土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

こんにちは、ブリティッシュコロンビア大学微生物学・免疫学部のスティーブン・ハーレム研究室のサン・リーです。今日は、森林から土壌への高分子量ゲノムDNA抽出の手順を示し、さまざまな土壌や堆積物の種類にも適用できます。高分子量ゲノムDNAを使用して、土壌微生物群集のフォレストメーターライブラリを構築します。

これらのライブラリーを手にすることで、異なる土壌の地平線に分断された微生物群集の多様性と代謝の可能性を研究することができます。それでは始めましょう。このプロトコールは細胞溶解から始まります。

最初のステップは、ベタマーキャプトエタノールを0.5%の濃度に添加して変性緩衝液を完成させることです最良の結果を得るには、変性溶液を毎回新鮮にします。あるいは、1週間未満のバッファーを摂氏4度に保ったものを使用してください。次のステップでは、液体窒素の実行者とオートクレーブ、および事前に冷却された乳鉢の乳棒とヘラが必要になります。

2グラムの凍結土壌サンプルを事前に冷却したモルタルに入れます。変性溶液を1ミリリットル加えます。次に、液体窒素を加えて土壌を完全に覆います。

事前に冷却した乳棒を使用して、土壌粒子が粉状で均質に見え、サンプルが溶け始めるまでサンプルを粉砕します。次に、液体窒素をさらに追加し、粉砕ステップを繰り返します。これで、予め冷却したヘラを使用した細胞溶解ステップが完了します。

粉砕したサンプルを50ミリリットルの円錐管に移します。サンプルを氷上に置いてすぐにDNA抽出ステップに進むか、摂氏マイナス80度で保存します。リットルで使用する場合は、DNA抽出を開始する直前に、ヘキサデコトリメチルアンモニウムブロマイドまたはCTABおよびSDSを添加して抽出バッファーを完成させます。まずは。

CTABが結晶化しているかどうかを確認し、結晶化している場合は、摂氏60度で溶解してから続行します。次に、それを溶液に加えて総濃度1%次に、最終濃度20%にSDS溶液を2%加えます乳白色懸濁液。それは正常です。

SDSを添加したら、完成した抽出バッファーを10〜15分後に摂氏60度で保存することにより、均一に保ちます。抽出バッファーが十分に溶解して均質になったら、9ミリリットルの抽出バッファーを土壌サンプルに加え、低速で短時間ボルテックスして混合します。サンプルを抽出バッファーと混合し、摂氏65度のハイブリダイゼーションオーブンで40分間インキュベートします。

インキュベーション中は、10分ごとにチューブを静かに反転させるか、ローターの最低速度でチューブを連続的に回転させます。インキュベーション中、インキュベーション後に溶液がわずかに粘性に見える場合があります。次のステップは、クロロホルムイソアミルアルコールを使用して、溶解混合物中の有機材料からDNAを精製することです。

まず、フード内で1800 Gで10分間、フード内で約10〜14°Cで遠心分離し、ピペットチップをチューブの側面に沿って慎重にスライドさせて、上のベージュの層と下部の有機層を避けて、上清を含むDNAを収集します。上清を20ミリリットルのクロロホルムISLアルコールを含む予め冷却した50ミリリットルのチューブに移すか、次に、同じサンプルで抽出プロセスをさらに2回繰り返します。その間、DNA抽出物とクロロホルムi a aをフード内の氷上に保ちます。

2回目のDNA抽出では、抽出バッファーが残っている土壌ペレットの入ったチューブに戻り、さらに5ミリリットルの抽出バッファーを追加します。1ミリリットルの先端で穏やかにかき混ぜて混合し、短時間ボルテックスしてペレットを前と同じように再懸濁します。今度は摂氏65度で10分間インキュベートします。

その後、1800Gで10分間遠心分離します。フード内の摂氏約10〜14度で、上清をクロロホルム、イソアミルアルコールまたはクロロホルムi a aと前の抽出からの上清を含むチューブに移します。.抽出プロセス全体をもう一度繰り返して、土壌サンプルからできるだけ多くのDNAを抽出します。

土壌サンプルで合計3回の抽出が完了したら、収集した上膜とクロロホルムiaを含むチューブを回転プレート上で1.25RRP mで10分間非常に穏やかに振ってくださいこの混合ステップの後、チューブを1800Gで20分間、摂氏約10〜14°Cで遠心分離します。遠心分離後、水相と有機相の間の界面を乱さないように、水相を新しい超遠心チューブに慎重に移し、1〜2ミリリットルのSNATを残します。DNAを沈殿させるために、0.6ミリリットルのイソプロピルアルコールを加えます。

収集した上清の各ミリリットルに対して、チューブを数回穏やかに反転させて混合します。この時点で、DNAが長い糸に沈殿するのを見ることができるかもしれません。次に、DNAをイソプロパノールと室温で30分間インキュベー

インキュベーション後、それは遠心分離機にそれを置くようにチューブの1つのコーナーを遠心分離機にマークしてDNAをペレット化する時間です あなたはDNAペレットを期待する場所を知っているので、遠心分離後20〜25°Cで16、000GSでスピンし、デカンテーションや真空吸引によってイソプロピルアルコールを除去します。DNAペレットは、ほとんど見えないものから幅9ミリメートルまでの大きさで、抽出効率や土壌試料中のバイオマスにもよりますが、DNAペレットを失わないように注意し、室温で5〜20分間乾燥させます。ペレットが乾燥しているときに乾燥しすぎないように注意してください。

DNAを200〜400マイクロリットルのteに再懸濁します。優しく叩くように混ぜます。DNA溶液を1.5ミリリットルのチューブに移します。

DNAを一晩中摂氏4度に保ちます。DNAが土壌サンプルから抽出されたら、DNAを完全に溶解するために、サンプルの濃度とDNAの完全性を確認するための残りのステップは標準的な手順であり、Hallam研究室の別のJoVEプロトコルで詳細に説明されています。お好みの方法を使用してDNA濃度を測定します。

また、パルスフィールドゲル電気泳動またはPFGEを使用してDNAサンプルを10〜20マイクロリットル使用することにより、高分子量DNAの完全性を確認します。DNAサイズの中央値は、ダウンストリームアプリケーションに応じて36キロベース以上である必要があります。以下の塩化セシウムグラジエント遠心分離ステップに進むか、超遠心分離前にDNAをマイナス20°Cまたはマイナス80°Cで保存することができます。

次のステップは、塩化セシウム勾配遠心分離濃縮液に続いて不純物を除去してDNAをさらに精製し、AmConおよびMicroCon遠心フィルターデバイスを使用してDNAをさらに精製するために、塩化セシウム勾配遠心分離を使用することです。塩化セシウム勾配遠心分離は、高品質のDNAを達成するための鍵であり、Hallam研究室の別のJoVEプロトコルで詳細に説明されています。塩化セシウムグラジエントの遠心分離と濃縮のステップを行った後、選択した方法でDNA濃度を確認してください。

次に、PFGEを使用してDNAの小さなサンプルを使い果たすことにより、高分子量DNAの完全性をもう一度確認します。2グラムの強制土壌から単離されたゲノムDNAの総量は、塩化セシウム超遠心分離の前後のゲルランで示されるように、10〜180マイクログラムの範囲です。単離されたDNAのサイズ範囲は通常40〜60キロベースで、ここに示されているのは、塩化セシウム超遠心分離前後のゲノムDNAサンプルのクロマトグラムです。

このステップにより、DNAの純度が向上し、2つの60と2つの80の比率が1.3から1.6に増加し、その後1.8から1.9になります。さらに、フミン酸汚染を意味する230ナノメートルでのピーク吸光度は、遠心分離後にうまく低減されました。土壌微生物群集から高分子ゲノムDNAを単離する方法をお見せしました。

この手順を実行するときは、指示に従って抽出および変性バッファーを正確に作成することを覚えておくことが重要です。また、イソプロピルアルコールの沈殿後にDNAの口蓋に届かないように注意してください。塩化物グラジエントセントリフィケーション後にDNAバンドを回復したとき。

DNAの回収率を最大化するために、シリンジをTEですすぐことを忘れないでください。そして最後に、提案されたすべてのステップで単離されたDNAの量と質を確認します。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。