同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で

ISTHとして知られる技術でin situハイブリダイゼーションとテトラ染色を組み合わせることで、ウイルス抗原特異的免疫エフェクター細胞とウイルス感染細胞および組織との間の相対数と空間的関係を決定できます。ISTHは、新鮮なSIV感染組織をアグロに埋め込むことから始まります。組織をビブラートで200ミクロンの厚さに切断し、ウイルス抗原を染色します。

特異的なCD8陽性細胞は、適合Cで標識されたMHC四量体を用いています。凍結後、これらの染色切片をクライオスタットを用いてさらに8μmの厚さの切片に切断し、in situハイブリダイゼーションを行い、ウイルス感染細胞を局在化します。共焦点顕微鏡法は、二重染色切片を画像化し、最終的に元の厚い切片を再構築して、免疫エフェクターと標的細胞との関係を明らかにするために使用されます。

この手順を使用して初期のSIV感染を調べることは、その後の疾患の重症度についての良い予測因子であることが証明されています。こんにちは、ミネソタ大学微生物学部のAshley HAの研究室ツリーのChinen Leeです。ミネソタ大学獣医学部の助教授、パム・スキナーです。

今日は、インスティテュートのハイブリダイゼーションまたは略してISTHの内部の手順をお見せします。本日ご紹介しているように、inci hydioizationと組み合わせたinci teer染色に加えて、免疫組織化学と組み合わせたinci teer染色を日常的に使用して、抗原特異的なCD eight T細胞in situ Uの位置、存在量、およびタンパク質発現プロファイルを決定します。今日、厚い切片で染色するin situで私たちを支援するのは、Dr.Heon KimとTerry Matalaであり、薄い切片の準備とin situでのハイブリダイゼーションを支援します。

この手順を開始するには、滅菌PBSHを含むビブラムバスを摂氏2度まで冷やします。バイブレーターの刃の角度を27度に設定します。可能な限り、新鮮なティッシュを氷の上で冷やし、ティッシュを採取してから24時間以内に手順を開始してください。

劣化の冷却を最小限に抑えるために、ビブラムはまた、新鮮な組織の切断、結合組織を切り取り、メスで標本を小さな断片に切断し、ホエーボートに入れて4%の低溶融物で覆うことを容易にします。PBSのアグロスは摂氏約40度で溶けました。ティッシュが皿の底に接触していることを確認し、ティッシュピースが浮いている場合は押し下げ、氷の上で3〜5分間固めます。

ここでは脾臓組織を使用していますが、リンパ節、膣、子宮頸部、子宮、またはその他の新鮮な組織もメスで使用できます。組織の周りのアグロスを切断し、鉗子を使用してアグロスに埋め込まれた組織を組織ブロックに慎重に移します。続いて、VibramティッシュブロックをLoctite接着剤でコーティングします。

ティッシュブロックにセットしたティッシュピースを動かさないでください。氷の上で約10分間乾かします。次に、組織ブロックをバイブレーターに取り付け、デッドスローフォワード速度と比較的高い振幅を使用して、組織を200マイクロメートルの厚さのセクションに切断します。

ペイントブラシを使用して、カットした切片を、1ミリリットルのチルドPBSHをあらかじめ充填した24ウェル組織培養プレートのウェルにセットした特殊な組織チャンバーに移します。各組織チャンバーに最大4つの組織切片を挿入します。サンプルにラベルを付け、ウイルス特異的T細胞の組織切片を染色するために、蓋を輪ゴムでプレートに固定します。

ZI共役四量体は、最初にブロッキングバッファーで0.5マイクログラム/ミリリットルに希釈されます。溶液は、ウェルあたり1ミリリットルで24ウェルプレートにピペットで移されます。切断したばかりの組織は、ティッシュチャンバー内のプレートに移され、摂氏4度で一晩揺さぶられます。

異なるサンプルを含む組織チャンバーの間に空のウェルを挟み、その後のステップでの溶液の相互汚染を防ぎます。このステップでは、細胞外または細胞表面タンパク質に対する抗体を追加できます。洗浄には、一次インキュベーション後に冷却PBSHを含む24ウェル組織培養プレートを調製します。

ティッシュチャンバーをプレフィルドプレートに毎回20分間移して2回洗浄し、移す前にティッシュチャンバーからほとんどの液体を排出するようにしてください。また、組織チャンバーを移動するときは、1つのサンプルの内容物を別のサンプルに滴下せず、組織チャンバー内のセクションを監視して、側面に付着しないようにします。固定後、新鮮な4%パラアルデヒドをPBSで切片を室温で2時間固定します。

冷たくしたPBSHで毎回5分間2回洗浄し、四量体からの信号を増幅します。切片をウサギ抗fitzy抗体と1〜10,000の比率でブロッキングバッファーで1〜3日間インキュベートします。この段階では、細胞内エピトープに対する抗体を追加することができます。

抗体を添加する前に、細胞を透過化し、非特異的な部位をブロックするようにしてください。抗原賦活化は、シグナルを増幅することを目的とした2回目の長期インキュベーション後にも必要になる場合があります。PBSHで切片を3回、少なくとも20分間、毎回最大数時間洗浄します。

適切な蛍光標識抗体との最終インキュベーションを行います。例えば、ヤギ抗ウサギSI 3を使用してウサギ抗フィッツィ抗体に結合し、四量体染色細胞を赤色に蛍光させることができます。マウス抗体を使用して目的のタンパク質を対比染色した場合、例えばCD eightを使用してキラーT細胞を可視化し、ヤギ抗US Alexa 488を使用してマウス抗体に結合し、抗体染色細胞に緑色を蛍光させる場合、各抗体の希釈を経験的に決定する必要があります。

1〜3日間インキュベートし、このインキュベーション中はプレートとアルミホイルを包んでセクションを光から保護します。最後に、切片を再度固定して、四量体と抗体を所定の位置に固定します。Nプロファイルガレートあたり4ミリグラム/ミリグラムを含むグリセロールゼラチンを顕微鏡スライドに洗浄し、マイナス20°Cで保存し、in-situハイブリダイゼーション用の薄い切片を調製します。

SIV感染した陥凹meacの脾臓組織切片をギャグテトラマーで染色し、SIV特異的CDを標識するためにSIV特異的な凹部meacの8つの陽性T細胞の局在化量とタンパク質発現パターンを決定するために、insituテトラマー染色切片を共焦点顕微鏡で分析できるようになりました。抗体による対比染色は次のステップで失われます。先に進む前に、in situ四量体を解析することが重要です。

薄切片の作画化は、厚さ200ミクロンの切片をヒートブロックで摂氏70度で5分間加熱し、スライドから厚い切片を剥がすことから始めます。切片を取り外したら、まずプラスチック金型の底にOCTをOCTで埋めて、ドライアイスに埋め込みます。次に、ティッシュをOCTの上に置き、OCTで覆います。

クライオスタットを使用して、OCT埋め込みセクションから厚さ8ミクロンの切片を切り取り、8ミクロンの切片をサイロ化されたスライドに接着します。その後、スライドはマイナス80°Cで密閉された箱に保管し、その後のin situハイブリダイゼーションを行うことができます。標準的なin situハイブリダイゼーションは、S 35標識ウイルス特異的リブプローブを介してウイルス感染細胞を検出するために使用されます。

この手順には、核トラックエマルジョンによるセクションへのコーティングと取り付けスライドも含まれます。蛍光と互換性のあるパラマウントミディアムでは、エピチューブ青色反射装置を備えたBioRad MRC 1000共焦点顕微鏡を使用して共焦点画像を取得します。インサイチュテトラ染色は、赤色のテトラ蛍光色素にEPI one 605、インサイチュハイブリダイゼーションに緑色のCD eight 蛍光色素にEPI 2 522 DF 32を使用して視覚化されます。

現像されたラジオサインのin-situハイブリダイゼーション信号から生じる銀粒には、EPI 2つの青色反射を使用します。画像取得を開始するには、各セクションの画像を左から右、上から下に取得し、各画像を隣接する画像と約20%オーバーラップしてキャプチャするようにします。再構築されたモンタージュ画像のギャップを避けるために、Excelファイルのブロと列に従って各画像に名前を付けます。

スライドからのデータ収集が完了したら、共焦点アシスタントソフトウェアを使用して、著者から入手可能なPhotoshop 7アクション手順を使用して、各チャンネルのZシリアル画像を1つの画像に投影し、3つのチャンネルから投影された画像を1つのRGB画像に自動的にマージします。次に、結合された画像をレイヤーにつなぎ合わせて、セクション全体のモンタージュ画像を生成します。個々の銀粒と四量体の染色をモンタージュ内の細胞に関連付けます metamorph または Photoshop。

ウイルスのRNA陽性細胞と四量体陽性細胞の中心またはOIDのXY座標を割り当てます。OIDデータを各細胞の数値としてExcelファイルにエクスポートし、Excelファイルで収集したデータを使用して、セクション内のテトラマー陽性細胞とウイルスRNA陽性細胞の総数から免疫エフェクターまたはe細胞とウイルス標的またはT細胞の比率を決定し、テトラマー陽性細胞とRNA陽性細胞との間の空間的関係を捉えます。それぞれのプロットをExcelファイルからPhotoshopのPhotoshopドキュメントにコピー&ペーストします。

レイヤーの不透明度を下げて、グリッドを色と一致するように整列および拡大縮小し、選択してから、コピーして新しいレイヤーに貼り付けます。青色RNA陽性細胞の位置は、グリッドを整列させるために使用された層を破棄し、四量体陽性細胞とウイルスRNA陽性細胞の位置が平坦化された画像で明らかになります。ここに示すISTH法を使用すると、この侵入口と感染が広がるリンパ組織での膣内投与後のSIV感染に対する免疫応答を追跡できます。

感染後10日でこれらの組織部位に多数の感染細胞が存在しますが、遅くとも3日後には緑色の染色CD A陽性細胞が存在しますが、まだではありません。SIV特異的テトラ陽性細胞を赤く染色しました。したがって、免疫反応は感染をクリアするには遅すぎます。

しかし、感染後3週間で、特に侵入口で感染細胞の減少がはっきりと見られます。ISTHを使用して、減少の程度が空間的近接性とテトラマー陽性免疫エフェクター細胞の相対的な数と相関していることを示しました。N-S-I-V-R-N-A陽性標的細胞、これをin vivo E対T比と呼びます。

この感染したリンパ節のエフェクター細胞は赤、ウイルス標的は青で、この方法を使用すると、空間的関係は容易に視覚化できます。多くのエフェクター細胞とターゲット細胞が近接しており、多くのエフェクター細胞が単一のS-I-V-R-N-A陽性細胞を取り囲む領域があり、他の領域ではS-I-V-R-N-A陽性細胞が単独で立っています。ETTの比率は、セルの位置がExcelファイル内の各セルの番号によって決定およびログインされるため、単純に計算されます。

ウイルス感染の最良の制御は、緑のターゲットよりも赤いエフェクターが43対1で大きく過剰であることと相関しています。この症例では、感染が始まった子宮頸部と膣では、リンパ節のETT比率が低かった。高いETT比とピークからのウイルス量の減少との間に正の相関関係があることは、侵入口での免疫応答がより強固であることが感染のより良い制御につながることを示しています。

ここでは、非常に特異的なCDAT細胞とウイルス感染細胞をin situで同時に検出する方法を紹介しました。この技術により、抗原特異的T細胞とウイルス感染細胞を組織内で同時に可視化することができます。この手法は、この手順を行う際に、CD8陽性T細胞ベースのワクチンおよび他の非価値病原体および宿主の相互作用を評価するために適用することができる。

ハイブリダイゼーションを行う前に、すべての試薬RNAをフリーに保つことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。