Name: 同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 47 s
Description: 学ぶウイルス特異的CD8+T細胞と感染細胞の空間関係を可視化するISTH法。SIV感染組織を用いて免疫応答の定量的解析と病態予測を可能にする革新的なイミュノロジー技術です。

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我々は、銀粒子の画像をキャプチャするために共焦点顕微鏡を設定するのに援助のためにJ.セッジウィックに感謝、研究資源助成のためのナショナルセンター、NIHの研究助成金AI48484（ATH）、AI20048（RA）、及びAI066314（CJM）によって部分的にサポートされている。 RR00169（CNPRC、カリフォルニア大学、デイビス）。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li ら、科学 323、1726〜1729（2009） 。</a> その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）手続きの組み合わせ ISTHの手順は4段階に分けることができます：1）組織中の抗原特異的CD8 + T細胞のISTの染色、2）ウイルス感染 - RNA +細胞を検出するISH、3）IST -染色された細胞の共焦点顕微鏡イメージングとウイルス- RNA +細胞、4）画像解析、画像のモンタージュの建設及び四量体+とウイルスRNA +細胞のマッピングを含む。 1。抗原特異的CD8 +組織切片におけるT細胞のISTの染色。 <ol><li>ビブラトームやメスを用いて200ええと厚の切片に新鮮な組織をカット。 </li><li>チルビブラトームの滅菌PBS - Hが付いている浴室と0-2〜チル℃まではかなり急な27 °にビブラトームブレードの角度を設定します。可能な限り、組織の劣化を最小限にするために、氷上で冷やしておく。新鮮な組織はまた、それを冷やしているときにビブラトームを使用してセクションに簡単です。 </li><li>外科はさみまたは0.25センチの部分で小さく約0.5センチメートルワイドにメスで組織をカット。 〜40で、ボートや小さな皿とカバーの重量を量る° C溶融四パーセントPBSは、アガロースを溶かす低バッファに組織片を置く。組織は、皿の底に接触していることを確認してください。彼らが浮く場合組織片を押し下げ。氷の上で固める。これは通常3-5分かかります。 </li><li>ロックタイトの接着剤でコーティングビブラトーム組織ブロック。鉗子を用いてメス、としているものと組織の周りカットアガロースは、慎重に接着剤でコーティングさビブラトームブロックに壊れやすいアガロース包埋組織を移す。それは組織のブロック上に設定されると、組織片を移動しないでください。氷上で約10分乾燥させます。 </li><li>マウントの組織のビブラトームのブロックとデッドスロー前進速度と比較的高い振幅を使って200um厚の切片に組織を切る。速度と振幅の設定は、各ビブラトームによって異なります。ビブラトームが利用できない場合、または組織の切片ビブラトームに従順でない場合は、メスを用いて細い千切りに組織を切る。 </li><li>冷却したPBS - H 1 mlを入れた24ウェル組織培養プレートのウェルに設定されている組織チャンバーに絵筆を持つセクションを転送する。各組織のチャンバーに4つの組織切片に掲示。実験的なサンプル情報やゴムバンド付きプレートへの安全なフタ付きの組織培養プレートの蓋にラベルを付けます。 </li><li>また、ビブラトームでうまくカットしていない組織のために、腸のように、メスまたはカミソリ刃で可能なストリップ限り薄くカットすることができます。メスカットのセクションでよくごとに1つのセクションを置く。 </li><li>終了最先端の組織の直後に染色に進みます。固定されるまで、すべての回で劣化を最小限に抑えるために冷却セクションを保管してください。セクションが乾燥させないでください。冷却した滅菌PBS - Hのセクションを保管してください。 </li><li>は0.5 mg / mlのFITC結合テトラマーで一晩組織切片をインキュベートします。マウスまたはブロッキング溶液で1:200に希釈したこのインキュベーションの細胞外エピトープに向け非ウサギ抗体、例えば抗CD8抗体を含めることができます。このと後続のすべてのインキュベーションのために、ウェルあたり1 mlのソリューションを使用し、そしてこれと4で、後続のすべてのインキュベーション° Cロッキングプラットフォーム上でプレートとを実行します。後続の手順でソリューションの交差汚染を防ぐためによく空の少なくとも一つで区切られた別の実験試料を含む組織用チャンバーをしてください。 </li><li>主なインキュベーションの後、20分ごとに冷却したPBS - H倍（2X）を持つセクションを洗う。冷却したPBS - Hを含む別の24ウェル組織培養プレートに組織用チャンバーを転送することによりこれを行います。一つの実験サンプルから別に内容を滴下しないように注意して、組織用チャンバーを移動するとき。後続のすべてのインキュベーションおよび洗浄のために同様に適切なソリューションを含むクリーンなプレートに組織用チャンバーを転送する。セクションは、組織用チャンバーの側面に付着しないようにするための手順の間に組織用チャンバー内のセクションを監視します。 </li><li>新しいPBSと修正のセクションでは、室温で2時間4％パラホルムアルデヒドをバッファ。冷PBS - H 2X 5分ごとに洗浄する。 </li><li> 1〜3日のためにブロッキング溶液に、10,000：ウサギ抗FITC抗体、例えばBiodesign1でインキュベートする。共同標識のため、同様にこのインキュベーションで細胞内エピトープに向け非ウサギ抗体を含めることができます。このオプションでは、必要に応じてエピトープを露出させ、前の2回目のインキュベーションの細胞に浸透してブロックする。 </li><li>ホルムアルデヒド固定から抗原賦活化を必要とする細胞内エピトープに向けられた抗体を使用している場合は、電子レンジで、10秒、0.01M尿素で3回煮沸することにより、各時間のエピトープを公開。それぞれの加熱の間に2分間待ちます。沸騰溶液がウェルからセクションを強制的にできるので非常に注意してください。この問題が発生した場合は、ペイントブラシを使用してください適切な組織チャンバーの底に再び組織チャンバーの側面から、またはプレートの蓋からセクションをプッシュする。抗体は必要としない場合、抗原の検索は、この手順を省略します。 </li><li>前の2回目のインキュベーションに、細胞内エピトープに特異的な抗体を使用している場合は、PBS - Hが0.3％トリトンX - 100、および一時間の2％正常ヤギ血清を含むで組織切片でpermeabolizeとブロックの細胞。 、0.3％トリトンX - 100、2％正常ヤギ血清を含むPBS - Hの残り​​の抗体のインキュベーションを行います。 </li><li> 2回目のインキュベーションの後、数時間〜20分間、PBS - Hでセクションを洗う。 3回の洗浄の合計のために二度繰り返します。適切な蛍光標識抗体との最後のインキュベーションを行います。例えば、ヤギの抗ウサギCy3およびヤギ抗マウス-アレクサ488ブロッキング溶液で1:1000それぞれを希釈。 1〜3日間インキュベートする。光消光蛍光団として、その後このインキュベーション中にスズ箔でプレートをラップし、することにより、光から保護されたセクションを保管してください。 </li><li>数時間〜20分間、PBS - Hでセクションを洗ってください。 3回の洗浄の合計のために二度繰り返します。 </li><li> ISHポストフィックスのセクションの場所で安全な四量体と抗体の1時間、4％パラホルムアルデヒドでポストフィックスを組み合わせたISTの場合は、再度とマウントPBS - Hを持つセクションをすすいでください。 </li><li>顕微鏡スライドにセクションを転送するために絵筆を使用。グリセロール/ゼラチンを含む4mg/ml n -プロピル没食子酸やカバースリップで蛍光体の防腐剤とカバーを含むその他の固定メディアでコーティング各セクション。 -20℃での光保護スライドのコンテナに保管してスライド。組織培養プレートに洗い、アルコールで蓋にラベルを削除します。プレートを再利用することができます。 </li><li>共焦点顕微鏡で染色した組織切片を分析する。その後、ISHに進むことができます。 </li></ol> 2。 in situハイブリダイゼーションによるウイルス感染- RNA +細胞を検出する。 in situハイブリダイゼーションプロトコルのこれは、次のように4,5私たちの以前に発行されたプロトコルから変更されました。 <ol><li>再カット5〜8ミクロンの厚sectionss現場テトラマー染色切片の厚さから。 <ol><li> 200ミクロン厚の切片は、℃で5分間のスライドからセクションを分離するために70で加熱されています。 </li><li>セクションは、ドライアイス上で、OCTで埋め込まれています。 </li><li> 8ミクロンの切片厚の切片からクライオスタットで切断し、シラン処理したスライドに付着されています。 </li><li>スライドは、-80℃で保存できますin situハイブリダイゼーション、その後のために密封されたボックスにC。 </li></ol></li><li> in situハイブリダイゼーション<ol><li> 90％エタノール及びDEPC処理水に3分ごとにスライドを浸漬することにより、組織切片を再水和。 </li><li> ℃の水浴中で15分間98℃10mMのクエン酸緩衝液（pH6.0）中で加熱して組織切片を透過処理。 </li><li> 20〜30分間室温でクールな組織切片。 </li><li> 3分間のDEPC処理水で2回洗浄する。 </li><li> 10分間、0.1 M TEA（トリエタノールアミン、pH8.0）の0.25％無水酢酸にスライドを浸漬することにより組織切片をアセチル化する。 </li><li> 5分間0.1 MのTEA液（pH8.0）にスライドを移す。 </li><li> 35 Sで標識したウイルス特異的（例えば、HIV - 1など、SIV）アンチセンスプローブまたはセンス（HIV - 1のネガティブコントロール、SIV）、または35 S -標識LCMVのリボプローブ（プールされたセンスおよびアンチセンス）のセクションをハイブリダイズさせる。 </li><li> 42℃で一晩ハイブリダイゼーション後の5分℃で2xSSCで二回セクションを洗う</li><li> 5分間のSTEのセクションを（0.5MのNaCl、1mMのEDTA、20mMトリス- HCL、pH7.5）で洗浄する。 </li><li> 37 RNaseにSTEのとT1とのセクションを消化℃で30分間</li><li> 2 × SSCでのセクションに加えて5分間、50％ホルムアミドを洗ってください。 </li><li> 1 × SSCで10分間のセクションを洗ってください。 </li><li> 0.5 × SSCで15分間のセクションを洗ってください。 </li><li> 70のセクション、80と0.3 Mの酢酸アンモニウム、各5分を含む100％エタノールを脱水する。 </li><li>核トラックのエマルジョンでコーティングのセクション</li><li> 1時間暗い部屋で乾かしてください。 </li><li> 4でセクションを公開° C 11日目（SIV）と3日間（LCMV）のため。 </li><li> 3分間（コダック、猫＃146 4593）D19のセクションを開発、dH2O 30秒で洗って、4分間（コダック、猫＃146 4106）ラピッドフィクサーで修正、dH2O 5分× 3回洗浄する。 </li><li> 70％、80％と無水エタノール、5分ごとに水分を取り除く。 </li><li>蛍光互換性のあるPermount媒体のマウントスライド。 </li></ol></li></ol> 3。共焦点顕微鏡像を取得する。 <ol><li> Bio - Rad社MRC 1000年共焦点顕微鏡、またはEpi2 -ブルー反射装置を持つ他の共焦点顕微鏡でISTH画像をキャプチャ。 </li><li> 20倍（SIV）または60倍（LCMV用）で、赤四量体蛍光色素用Epi1 - 605、緑CD8蛍光色素用Epi2 - 522 DF32を使用し、銀粒子についてEpi2 -ブルーリフレクション（開発radioautographsのISHシグナル） </li><li>順番に各フィールドの3つのチャンネルで1ミクロンの間隔でZ -シリアルの画像を収集する。 </li><li>左からの各セクションから画像を取得する右、および上から下へ、およびExcelファイルでその行や列に基づいて各画像に名前を付けます。 </li><li>再構成されたモンタージュ画像のギャップを避けるために、隣接画像との〜20％オーバーラップで各イメージをキャプチャします。 </li></ol> 4。画像解析：モンタージュ画像再構成、細胞重心計算と空間分析。 <ol><li>プロジェクトZ -シリアル画像共焦点アシスタント（バージョン4.02）で、チャネルごとに単一のイメージに。 </li><li>自動的にPhotoshop 7.0のアクションの手順を使用して、1つのRGB画像に3つのチャンネルから投影されたイメージをマージする。 </li><li> Photoshop 7.0でのレイヤーで一緒にマージされた画像をつなぎ合わせによるモンタージュ画像を生成する。 </li><li>准個々の銀粒子と四量体は、細胞と染色、およびMetaMorph（バージョン7.1.3）またはPhotoshopを（筆者から入手可能）を使用してX、SIV RNA +と四量体+セルの中心のY座標を（重心）、割り当てる</li><li>各セルの数値の数字としてExcelファイルに重心データをエクスポートします。 E：T比がセクションの四量体の合計数字+およびウイルスRNA +細胞からのE​​xcelファイルから決定されています。 </li></ol>赤四量体+と青SIV RNAとの間の空間的関係は、+細胞は、PhotoshopのドキュメントにExcelファイルから、それぞれのプロットをコピーして貼り付けることによりキャプチャされます。彼らは色を選択すると青RNA +細胞の位置をコピーして新しいレイヤーにペーストする、一致するようにグリッドを調整し、スケーリングするレイヤーの不透明度を減少した後、次にグリッドを揃えるために使用される廃棄層、位置四量体の+とウイルスRNAの+細胞は、統合された画像で明らかにされます。 5。追加の注意事項感染組織を切断する場合： BSL2.5ラボで働く。カミソリの刃を持つ特別な予防策を講じる。鉗子でビブラトームブレードマウントにカミソリを置く。あなたが鉗子とでブレードを置くことができない場合は、お風呂に組織を追加する前にそれを入れ、刃を交換しないでください。終了したら切断する場合には、鉗子で刃を取り外します。除去前〜70％エタノールまたはDMQでスプレーブレード。いつものように、鋭利物容器のブレード処分する。外側の手袋を変更したり、組織またはタンク内の汚染されたPBSで各接触後に消毒剤ですすいでください。終了したら、感染性物質を扱う場合、タンク内にPBSにDMQの消毒剤を追加し、電源を切って数分放置します。どぶ除染PBS廃棄してください。その後、塩と消毒剤を除去する水でタンクを洗う。 DMQクリーンなワークスペースや調理器具。水で食器を洗います。 ビオチン化MHCモノマーから四量体を確認するには： 私はこのようなHLA - A * 0201 / B 2としてベックマンコールター社からギャグ（SLYNTVATL）、ポル（ILKEPVHGV）、または無関係MARTペプチド（ELAGIGILTV）ペプチドのいずれかで生成されたM /ペプチド分子を分子ビオチン化MHCクラスを取得します。ビオチン化HLA - A * 0301 / B 2 M /ペプチドNIAIDテトラマー施設でギャグ（KIRLRPGGK）またはネフ（QVPLRPMTYK）のいずれかで生成された分子。四量体は、FITC標識の6アリコートを添加することにより生成されるビオチン化麻木にExtraAvidin（シグマ）* 01 / B 2 M / 4.5:1の最終的なモル比に8時間の経過とともにペプチドモノマー。ゆっくりExtravidinを追加する論理的根拠は、初期の時点の間に追加さExtravidinのすべてがバインドされているすべての4つのビオチンのサイトを取得することを保証する単量体の過剰があるということです。 ExtrAvidinがバインドされているすべての4カ所を持っていないことにチャンスの少ないモノマーと左よりあるので、後で反応で、このプロセスは非効率的です。 ExtrAvidinのすべてを一度に追加し​​た場合は反応が少なく、効率的でより多くのExtravidin分子が接続されている唯一の2つまたは3つのモノマーを持っているということです。

<ol><li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li>
<li>Qingsheng, L. i, Skinner, P. J., Ha, S. -J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li>
<li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li>
<li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li>
<li>Li, Q. ingsheng, Estes, J. acobD., Schlievert, P. atrickM., Duan, L. ijie, Brosnahan, A. mandaJ., Southern, P. eterJ., Reilly, C. avanS., Peterson, M. arnieL., Schultz-Darken, N. ancy, Brunner, K. evinG., Nephew, K. arlaR., Pambuccian, S. tefan, Lifson, J. effreyD., &amp, J. ohnV. C. arlis, Haase, A. shleyT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li>
</ol>

著者に開示すべき事項はありません。

ウイルスRNAは、本報告書におけるウイルス感染細胞のマーカーとして使用されているため、ハイブリダイゼーションの前にすべての試薬は、リボヌクレアーゼフリーでなければなりません。ここで説明したin situハイブリダイゼーションの手順でその場テトラマー染色での蛍光シグナルを維持するように変更されています。 in situハイブリダイゼーションによって検出されたウイルスに感染した細胞からradioautographic信号が約1セル径の深さにあるため、その場テトラマー染色のために使用される厚さのセクションでは5 - 8 -ミクロン厚の切片に改修さでなければならない。 その場四量体にし、in situハイブリダイゼーション（ISTH）の組み合わせのこの斬新な手法では、ウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染標的細胞の空間的関係の同時可視化、マッピングおよび分析を可能にするここで説明する。このメソッドは、CD8を評価するために+ T細胞をワクチンベースおよびその他の非ウイルスの病原体と宿主の相互作用に適用することができます。画像解析の手法も、その場で相互作用する任意の2つの細胞集団、例えば、の空間的な関係を研究するために適合させることができる我々は最近、サル免疫不全のヒト以外の霊長類モデルでのHIV - 1の性的感染を研究する上で重心のマッピングの手順を使用ここで説明アカゲザル6のウイルス感染

ソリューションと試薬： <ul><li> PBS - Hのリン酸塩はRNaseを阻害するために生理食塩水を含むヘパリン（100ug/mlまたは18.7U/ml）をバッファ</li><li> RNaseを阻害するためにヘパリン（100ug/mlまたは18.7U/ml）を含むRPMIの組織培養培地</li><li> 4パーセントPBSの低融点アガロース</li><li> 2パーセント正常ヤギ血清（または蛍光標識抗体が行われた種からの血清）を含むPBS。 </li><li> 2パーセント正常ヤギ血清、0.3％トリトンX - 100を含むPBS </li><li> MHCクラスIは、FITCコンジュゲートさテトラマー</li><li>抗FITC抗体、例えばBioDesignウサギ抗FITC </li><li>高度に複数のラベル、たとえばヤギ抗ウサギ- Cy3で使用するために他の種のIgGに吸着クロスされている蛍光物質結合抗ウサギIgG </li><li>高度に複数のラベルで使用するために他の種のIgGに吸着クロスされている蛍光物質結合抗マウスIgG </li><li>新鮮なPBSは、4％パラホルムアルデヒドをバッファ</li><li> 0.01M尿素</li><li>グリセロール/ゼラチンを含む4mg/ml n -プロピル没食子酸</li></ul>特別な機器<ul><li>ビブラトーム</li><li>外科用メス</li><li>剃刀の刃</li><li>外科はさみ</li><li>ロックタイトクイックセット瞬間接着剤（製品＃46551） </li><li>鉗子</li><li> ＃2、ラクダの毛のペイントブラシ。所望の厚さにカミソリの刃でトリミングすることができます</li><li> 24ウェル平底組織培養プレートなどファルコンカタログ＃353226 </li><li>組織用チャンバー</li><li>スズ箔</li><li>段ボールスライドのフォルダなどフィッシャーカタログ＃12-587-10 </li><li>共焦点顕微鏡</li></ul> ISTの試薬のクイックリファレンス PBS - H（リン酸ヘパリンと緩衝生理食塩水） <ul><li> 450ミリリットル1X PBS </li><li> 50 mlの1X PBS + 10Xヘパリン</li></ul> 1 × PBS + 10Xヘパリン<ul><li> 500ミリリットル1X PBS </li><li> 500mgのヘパリン粉末（ドライケミカルストレージシェルフ上にある） </li></ul> PBS - H / 2％NGS（正常ヤギ血清） <ul><li>ファルコンチューブの49 mlのPBS - H </li><li> 1 mlのNGS（-20冷凍庫に1mlのアリコートに見られる） </li></ul> PBS - H / 2％NGS / 0.3％トリトンX - 100 <ul><li>ファルコンチューブの49 mlのPBS - H / 0.3％トリトンX - 100 </li><li> 1 mlのNGS（-20冷凍庫に1mlのアリコートに見られる） </li></ul> PBS - H / 0.3％トリトンX - 100 <ul><li> 500ミリリットルPBS - H </li><li> 1.5ミリリットルトリトンX - 100（これは、ドライケミカルストレージシェルフ上にある濃厚な液体です。） </li></ul> 4パーセントLMPアガロース<ul><li> 2グラムLMPアガロース粉</li><li> 50ミリリットルのPBS </li><li>粉が溶けるまで混合、電子レンジまで振る。 </li></ul> GG - NPG（n -プロピルgalateとゼラチングリセリン<ul><li>溶けて50度の水浴中にグリセロールゼラチンの瓶を置きます</li><li>プロピルgalate（テリスの棚にある）の0.06 gを追加し、よく振る</li><li>溶けるまで時々振り、水浴してください。 </li><li> 1 mlのチューブ（茶色のチューブ）に分注し</li></ul> 4％パラホルムアルデヒド<ul><li> 4gのパラホルムアルデヒド粉末（ドライケミカルストレージシェルフ上にある） </li><li> 10をメスシリンダーでmlのPBS - H言いふらすPFパウダーを追加</li><li>ボリュームは約70 mlを達するまで少し水を加える</li><li> NaOHのいずれかのスポイトを追加。 </li><li> （通常約20〜30分）に溶解するまで攪拌</li><li> pHが7-8の間に達するまで塩酸を追加。 </li><li>水で100mlにボリュームをもたらす。 </li></ul>尿素0.01 M <ul><li> 0.3グラム尿素（ドライケミカルストレージシェルフ上にある） </li><li>水500ml </li></ul>

同時にウイルス特異的cd8 + t細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

それらの感染細胞のターゲットの番号と場所への相対的な数字と場所のウイルス特異的CD8 + T細胞が隙間から慢性的な永続的な感染症の範囲という結果を決定する上で非常に重要であると考えられている。ここでは、ウイルス特異的CD8 + T細胞を検出するためにその場四量体（IST）染色とin situで結合した免疫エフェクター（E）ウイルス特異的CD8 + T細胞と感染のターゲット（T）の間の空間的および定量的な関係を評価するための方法を説明します。免疫防御と感染の間に戦いが行われる組織ではウイルス- RNA +細胞を検出するハイブリダイゼーション（ISH）。 T比：ISTの染色とISHの組み合わせ、簡略ISTHは、免疫エフェクター細胞とターゲット、およびEの安易な決定の位置の可視化とマッピングが可能になります。順番にこれらのパラメータは、空間的近接性、および初期の感染の転帰を予測する免疫応答のタイミングと大きさの関係を決定するために使用することができます。

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 + T細胞の空間的な近接性の、及びこれらの免疫エフェクターと標的の間の量的関係を決定することが可能に感染の結果に。

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

ウイルス特異的CD8+ T細胞の数および位置と、その標的となる感染細胞の数および位置との相対的な関係は、ウイルスの排除から慢性持続感染に至るまでの転帰を決定づける上で極めて重要であると考えられています。本稿では、免疫防御と感染の攻防が行われる組織において、ウイルス特異的CD8+ T細胞を検出するin situテトラマー（IST）染色と、ウイルスRNA陽性細胞を検出するin situハイブリダイゼーション（ISH）を組み合わせ、免疫エフェクター（E）であるウイルス特異的CD8+ T細胞と感染標的（T）との空間的および定量的な関係を評価する方法について述べます。IST染色とISHを組み合わせた手法（略称：ISTH）により、免疫エフェクター細胞と標的細胞の位置の可視化およびマッピングが可能となり、E:T比を容易に算出することができます。これらのパラメータを用いることで、空間的な近接性と、初期感染における転帰を予測する免疫応答のタイミングおよび強度との関係を決定することが可能になります。

ISTHとして知られる、in situ ハイブリダイゼーションとテトラマー染色の組み合わせ手法を用いることで、ウイルス抗原特異的な免疫エフェクター細胞と、ウイルスに感染した細胞および組織との相対的な数および空間的関係を決定することができます。ISTHは、まず新鮮なSIV感染組織をアガロースに包埋することから始まります。組織はビブラトームを用いて200 micronの厚さに切断され、ウイルス抗原の染色が行われます。FITC標識MHCテトラマーを用いて、特定のCD8陽性細胞を染色します。凍結後、これらの染色切片をクライオスタットで8 µmの厚さにさらに切断し、in situ ハイブリダイゼーションを行うことでウイルス感染細胞を局在化させます。共焦点顕微鏡を用いて二重染色切片を画像化し、最終的に元の厚い切片を再構成することで、免疫エフェクター細胞と標的細胞との関係を明らかにします。この手順を用いて初期のSIV感染を調べることで、その後の疾患の重症度を良好に予測できることが証明されました。こんにちは。私はミネソタ大学微生物学部のAshley HA研究室のChinen Leeです。私はミネソタ大学獣医生物医学部の助教授、Pam Skinnerです。本日は、in situ tetramer染色とin situ hybridizationを組み合わせた手法、略してISTHの手順について解説します。本日実演するin situ tetramer染色とin situ hybridizationの組み合わせに加え、私たちは通常、in situ tetramer染色と免疫組織化学染色を組み合わせて、抗原特異的CD8+ T細胞のin situでの位置、数、およびタンパク質発現プロファイルを決定しています。本日の厚切り切片を用いたin situ tetramer染色の補助はHeon Kim博士とTerry Matala氏が、薄切り切片の作製とin situ hybridizationの補助はSo氏が担当します。それでは始めましょう。本手順を開始するには、滅菌済みのPBSHを入れたVibramバスを2 °Cまで冷却します。バイブレーターブレードの角度を27度に設定してください。可能な限り、新鮮な組織は氷上で冷却して保管し、組織採取後24時間以内に手順を開始してください。分解による冷却を最小限に抑えるため、新鮮な組織を切り出し、結合組織を取り除いた後、メスを用いて検体を細かく切り刻み、ウェーボートに入れ、40°C程度で融解させたPBS中の4%低融点アガロースで覆います。組織が容器の底に接していることを確認し、組織片が浮いている場合は押し下げ、氷上で3〜5分間凝固させます。ここでは脾臓組織を使用していますが、メスを用いてリンパ節、膣、子宮頸部、子宮、またはその他の新鮮な組織を使用することも可能です。組織周囲のアグロスを切り取り、ピンセットを使ってアグロスに包まれた組織を組織ブロックに慎重に移します。続いて、Vibram組織ブロックにLoctite接着剤を塗布します。組織片を組織ブロックにセットした後は、移動させないでください。氷上で約10分間乾燥させます。次に、組織ブロックを振動切片機に装着し、前進速度を極めて低速に、振幅を比較的高く設定して、組織を200 µm厚の切片に切断します。ペイントブラシを用いて、切断した切片を、1 mLの冷却したPBSHで満たした24ウェル組織培養プレートのウェル内に設置された専用の組織チャンバーに移行させます。各組織チャンバーに最大4枚の組織切片を入れます。サンプルにラベルを貼り、ウイルス特異的T細胞の組織切片染色を行うため、ゴムバンドでプレートの蓋を固定します。ZI結合テトラマーをまずブロッキングバッファーで0.5 micrograms per milliliterに希釈します。この溶液を24ウェルプレートに1ウェルあたり1 milliliterずつ分注します。切出したばかりの組織をプレートの組織チャンバーに移し、4 degrees Celsiusで一晩ロッキングします。以降のステップにおいて溶液の相互汚染を防ぐため、異なるサンプルを含む組織チャンバーの間には空のウェルを1つ設けてください。このステップで、細胞外または細胞表面タンパク質に対する抗体を添加することができます。洗浄用に、一次インキュベーション後に使用する冷却したPBSHを入れた24ウェル組織培養プレートを準備してください。組織チャンバーをあらかじめ溶液を満たしたプレートに移し、1回20分間、計2回洗浄します。この際、チャンバーを移す前に、チャンバー内の液体の大部分を必ず排出してください。また、組織チャンバーを移動させる際に、あるサンプルの内容物が別のサンプルに滴り落ちないように注意し、組織切片がチャンバーの側壁に貼り付いていないかを確認してください。固定後、PBSで調製した新鮮な4%パラアルデヒドを用いて、室温で2時間切片を固定します。テトラマーからの信号を増幅させるため、冷PBSHで5分間ずつ2回洗浄します。切片をブロッキングバッファーで1:10,000に希釈したウサギ抗Fitzy抗体とともに1〜3日間インキュベートします。この段階で、細胞内エピトープに対する抗体を追加することができます。抗体を添加する前に、細胞の透過処理を行い、非特異的サイトをブロッキングしてください。また、シグナルを増幅させるための2回目の長時間インキュベーション後に、抗原賦活化が必要になる場合があります。切片をPBSHで3回洗浄し、1回あたり少なくとも20分から数時間かけて洗ってください。適切な蛍光標識抗体を用いて最終インキュベーションを行います。例えば、ウサギ抗Fitzy抗体に結合させてテトラマー染色細胞を赤色に蛍光させるために、goat anti rabbit SI threeを使用することがあります。キラーT細胞を可視化するためにCD eightなどの目的タンパク質をマウス抗体で対比染色した場合は、goat anti-US Alexa 488を使用してマウス抗体に結合させ、抗体染色細胞を緑色に蛍光させることができます。各抗体の希釈倍率は経験的に決定する必要があります。1〜3日間インキュベートします。このインキュベーション中およびその後は、光によって蛍光が消光するため、プレートをアルミホイルで包んで遮光してください。最後に、テトラマーと抗体を固定するために、再び切片を固定します。洗浄後、4 mg/mLのN-プロピルガレートを含むグリセロールゼラチンを用いて顕微鏡スライドに封入し、in situ ハイブリダイゼーション用の薄切片を調製するまで-20 °Cで保存します。in situテトラマー染色を施した切片を共焦点顕微鏡で解析し、抗原特異的CD8+ T細胞の局在、数、およびタンパク質発現パターンを決定します。表示されている画像は、SIV感染したレシピエントマカクの脾臓組織切片であり、SIV特異的CD8+ T細胞を標識するためにgagテトラマー、CD20抗体、およびCD3抗体で染色されています。抗体による対比染色は次のステップで消失するため、先に進む前にin situテトラマーの解析を行うことが重要です。200 µm厚の切片をヒートブロックを用いて70 °Cで5分間加熱し、スライドガラスから剥離させてから、薄切の手順を開始します。切片が剥離したら、まずプラスチックモールドの底部にOCTを充填し、その上に組織を配置してさらにOCTで覆い、ドライアイス上でOCTに包埋します。クライオスタットを用いて、OCT埋包切片から厚さ 8 µm の切片を作成し、シロナイズ処理したスライドガラスに貼り付けます。これらのスライドは、その後のin situハイブリダイゼーションに向けて、密封容器に入れて -80 °C で保存可能です。標準的なin situハイブリダイゼーションを用い、$^{35}$S 標識ウイルス特異的リボプローブによってウイルス感染細胞を検出します。本手順には、切片への核トラックエマルションのコーティングおよびスライドの封入も含まれます。蛍光適合性のParamount媒質を用い、エピチューブブルー反射装置を備えたBioRad MRC 1000共焦点顕微鏡を使用して共焦点画像を撮像します。in situテトラマー染色は、赤色テトラマー蛍光色素にはEPI one 605を、in situハイブリダイゼーション用の緑色CD8蛍光色素にはEPI 2 522 DF 32を用いて可視化します。現像されたラジオオートグラフにおいて、in-situ hybridizationシグナルに由来する銀粒子を観察するには、EPI two blue reflectionを使用してください。画像取得を開始する際は、各セクションの画像を左から右へ、上から下へと取得し、隣接する画像と約20%重なるように撮影してください。再構成したモンタージュ画像に隙間が生じないよう、Excelファイルにて各画像に行と列に基づいた名前を付けて管理してください。スライドからのデータ収集が完了したら、著者から提供されるPhotoshop 7のアクションプロシージャを用いて、共焦点アシスタントソフトウェアで各チャネルのZ系列画像を単一の画像に投影し、3つのチャネルから投影された画像を1つのRGB画像に自動的に統合します。次に、統合された画像をレイヤーで繋ぎ合わせ、切片全体のモンタージュ画像を作成します。MetamorphまたはPhotoshopを使用して、モンタージュ内の個々の銀粒子およびテトラマー染色を細胞に関連付けます。ウイルスRNA陽性細胞およびテトラマー陽性細胞の中心のXY座標またはOIDを割り当てます。OIDデータを数値としてExcelファイルにエクスポートし、Excelファイルに収集されたデータを用いて、切片内のテトラマー陽性細胞とウイルスRNA陽性細胞の総数から、免疫エフェクター細胞（E細胞）とウイルス標的細胞（T細胞）の比率を算出し、テトラマー陽性細胞とRNA陽性細胞の間の空間的関係を把握します。Excelファイルからそれぞれのプロットをコピーし、Photoshopのドキュメントに貼り付けます。レイヤーの不透明度を下げてグリッドを調整およびスケールさせ、色と選択範囲を一致させた後、新しいレイヤーにコピー＆ペーストします。青色のRNA陽性細胞の位置を確認し、グリッドの調整に使用したレイヤーを削除すると、統合された画像にテトラマー陽性細胞およびウイルスRNA陽性細胞の位置が表示されます。ここで示したISTH法を用いることで、腟内接種による侵入経路および感染が広がるリンパ組織におけるSIV感染に対する免疫応答を追跡することが可能です。感染後10日目には、これらの組織部位に多数の感染細胞が存在していますが、その3日後になっても、緑色に染色されたCD8陽性細胞は見られるものの、赤色に染色されたSIV特異的テトラマー陽性細胞はまだ現れていません。したがって、免疫応答は感染を排除するには遅すぎることになります。しかし、感染から3週間後には、特に侵入部位において、感染細胞の減少が明確に観察されます。我々はISTHを用いて、この減少の程度が、テトラマー陽性の免疫エフェクター細胞との空間的近接性および相対的な数と相関していることを示しました。N-S-I-V-R-N-A陽性の標的細胞に対する比率であり、これをin vivo E:T比と呼びます。この方法を用いることで、感染したリンパ節におけるエフェクター細胞を赤色、ウイルス標的細胞を青色として、空間的な関係を容易に可視化できます。多くのエフェクター細胞と標的細胞が近接しており、多数のエフェクター細胞が単一のS-I-V-R-N-A陽性細胞を取り囲んでいる領域がある一方で、S-I-V-R-N-A陽性細胞が単独で存在する領域もあります。細胞の位置を特定し、Excelファイルにそれぞれの数を記録することで、E:T比は単純に算出されます。ウイルス感染の最も良好な制御は、赤色で示されるエフェクター細胞が緑色の標的細胞に対して43対1という大幅な超過状態にあることと相関しています。本ケースでは、感染が開始した子宮頸部および腟において、リンパ節よりもE:T比が低くなっていました。高いE:T比とピーク時からのウイルス量の減少との間に正の相関があることは、侵入口におけるより強固な免疫応答が、より良好な感染制御につながることを示しています。以上で、非常に特異的なCD8+ T細胞とウイルス感染細胞をin situで同時に検出する方法について説明しました。この手法を用いることで、組織内における抗原特異的T細胞とウイルス感染細胞を同時に可視化することが可能になります。本手法は、CD8陽性T細胞ベースのワクチンの評価や、ワクチン以外の病原体と宿主の相互作用の解析に応用することができます。in situ ハイブリダイゼーションを行う前に、すべての試薬をRNaseフリーに保つことが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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Research

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Biology

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