Name: ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ上顎バーベルの切断手術と再生観察法。Danio rerioを用いた組織固定、アガロース包埋、形態測定により、再生生物学と神経科学の研究に応用可能な知見を得ることができる。

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これらのメソッドは、JT（DE016678）にデポール大学研究評議会及びNIH / NIDCR R01助成金によって提供されていたJTの支援の研究室における研究の休暇中にEELによって開発されました。我々は感謝キャロラインハンター、CMRCゼブラフィッシュの中核施設とリーナPawluczuk、私たちの学部研究室の助手の動物のケアの技術者の努力を認める。

ゼブラフィッシュの飼育ゼブラフィッシュは、標準的な方法1に従って収容し、飼育されています。後期幼虫期間を過ぎて、ゼブラフィッシュの発生段階は、尾鰭（posteriormost hypuralプレート）のベースに上唇のanteriormost点から、その標準的な長さ（SL）、またはミリメートルの直線距離で測定することができる2。約一ヶ月後の受精（10〜12ミリメートルSL）で、鼻腔と上顎barbelsはそれぞれ、嗅覚ピットに近いと上顎の後方の角の透明上皮芽として表示されます。ゼブラフィッシュが成熟するにつれ、barbelsは狭い、ウィスカー状付属物に拡張する。上顎バーベルが大きい（2-3 mm）と、操作が簡単なので、我々のプロトコルは、この特定の付属物に適用され、同様の手法は、しかし、小さな鼻のバーベルに適合させることができる。 バーベルクリッピング<ol><li>システムの水のpHを7.0にバッファリング（3 -アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸）0.015％MS - 222に浸漬することにより、目的の段階（ 例えば 。、1.5〜2.5センチメートルSL、〜3-6ヶ月後の受精）で成人のゼブラフィッシュをAnaesthetize。水泳運動が停止するまで観察し、鰓の換気は、ゆっくりと規則的になります。魚のサイズに応じて、完全な麻酔が約2〜5分かかります。 </li><li>水族館魚網を使用して、シャーレ内ウェットペーパータオルの折り返し部分に時間で1〜3の魚を移す。鈍いスパチュラを用いて、向きの魚たちがお互いと左側側面上に平行になるように。手順の実行中に皮膚と鰓の潤いを保つために、最大蓋にボディ全体をカバーする魚、（鰓がカバーする）の尾部上にウェットペーパータオルの倍の一部。 </li><li>頭部を照らすために、低角度入射光を使用して、実体顕微鏡下でペトリ皿を見る。上顎の後部腹側の角（図1）から突出左上顎バーベル、の基盤に焦点を当てる。 <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 </li><li>しっかりと上顎の端に少し遠バーベルのシャフトを把握する。バーベルのシャフトを高めると鉗子の近位先の細いバネはさみの顎を挿入する。はさみは、安定性のための鉗子に触れることができます。最先端の上顎の端に近づくまで、バーベルのシャフトに沿ってハサミの顎をスライドさせます。バーベルのシャフトを介してカットするはさみを閉じます。切断されたバーベルは、依然として、鉗子で把持固定またはさらなる観察のために取り外すことができます。 </li><li>すぐに表在性真菌感染を制御するために、メチレンブルーの一滴を含むクリーンなシステムの水（〜500ml）の小さな水槽に魚を移す。魚が一晩回復することができます。翌朝、飼育システムに魚を戻す。バーベル再生には、2週間後に最大となる。 </li></ol>マッチドバーベルペアの寒天埋め込み<ol><li>適切な安楽死法による魚を収集し、4℃で一晩攪拌しながら緩衝生理食塩水（PBS）、4％の50 mlチューブパラホルムアルデヒド - リン酸に修正。固定量は、組織の少なくとも10倍のボリュームでなければなりません。固定後、承認された容器にパラホルムアルデヒド廃棄物を処分し、PBSの、いくつかの変更で徹底的に組織をすすいでください。 </li><li> 250mLのガラスフラスコに蒸留水で2％アガロース（T M〜37℃）150mLのを準備します。完全に溶けるまで電子レンジやホットプレートで熱は、定期的にかき回す。 50〜60℃の水浴中で融液を平衡化させます。 </li><li>しっかりとバッファーチャンバーの側面に対して、小さなガスケットゲルの金型を（〜100mLのゲル体積10 × 10cm）に配置することにより、標準的なゲル電気泳動のリグを組み立てます。 2月4日、小歯サンプル櫛（4 × 1.5 mm）を追加します。 </li><li>レベルの表面に、非常に浅い井戸を形成し、ちょうど櫛のベースをカバーするために鋳型に溶けたアガロースを注ぐ。すぐに温水浴中に残ってアガロースを戻す、これは組織を（9-12ステップ）を埋め込むために後で使用されます。アガロースと同じ温度にピペットを保つためにフラスコに長いガラスパスツールピペットを置く。 </li><li> 20〜30分硬化にゲルを許可する。櫛を削除し、バッファーチャンバーから硬化ジェルを含むゲルの金型を削除します。ゲルの外にスライドしないようにしっかりと研究室のテープとゲル型のオープンサイドをテープ。追加のアガロースは（ステップ13）後で追加できるように、このテープは、アガロースの表面上に数mmを拡張する必要があります。 </li><li>実体顕微鏡のステージ上でゲルの金型を置きます。空井戸を拡大し、フォーカスに端をもたらす。 </li><li>ウェルに隣接アガロースの表面に、水または固定バーベルの標本（ 例えば、再生成および制御）を含む緩衝液の滴をピペット。 USIngは、虫ピンを曲げて井戸に湿った標本をドラッグし、一番下にプッシュ。オリエントは、バーベルシャフトの互いに平行と同様の反対側の長辺に対して位置合わせ。表面張力は、位置で組織を保持するのに役立ちます。 </li><li>ときに埋め込むことができ、微細なピ​​ペットチップまたは井戸から余分な水分を除去するために実験室の組織の角を使用。組織が乾燥させないようように迅速に働く。 </li><li>温められたガラスパスツールピペットを用いて、軽く場所にバーベルの組織をシールするために標本とその周辺で新鮮な溶融アガロースをピペット。入れすぎないでください。アガロースが固まる前に、虫ピンで土壇場の調整を行う。 </li><li>よく隣の番号の紙標本のラベルを配置し、アガロースの小さなドロップで固定します。 </li><li>繰り返します標本の各ウェルのために6〜10を繰り返します。 </li><li>画像のキャリブレーションのために必要に応じて、印刷されたマイクロメートルのスケール（ 例えば、と一枚の紙を挿入<a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a>空井戸の底に）。井戸の底に紙を平らにし、暖かいアガロースをかぶせます。 </li><li>標本のすべてが埋め込まれている後に、ゲルの表面は、アガロースの硬化滴で、不規則になります。平らな面にゲルを置き、上面が均一になるまで、ゆっくりと追加の溶融アガロースに注ぐ。滑らかな表面を得るために必要なアガロースの最小量を使用して、あまりにも多くのアガロースは、透過光撮影を不明瞭になります。硬化するために、この最上層を許可する。 </li><li>ゲルは、今や各バーベルのペアの総形態を記録するために実体顕微鏡のステージ上で撮影することができます。画像のキャリブレーションは、埋め込まれたマイクロメートルのスケールを撮影することによって得られる。 </li><li>ゲル全体がぬれたペーパータオルに包んで数週間、4℃でビニール袋に密封し保存することができます。 </li><li>詳しい解析方法については、barbelsのペアを含む寒天ブロックはメスまたはカミソリ刃でゲルから切り出しすることができ、パラフィン組織学用に処理または標準的な方法3,4でcryosectioning。また、個々のbarbelsは、微細な針でアガロースから解剖し、水ですすぎ、および他のダウンストリームアプリケーション（ 例えば、ホールマウント免疫組織化学または共焦点顕微鏡）用に処理することができます。 </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

ゼブラフィッシュ上顎バーベルは、ゼブラフィッシュのいくつかの種類の細胞の成長、維持、および再生を研究するために活用されていない組織のシステムです。バーベルの付属物がない人間のアナログを持っていないが、それに含まれる細胞の種類は非常にそれが可能な光学的に透明と解剖学的にシンプルな円筒状の構造体の皮膚、腺、メラノサイト、循環血管や神経を研究すること、保存されている。よく研究さ尾鰭と同様に、バーベルの組織は切断によって再生するために誘導することができる。解剖学的ランドマークとして、上顎の境界線を使用して、切断面は、バーベル再増殖の測定を容易に、正確に配置することができます。経験豊富な演算子の場合は、それぞれの手術は数秒しかかかりません。回復は急速であり、我々はこれまで、魚の動作には短期または長期的な影響を検出されている。手術後6ヶ月に1上顎バーベルを泳いでゼブラフィッシュ、非外科的コントロールとして食べると効果的に繁殖し、組織収集の時間に匹敵する生存率を持って、アップ。この手術の生理的影響は、1）バーベルに運ば口外味蕾がまた唇、頬およびヘッド5を含む魚の上皮の他の多くの部分、上で検出されているため、最小限であると予測、2）差別味蕾が上に表示されます72時間以内に再生成バーベルは（ルクレールら 、未発表データ。）これは、上顎バーベル大人の脊椎動物のコンテキスト内で創傷治癒、血行再建術、および神経再生を研究するための低侵襲システムです。 再生の外科的誘導した後、barbelsは形態学的測定および/または固定した組織の顕微鏡分析のための間隔で収集することができます。便利に、上顎バーベルはcryosectioning、ホールマウントの免疫組織化学、およびin situで 、パラフィン組織学を含む多くの標準プロトコルのアプリケーションを容易に、約長さ（2-3 mm）とゼブラフィッシュ胚の直径（100〜200 mm）ですハイブリダイゼーション。一緒に、これらの機能は、上顎バーベル組織修復および再生を研究するためのin vivoモデルにおいて高度に実現可能にします。

顕微鏡装置透過と入射する光ファイバ照明とステレオ解剖顕微鏡は、バーベルのクリッピングと寒天の埋め込みが必要です。 バーベルクリッピング<ul><li>魚系の水</li><li> 2ゼブラフィッシュ交差タンク</li><li> MS - 222（3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸、シグマケミカル＃E10521 - 10G） </li><li>滅菌120 mmのペトリ皿</li><li>ウェットペーパータオル</li><li>鈍い金属へら</li><li>デュモン＃55バイオイノックス鉗子（ファイン科学のツール＃11255〜20） </li><li>ミニVannas春ハサミ（ファイン科学のツール＃15000〜00） </li><li>メチレンブルー抗真菌剤（Drs.フォスター＆スミス＃CD - 905781） </li><li>小さな水槽が魚網</li></ul>組織の収集と寒天の埋め込み<ul><li> 1Xの4％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝生理食塩水（PF - PBS）、50 mLコニカルチューブに分注し、-20℃で凍結Cを格納するまで使用</li><li> 1Xリン酸緩衝食塩水（pHは7.27から6） </li><li> 250mLのガラス製のフラスコ</li><li>蒸留水で2％アガロース</li><li>標準的な小型のアガロースゲル電気泳動のリグ（ゲルサイズ=〜10cm角） </li><li>小歯電気泳動のサンプルコーム（櫛サイズ4 × 1.5 mm）の</li><li>温水浴（50〜60℃） </li><li>実験室でのテープ</li><li>黒は、昆虫ピン、サイズ000（ファイン科学のツール＃26000〜25）エナメル</li><li> 1-2番ピンホルダー（ファイン科学ツール＃26016〜12） </li><li> 9インチのガラスパスツールピペット</li><li>ピペットの電球またはポンプ</li><li>実験室の組織</li><li>小さな紙のラベル</li><li> （省略可能）印刷されたキャリブレーションの規模</li><li>ウェットペーパータオル</li><li> ZIP -閉鎖プラスチック袋</li><li>メス/かみそり刃（寒天ブロックをカットする） </li></ul>

ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbelsは魚類、爬虫類と両生類に見られる皮膚感覚の付属です。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、barbels短鼻ペアと長い上顎ペアの2つのペアを開発しています。バーベルの組織は、皮膚細胞、腺、味覚、メラノサイト、循環血管や知覚神経を含む外胚葉、中胚葉および神経堤由来の細胞が含まれています。ほとんどの成人の組織とは異なり、上顎バーベルは、私たちはライフサイクル全体にわたってこれらの組織型の開発と保守を視覚化できるように、光学的に透明です。 このビデオでは、上顎バーベル（約1ヶ月後の受精を開始）の早期開発を示し、成人心耳（&gt; 3ヶ月後の受精）の再生を誘導するために外科的プロトコルを示しています。簡単に言えば、麻酔魚の左上顎のバーベルは、上顎の尾側端のすぐ遠位滅菌ピンセットで上昇している。罰金、滅菌春のはさみ切断面のための解剖学的ランドマークを確立、このレベルでバーベルのシャフトをカットする鉗子に対して位置決めされる。再生成長は、と反対バーベルと比較してこの平面を基準にして測定することができます。バーベルの組織は、損傷の2週間以内に最大の再生に達し、急速に再生成されます。 再生バーベルを分析するためのテクニックは、標準的なDNAの電気泳動ゲルのウェル中で（再生成および制御）barbelsのマッチドペアを解剖し、埋め込む含まれています。埋め込まれた検体は、便利な総形態と形態計測のための実体顕微鏡下で写真撮影されている、と前のパラフィン組織学のようなダウンストリームアプリケーションに週間保存することができる、cryosectioning、および/または全体のマウント免疫組織化学。これらのメソッドは、ゼブラフィッシュの遺伝学的文脈の中で複数の細胞型の再生能力を研究するための生体組織系の小説として上顎バーベルを確立する。

ゼブラフィッシュ上顎バーベルは外胚葉、中胚葉および神経堤誘導体を含有する皮膚感覚器官です。重要なのは、大人のバーベルは、近位切断後に再生成することができます。このビデオでは、上顎バーベルの開発を紹介し、バーベルの標本の収集、埋め込みと下流のイメージングに続く再生を誘導するために外科的プロトコルを、示しています。

触鬚（しょくしゅ）は、魚類、爬虫類、および両生類に見られる皮膚感覚器官である。ゼブラフィッシュ（Danio rerio）は、短い鼻触鬚……を含む2対の触鬚を発達させる。

マーブル（Marbles）は、両生類、爬虫類、および魚類に見られる感覚構造の不均一な集合体です。ゼブラフィッシュでは、小型の鼻側ペアと大型の上顎側ペアという2対のマーブルが発達します。これらの透明な付属器官は、ゼブラフィッシュの複数の細胞型の発生、維持、および再生を研究するために利用できます。このビデオでは、上顎大理石状組織（maxillary marble）の発達について紹介し、再生を誘導するための外科的プロトコルを実演します。数日または数週間後に刺針（barbs）を回収し、続いて再生組織とコントロールの解剖および包埋を行います。こんにちは、デポール大学LeClair研究室のElizabeth LeClairです。そして、ノースウェスタン大学医学部およびChildren's Memorial研究センターのYa Cheskyです。本日は、ゼブラフィッシュの上顎骨（maxillary bone）を研究するためのいくつかの手順をご紹介します。これらの手順を用いて、ゼブラフィッシュの上顎骨の成長と発達について研究します。それでは、始めましょう。受精後約30日から40日で、上顎髭（maxillary barbell）が上顎の後下方隅付近に透明な上皮芽として現れます。ゼブラフィッシュが成熟するにつれて、この髭は数ミリメートルの長さを持つ細い鞭状の付属肢へと伸長します。成熟した上顎髭には、色素細胞、腺細胞、味蕾、循環血管、および有髄神経を含む、いくつかの重要な細胞種が含まれています。最大の特徴は、大理石状の組織が発達の全段階において透明であることです。他のゼブラフィッシュの器官と同様に, 上顎髭は近位での切断後に再生することが可能です。本セクションでは、上顎の基部で髭を切除する手順を説明します。これは片側切除術とも呼ばれます。手術当日、麻酔用と回復用の2つの小さな飼育水槽を準備します。麻酔用槽には、pH 7.0に緩衝した0.015% tricaが含まれています。魚の飼育水において、リカバリータンクには魚、水、および真菌感染を抑制するためのメチレンブルー1滴が入っています。1〜3匹の成体ゼブラフィッシュをトリカインタンクに浸して麻酔し、遊泳動作が止まり、鰓呼吸が緩やかで規則的になるまで観察します。魚のサイズによって異なりますが、完全な麻酔には2〜5分かかる場合があります。観賞魚用ネットを使用して、魚をペトリ皿上の濡らしたペーパータオルの上に移します。鈍端のスパチュラを用いて、魚が互いに平行になるように配置します。左側面を上にした状態で、ペーパータオルの一部を魚の上に折り畳み、湿った状態を維持します。次に、低角の落射照明を用いて頭部を照らし、実体顕微鏡下でシャーレを観察します。微小ピンセットを使用して、左上顎大理石状構造（maxillary marble）の基部に焦点を合わせます。上顎の縁からわずかに遠位にある大理石状構造のシャフトをしっかりと把持します。大理石を持ち上げ、安定させるためにピンセットのすぐ近位に先端の細いスプリングシザーを挿入します。ハサミはピンセット、またはペトリ皿の底に接触させて構いません。ハサミの刃先を大理石のシャフトに沿ってスライドさせ、切断端を上顎骨の端に近づけます。大理石状のシャフトを切断し、切断された大理石部分を取り除きます。この組織は個別に固定して解析することが可能です。手術後、魚を回復タンクに移してください。魚を数時間から一晩recoveryさせ、飼育システムに戻します。ひげの再生が起こるまで1〜2週間待ちます。次のセクションでは、解析のために固定したmarble組織を調製する方法について説明します。本手順は、手術から数日、数週間、または数ヶ月後に採取および固定されたマーブル（Marble）から開始します。固定した組織を緩衝生理食塩水で洗浄し、頭部の左側から再生したマーブルを切り出します。一時的な保管用コントロールとして機能する右側の触角（barb）も忘れずに採取してください。ペアになったビー玉をそれぞれ、ペトリ皿上の生理食塩水の一滴ずつにピペットで移します。蓋をして、そのままベンチ上に置いておきます。ゲルを準備するため、2% agaroseを150 milliliters加熱し、完全に溶解させます。溶液を50〜60°Cの水槽で平衡化します。次に、標準的なゲル電気泳動装置を組み立て、1〜4本の小さなコームをサンプル用ウェルに配置します。溶けたアガロースを水平な面にあるゲル型に流し込み、非常に浅いウェルが形成される程度の量のみを加えます。残ったアガロースをすぐに温水バスに戻します。長いガラス製パストゥールピペットを挿入し、ピペットがアガロースと同じ温度になるまで待ちます。ゲルが冷めた後、コームを取り出し、次にゲル型を取り除きます。ゲルをしっかりと固定するため、好みの色のラボテープで両側をテープ留めします。後で追加のアガロースを流し込めるよう、テープはアガロースの表面より数ミリメートル高く伸ばしてください。その後、ゲル型を実体顕微鏡のステージ上に配置します。空のウェルを拡大し、端に焦点を合わせます。曲がった昆虫ピンを取り付けたハンドルを使用して、シャーレからマーブルをピペットで吸い上げ、ウェルに隣接するゲルの表面に配置します。マーブルをウェルの中に引き込み、底まで押し込みます。バーベルを互いに平行にし、ウェルの長辺に沿わせます。埋め込む前に、微量ピペットまたはラボ用ティッシュを使用して余分な液体を取り除きます。温めたガラスピペットを用いて、組織の周囲に新鮮な溶融アグロスをゆっくりと加えます。アグロスが凝固する前に最終的な調整を行い、ウェルに充填しすぎないように注意してください。近くに小さな番号付きの紙片を添えて、検体番号を記録します。すべての標本の埋没が完了した後、ゲルの表面にアロスを薄く流し込んで上端を平滑にします。撮影時にゲルが透明な状態を維持できるよう、使用量は最小限に留めてください。ゲルが硬化した後、実体顕微鏡下で撮影を行い、各大理石状ペアのサイズと形状を記録し、さらなる解析のための形態測定値を収集します。ペアとなるマーブルを含むアガロースブロックを、メスまたはカミソリでゲルから切り出します。これらは標準的な手法により、パラフィン組織 histological 処理または凍結切片作成に供することができます。あるいは、水で洗浄した細い針を用いてアガロースから個々のマーブルを解剖し、ホールマウント免疫組織化学染色や共焦点顕微鏡観察などの他のダウンストリームアプリケーションに供することも可能です。最後に、ゲル全体をバッグで密封し、冷蔵保存します。これにより、検体は数週間保存可能です。以上で、上顎骨（maxillary bar）の発達と再生の観察および分析方法について説明しました。ゼブラフィッシュにおける新しいシステムであるため、まだ多くの発見が期待されています。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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形状の形態計測解析:ゼブラフィッシュにおける頭蓋顔面形状定量化のための解析ソフトウェアツールボックス

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ゼブラフィッシュ上顎バーベルの研究のための方法

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