。
- 患者固有のiPSCは、免疫拒絶反応のリスクを減らすことで、個別化医療を強化できます。
- このプロトコルは、リプログラミング因子を導入するためにレンチウイルスベクターを利用します。
研究目的
- ヒト線維芽細胞からiPSCを生成するための信頼性の高い方法を示すこと。
- リプログラミングプロセスとその再生医療における応用について洞察を提供すること。
- 形態学的および分子的特徴付けを通じて生成された細胞の多能性を確認すること。
使用された方法
- iPSC培養のためのメス条件付培地の調製。
- リプログラミング因子を用いたヒト包皮線維芽細胞のレンチウイルス感染。
- 特定の条件下でのiPSCの培養と維持。
- 由来する細胞コロニーにおける多能性マーカーの特徴付け。
主な結果
- ESCに類似した形態のiPSCの成功的な生成。
- 由来コロニーにおける多能性マーカーの発現の確認。
- プロトコルは、患者固有のiPSCの効率的な生産を可能にします。
- 個別化再生療法への使用の可能性が実証されました。
結論
- このプロトコルは、ヒト線維芽細胞から効果的にiPSCを生成します。
- iPSCは多能性の主要な特徴を示し、研究と治療に価値があります。
- この方法は、再生医療における将来の研究の基礎を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Generation of patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human fibroblasts enables disease modeling and target validation without ethical constraints of embryonic stem cells. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a renewable, genetically matched human cell system for pathway interrogation and phenotypic screening. The lentiviral delivery of defined transcription factors offers a scalable, reproducible method to produce iPSCs for downstream assay development and preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human genetic context using iPSCs derived from patient fibroblasts.
- Operational Value: Provides a renewable source of pluripotent cells for consistent target engagement and pathway modulation studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming target relevance in a disease-relevant human system prior to lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized iPSC-derived cells suitable for assay preparation and compound screening workflows.
- Operational Value: Enables production of uniform cell colonies with defined morphology and marker expression for reproducible assay performance.
- Scalability: Lentiviral transduction allows for consistent iPSC generation across multiple wells and plates, supporting medium-to-high throughput screening preparation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Patient-specific iPSCs bridge discovery and preclinical validation by maintaining genetic fidelity to the donor.
- Mechanistic De-risking: Expression of pluripotency markers (TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, Oct4, Sox2, Nanog) confirms cellular identity, reducing ambiguity in downstream differentiation and toxicity studies.
- Predictive Confidence: Morphological and molecular characterization of iPSC colonies enables go/no-go decisions based on pluripotency fidelity before preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a human-relevant system for mechanistic insight and assay readiness.
- Discovery Biology: Lentiviral reprogramming supports hypothesis testing by generating iPSCs that reflect patient-specific genetics for target validation.
- Screening: Produces conditioned medium and feeder-independent iPSC colonies suitable for assay standardization and compound testing.
- Analytics: Enables quantification of pluripotency via marker expression (alkaline phosphatase, surface and nuclear markers) to assess reprogramming efficiency and consistency.
- Translational Research: Patient-derived iPSCs support continuity into preclinical models by preserving genetic background for disease-relevant differentiation.
- Enterprise Reuse: The Stemgent Human TF Lentivirus Set provides a reusable platform for iPSC generation across multiple projects and cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through confirmed pluripotency and reduction of mechanistic ambiguity in human cells.
- Operational Value: Standardization of iPSC production via lentiviral transduction and defined culture conditions (meth conditioned medium, Y-27632).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via early biological de-risking, reducing late-stage failure risk in regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets using patient-specific iPSC models that predict clinical translatability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, stem cell culture, and immunofluorescence characterization.
- Dependent on lentiviral vector infrastructure and biosafety protocols for handling reprogramming factors.
- Necessitates standardized feeder cell preparation and conditioned medium production for consistent iPSC maintenance.
- Adaptation to alternative fibroblast sources may require optimization of transduction efficiency and selection conditions.
- Practical limitations include variability in reprogramming efficiency based on cell passage, donor variability, and MOI titration needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
0:09
Introduction
1:05
Preparing Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) Conditioned Medium
2:39
Transducing Human-Foreskin-Fibroblast (BJ) Cells with Stem-Cell-Specific Transcription Factors
6:33
Selecting and Passaging Induced Pluripotent Stem Cell Colonies
9:43
Representative Results: Induced Pluripotent Stem Cell Colonies Morphologically Resemble Stem-Cells and Express Markers of Pluripotency
7:33
Staining Resulting Colonies for Markers of Pluripotency
11:07
Conclusion
