ヒト胚性幹細胞を凍結融解

こんにちは、STEM GenのLeah Kentです。今日は、ヒト胚性幹細胞の融解および凍結方法について解説します。それでは始めましょう。

ヒト胚性幹細胞を融解させるには、クライオバイアルを液体窒素から取り出し、速やかに融解させます。37 °Cのウォーターバス内で、細胞懸濁液をクライオバイアルから、ヒトES細胞培養培地で希釈したコニカルチューブに移し、遠心分離を行います。その後、上清を除去して小さな細胞ペレットを形成させ、チューブ内で新鮮なヒトES細胞培養培地を用いて細胞ペレットを再懸濁し、あらかじめ照射済みmethフィーダー層を播種した6ウェル細胞培養プレートの1ウェルに播種します。

ヒトES細胞を融解させる1日前に、照射済みマウス胚性線維芽細胞（MEF）のフィーダー層を、ゼラチンコーティングした6ウェル組織培養プレートの1ウェルに培地とともに播種します。プレートを37°C、5% carbon dioxideの条件下で一晩インキュベートします。

効率的かつ適切に融解させるため、必要な器具と試薬をすべて準備しておいてください。ヒトESLを液体窒素から取り出す前に、金属製ピンセットを使用して、液体窒素保存タンクからヒトESLが入ったクライオバイアルを取り出します。

手袋を着用した両手で、バイアルを3〜5秒間転がします。バイアルのラベルにある情報を金属製ピンセットで記録し、霜を取り除きます。その後、バイアルを37 °Cのウォーターバスに浸します。

バイアルを軽く揺らし、バイアルを光にかざして、解凍の進行状況を頻繁に、かつ迅速に確認します。これは、氷結晶の大きさを確認するためです。細胞が汚染される可能性があるため、バイアルのキャップをウォーターバスに浸さないでください。

少量の氷結晶のみが残った状態で、滅菌済みの生物学的安全キャビネット内でバイアルをエタノールに浸して滅菌し、極低温保存バイアルの中身を15 mLコニカルチューブの底に直接移します。その後、ヒトES細胞培養液を4 mL、チューブにゆっくりと加えます。

新しい培地をチューブに加える際、チューブを静かに揺らして細胞を絶えず混合します。遠心分離機の中で、ヒトESCを200 Gsで5分間遠心分離します。あらかじめ準備しておいたMEFフィーダープレートを37 °Cのインキュベーターから取り出し、細胞株、継代数、融解日などの適切なヒトESC情報を記載してラベルを貼ります。

MEF培地を吸引し、ウェルに1 mLのPBSを加えます。ペレット化したヒトE ESLを生物安全キャビネットに戻し、慎重に上清を吸引します。細胞ペレットを吸引しないように注意しながら、凍結保存液由来のDMSOが含まれているため、上清を可能な限り除去してください。再懸濁します。

2.5 millilitersのヒトESL培養基を加え、ペレットを非常に穏やかに懸濁させます。5 millilitersのガラスピペットを用いて3〜4回ピペッティングし、MEFフィーダー細胞のウェルからPBSを吸引します。準備した6ウェルプレートのウェルに、ヒトES細胞懸濁液2.5 millilitersすべてをゆっくりと加えます。

プレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、ウェル全体に細胞を均等に分散させるため、プレートを前後左右に慎重にスライドさせます。コロニーが中心に集中するのを避けてください。プレートを円状に回さないでください。

解凍した翌日、37 °C、5% carbon dioxide の条件下で一晩おいて細胞を接着させます。浮遊細胞を含む培地を除去し、2.5 milliliters の新鮮なヒトES細胞培養培地をウェルに加えます。

プレートを37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートし、コロニーが継代可能な状態になるまで培養を継続します。ヒトES細胞の凍結プロトコルは、6ウェルプレートで培養された、健康で中程度の大きさのヒトES細胞コロニーから開始します。コラゲナーゼIV酵素で培養物を処理した後、コロニーを5 mLガラスピペットで回収してコニカルチューブに集め、遠心分離して緩い細胞ペレットを形成させます。

上清を吸引した後、細胞ペレットを再懸濁します。まずヒトES細胞培養培地で再懸濁し、次に2倍凍結保存培地で希釈します。細胞を1 mLずつ均等に分注し、凍結保存用バイアルに入れて凍結します。

細胞を遠心分離している間に、安全キャビネット内で、細胞株の継代数と凍結日をクライオチューブに記入します。ヒトE es細胞を凍結させる際の標準的な密度は、6ウェルプレートの1ウェル分をクライオチューブ1本に入れる量です。ヒトE ESLの遠心分離が完了したら、チューブを生物学的安全キャビネットに戻します。

チューブから上清を吸引します。緩く凝集した細胞ペレットを乱さないように注意しながら、適切な量のヒトESL培地で細胞ペレットを再懸濁します。

1つの凍結保存バイアルあたり、0.5 mLのヒトES細胞培養培地を用意します。ヒトES細胞は、比較的大きなコロニーの断片の状態で凍結させた方が回復率が高いため、ピペッティングは非常に慎重に行ってください。チューブをゆっくりと穏やかに振りながら、適切な量の2倍濃度のヒトES細胞凍結培地を細胞に加えます。

凍結保存液を加え、ピペッティングで極めて穏やかに混合した後、細胞懸濁液を各凍結保存バイアルに1 mLずつ、迅速かつ緩やかに加えます。バイアルをイソプロパノール凍結コンテナに移し、-80 °Cのフリーザーに一晩保存します。イソプロパノール凍結コンテナ内では、細胞は1分間に1 °Cの速度で凍結します。翌日に取り出します。

金属製ピンセットを用いて、凍結保存バイアルを速やかに液体窒素貯蔵タンクに移します。ヒトES細胞を融解した後の初日は、小さなコロニーが透明に見え、顕微鏡での観察が困難な場合があります。融解直後のヒトES細胞は、増殖速度が遅くなる傾向があります。

確立したコロニーとして現れるまで、培養に数日かかる場合があります。これで、ヒト胚性幹細胞培養の融解と凍結の方法についての解説を終わります。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。