土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

こんにちは。ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部のStephen Harlem研究室のSan Leeです。本日は、森林土壌から高分子量ゲノムDNAを抽出する方法をご紹介します。この手法は、多種多様な土壌や堆積物のタイプにも適用可能です。抽出した高分子量ゲノムDNAは、土壌微生物コミュニティのフォレスターライブラリーの構築に使用します。

これらのライブラリを用いることで、異なる土壌層に分かれた微生物コミュニティの多様性と代謝能を研究することができます。それでは始めましょう。本プロトコルは、細胞溶解から開始します。

最初のステップは、β-メルカプトエタノールを加えて濃度を0.5%にし、変性バッファーを完成させることです。最良の結果を得るためには、変性溶液は毎回調製して使用してください。あるいは、4°Cで保存された調製後1週間未満のバッファーを使用してください。次のステップでは、液体窒素容器、オートクレーブ、およびあらかじめ冷却した乳鉢、乳棒、スパチュラが必要になります。

あらかじめ冷却した乳鉢に、2 gの凍結土壌サンプルを入れます。変性溶液を1 mL加えます。次に、土壌が完全に浸るまで液体窒素を加えます。

あらかじめ冷却した乳棒を使用して、土壌粒子が粉末状で均一になり、サンプルが溶け始めるまでサンプルの摩砕を行います。その後、液体窒素を追加し、摩砕工程を繰り返します。これで、あらかじめ冷却したスパチュラを用いた細胞溶解工程が完了します。

粉砕したサンプルを50 milliliterのコニカルチューブに移します。すぐにDNA抽出ステップに進む場合はサンプルを氷上に保持し、それ以外の場合はminus 80 degrees Celsiusで保存します。抽出バッファーの使用直前に、hexa deco trimethyl ammonium bromide（CTAB）およびSDSを添加して抽出バッファーを調製してください。

CTABが結晶化していないか確認し、結晶化している場合は、次へ進む前に60°Cで溶解させてください。その後、最終濃度が1%になるように溶液に加えます。次に、20% SDS溶液を最終濃度が2%になるまで加えます。乳白色の懸濁液が形成されますが、これは正常な状態です。

SDSを添加した後、10〜15分後に60 °Cで保存し、調製した抽出バッファーの均一性を維持します。抽出バッファーが十分に溶解し、均一になったら、土壌サンプルに抽出バッファーを9 mL加え、低速で短時間ボルテックスして混合します。抽出バッファーを加えたサンプルを65 °Cのハイブリダイゼーションオーブンで40分間インキュベートします。

インキュベーションの間、10分ごとにチューブを静かに転倒混和させるか、ローターの最低速度でチューブを連続的に回転させます。インキュベーション後、溶液にわずかな粘性が現れる場合があります。次のステップでは、クロロホルム・イソアミルアルコールを用いて、溶解混合液中の有機物からDNAを精製します。

まず、フード内でサンプルを約10〜14 °C、1800 Gsで10分間遠心分離します。上層のベージュ色の層と下層の有機層を避け、ピペットチップをチューブの壁面に沿って慎重に滑らせながら、DNAを含む上澄み液を回収します。この上澄み液を、20 mLのクロロホルム・イソアミルアルコール（CIAA）が入った、あらかじめ冷却した50 mLチューブに移します。次に、同じサンプルに対して抽出工程をさらに2回繰り返します。その間、DNA抽出液とクロロホルム・CIAAはフード内の氷上で保持してください。

2回目のDNA抽出では、残留抽出バッファーを含む土壌ペレットが入ったチューブに戻り、抽出バッファーをさらに5 mL加えます。1 mLチップで静かに撹拌して混ぜ合わせ、前回と同様に短時間ボルテックスしてペレットを再懸濁させます。今回は65 °Cで10分間インキュベートします。

その後、1800 Gsで10分間遠心分離します。ドラフト内にて、約10～14 °Cの条件下で、上清をクロロホルム、イソアミルアルコール（またはクロロホルム：イソアミルアルコール混合液）および前回の抽出で得られた上清を含むチューブに回収します。土壌サンプルから可能な限り多くのDNAを抽出するため、抽出工程全体をもう一度繰り返します。

土壌サンプルの抽出を計3回完了したら、回収した上澄み液とクロロホルムを含むチューブを、ローテーターを用いて1.25 rpmで10分間、非常に緩やかに振盪します。この混合ステップの後、チューブを1800 Gsで20分間、約10〜14 °Cで遠心分離します。遠心分離後、水相と有機相の界面を乱さないよう、SNATを1〜2 mL残して、水相を新しい超遠心管に注意深く移します。次に、DNAを沈殿させるため、0.6 mLのイソプロパノールを加えます。

回収した上清1 mLごとに、チューブを数回静かに反転させて混合します。この時点で、DNAが長い糸状に沈殿するのが見える場合があります。その後、DNAをイソプロパノールとともに室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、遠心分離によってDNAをペレット化します。遠心機にチューブをセットする際、DNAペレットが形成される位置を確認できるよう、チューブの隅に印を付けてください。16,000 GSで20分間、20～25 °Cで遠心分離します。遠心分離後、デカンテーションまたは吸引によってイソプロパノールを除去します。DNAペレットを紛失しないよう注意してください。ペレットの大きさは、抽出効率や土壌サンプルのバイオマスに応じて、ほとんど見えないサイズから幅9 mmまで異なります。DNAペレットを室温で5～20分間乾燥させます。ペレットが乾燥した後は、乾燥させすぎないように注意してください。

DNAを200から400 µLのTEバッファーで再懸濁します。軽くタッピングして混ぜ合わせます。DNA溶液を1.5 mLチューブに移します。

DNAを4°Cで一晩保存します。土壌サンプルからDNAが抽出された後、DNAを完全に溶解させるために、サンプルの濃度およびDNA完全性を確認する以降のステップは標準的な手順であり、Hallam研究室による別のJoVEプロトコルに詳細に記載されています。任意の法を用いてDNA濃度を決定してください。

また、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いて、DNAサンプルの10〜20 µLを泳動させ、高分子量DNAの完全性を確認します。後続のアプリケーションに応じて、DNAの代表的なサイズは36 kb以上である必要があります。次に塩化セシウム密度勾配遠心分離の工程に進みます。あるいは、超遠心分離を行う前に、DNAを-20 °Cまたは-80 °Cで保存することも可能です。

次のステップでは、塩化セシウム密度勾配遠心分離を用いて不純物を除去し、DNAをさらに精製します。その後、塩化セシウム密度勾配遠心分離で濃縮し、AmConおよびMicroCon遠心フィルターデバイスを用いてDNAをさらに精製します。塩化セシウム密度勾配遠心分離は高品質なDNAを得るための鍵となる工程であり、Hallam研究室による別のJoVEプロトコルで詳細に説明されています。塩化セシウム密度勾配遠心分離および濃縮ステップを行った後、任意の法を用いてDNA濃度を確認してください。

次に、PFGEを用いてDNAのごく少量サンプルを泳動し、高分子量DNAの完全性を再度確認します。塩化セシウム超遠心分離の前後に実施したゲル泳動の結果に示すように、2gの森林土壌から単離されたゲノムDNAの総量は10から180 µgの範囲となります。単離されたDNAのサイズ範囲は通常40から60 kbの間であり、ここに塩化セシウム超遠心分離前後のゲノムDNAサンプルのクロマトグラムを示します。

このステップによりDNAの純度が向上し、260/280比が1.3から1.6へと上昇し、その後1.8から1.9まで改善しました。さらに、フミン酸の混入を示す230ナノメートルにおけるピーク吸光度は、遠心分離後に正常に低減されました。以上で、土壌微生物コミュニティから高分子ゲノムDNAを単離する方法について解説しました。

この手順を行う際は、指示に従って抽出および変性バッファーを正確に調製することが重要です。また、イソプロパノール沈殿後、DNAペレットに触れないよう注意してください。塩化物濃度勾配遠心分離後にDNAバンドを回収します。

DNAの回収率を最大にするため、シリンジをTEで洗浄することを忘れないでください。そして最後に、提案したすべてのステップで、単離したDNAの量と質を確認してください。以上で完了です。

ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。