Name: アセンブリは、チューニングとタンパク質イメージングのためApertureless近距離赤外線顕微鏡の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-25T03:33:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶ、アパーチャレス近距離赤外線顕微鏡の組み立てと調整方法。可視レーザーを用いた赤外線ビームの位置合わせと、タンパク質凝集体のナノスケールイメージング技術を習得できます。

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<ol><li>Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+the+surface+of+self-assembled+polystyrene-b-poly%28methyl+methacrylate%29+diblock+copolymer+films+using+apertureless+near-field+IR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy.</a> Langmuir. 24, 6946-6951 (2008).</li>
<li>Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared-reflection-mode+near-field+microscopy+using+an+apertureless+probe+with+a+resolution+of+lambda%2F600%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600.</a> Opt. Lett. 21, 1315-1317 (1996).</li>
<li>Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+visible+and+mid-infrared+scattering-type+near-field+optical+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes.</a> J. Microsc. 210, 311-314 (2003).</li>
<li>Kim, Z. H., Leone, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization-selective+mapping+of+near-field+intensity+and+phase+around+gold+nanoparticles+using+apertureless+near-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy.</a> Optics Express. 16, 1733-1741 (2008).</li>
<li>Bridger, P. M., McGill, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nanometer-scale+optical+property+discrimination+by+use+of+a+near-field+scanning+apertureless+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope.</a> Opt. Lett. 24, 1005-1007 (1999).</li>
<li>Stebounova, L., Akhremitchev, B. B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+weak+scattered+signal+in+apertureless+near-field+scanning+infrared+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 74, 3670-3674 (2003).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Pollack, S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apertureless+Scanning+Near-Field+Infrared+Microscopy+of+a+Rough+Polymeric+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface.</a> Langmuir. 17, 2774-2781 (2001).</li>
<li>Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D. W., Novotny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facts+and+Artifacts+in+Scanning+Near-Field+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 81, 2492-2498 (1997).</li>
<li>Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact-free+near-field+optical+imaging+by+apertureless+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy.</a> Appl. Phys. Lett. 77, 621-623 (2000).</li>
<li>Palanker, D. V., Simanovskii, D. M., Huie, P., Smith, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+Contrast+Parameters+and+Topographic+Artifacts+in+Near-Field+Infrared+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy.</a> J. Appl. Phys. 88, 6808-6814 (2000).</li>
<li>Akhremitchev, B. B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G. C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir. 18, 5325-5328 (2002).</li>
<li>Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+Spectroscopic+Mapping+of+Single+Nanoparticles+and+Viruses+at+Nanoscale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution.</a> Nano Lett. 7, 1307-1310 (2006).</li>
<li>Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nano-chemical+mapping+performed+by+an+AFM-based+%28%22AFMIR%22%29+acousto-optic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique.</a> Ultramicroscopy. 107, 1194-1200 (2007).</li>
<li>Yang, D. S., Yip, C. M., Huang, T. H. J., Chakrabartty, A., Fraser, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+Amyloid-%CE%B2+Aggregation+Pathway+with+Chemical+Chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones.</a> J. Biol. Chem. 274, 32970-32974 (1999).</li>
<li>Meadows, P. Y., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Microscopy+Studies+of+Fibronectin+Adsorption+and+Subsequent+Cellular+Adhesion+to+Substrates+with+Well-Defined+Surface+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries.</a> Langmuir. 21, 4096-4107 (2005).</li>
</ol>

アセンブリは、チューニングとタンパク質イメージングのためapertureless近距離赤外線顕微鏡の使用

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

本論文では、回折限界を超えたイメージングのための赤外近接場顕微鏡の組み立てと操作のリーダーに指示することを目指しています。 apertureless近接場顕微鏡は、およそ20nmの分解能で赤外スペクトルを提供する光散乱型測定器です。コンポーネントと使用のためのステップバイステップのプロトコルの完全なリストが提供されます。アセンブリと楽器のチューニングの一般的なエラーについて説明します。アミロイド線維の二次構造を示す代表的なデータセットが表示されます。

イメージングタンパク質凝集体のためのニアフィールド赤外顕微鏡の組み立てが記載されている。

アセンブリは、チューニングとタンパク質イメージングのためApertureless近距離赤外線顕微鏡の使用

本論文の目的は、回折限界を超えたイメージングを実現するための赤外近接場顕微鏡の組み立ておよび操作方法を読者に指導することである。

マルチモードAFMおよび光学顕微鏡を設置することで、光学系の初期組み立てが完了します。不可視の赤外線ビームの光軸調整は、まず可視の赤色ヘリウムネオンレーザーを用いて調整することで容易になります。赤外線（点線）と重ね合わせるための実線を用い、レーザー光がカンチレバーチップの頂点および赤外線検出器に当たっていることを確認することを目的とします。赤外線ビームの最終的なアライメントは、目的の近接場信号が得られた際に、正しい形状の1F信号が得られるように、光学顕微鏡の位置とミラーを調整することで行います。同時に、nano scopeソフトウェアを用いてFMトポグラフィーと近接場画像を収集します。こんにちは、トロント大学化学科のギルバート・ウォーカー教授です。こんにちは、Gilbert Walkerの研究室のMelissa Pauliteです。本日は、aperture list近接場赤外走査顕微鏡の初期組み立てと光軸調整の手順について説明します。私たちの研究室では、この手順を用いてタンパク質凝集体の研究を行っています。それでは始めましょう。イメージングシステムの組み立てと調整について説明する前に、まずシステム全体の概要を簡単に確認します。このビデオで説明するイメージングシステムの構成部品には、光学定盤、マルチモード原子間力顕微鏡（AFM）のベース、マルチモードAFMのスキャナー、嵩上げされた光学ブレッドボード、ガイドミラー、そしてアイリスとセンターを備えた光学チューブが含まれます。亜鉛セレン部分反射鏡で光学キューブを遮蔽し、昇降プラットフォーム上にセットアップを固定するための光学チューブを使用します。赤外線対物レンズは、後方散乱光を収集するための光学チューブです。オフアキシス放物面鏡を備えたキューブは、ゲルマニウムプレートを45度に保持するためのキューブです。顕微鏡の接眼レンズ、XYステージに装着されたピンホール、および水銀カドミウムテルル（MCT）赤外線検出器を用意します。赤外線検出器用プリアンプ、ビーム位置を移動させるためのXYステージ、ビームをフォーカスするための昇降ステージ、赤外線検出器を配置するためのZステージ、および赤外線検出器を配置するためのXステージを準備します。光学系の組み立てを開始するには、チューニングミラーを使用して、ヘリウムネオンビームを光学定盤と平行に配置してください。次に、キューブ内にビームスプリッターを入れず、キューブのもう一方の端に延長光学チューブを配置した状態で、ヘリウムネオンビームをチューブの両端に取り付けられたアイリスに通します。ここでスキャナーを取り外し、赤外線対物レンズの代わりに延長光学チューブを取り付けます。その後、セレン化亜鉛部分反射鏡を挿入し、ビームを試料に向かわせます。ヘリウムネオンビームが光学キューブの幾何学的中心にあるリフレクターの前面に当たるように取り付ける必要があります。部分反射鏡を回転させ、ビームを閉じた出力側に向かわせます。部分反射鏡のマウントでは完全に垂直に固定できないため、2つの自家製調整ネジを使用してビームの垂直方向の動きを調整します。次に、ネジを締めてパラロイドミラーを固定するために、ラバーOリングを使用します。Oリングを圧縮させることで、ミラーの調整が可能になります。さらに追加のミラーを用いてHe-Neビームを反対方向に向け、以前に使用したアイリスを通過するように調整します。このビームはパラボラミラーの調整に使用します。光学キューブ内に配置されたパラボラミラーは、ピンホールの後に配置される検出器に向かって光を反射させます。調整ネジを使用して、キューブの出口にあるピンホールを通過するようにビームを向けます。ビームをピンホールで調整した後、MCT検出器をピンホールの近くに配置します。ヘリウムネオンビームが検出器の検知素子上に当たるように、赤外線検出器の位置を調整してください。その後、検出器を約2 mm下げます。次に、ピンホールの前に配置されている光学キューブに、ゲルマニウムウィンドウ付きのマウントを挿入します。再反射防止コーティングが施されたゲルマニウムウィンドウは赤外線フィルターとして機能し、カンチレバーと試料の視覚的な観察を可能にします。続いて、接眼レンズを取り付けます。キューブの角度を回すことで、ゲルマニウムウィンドウのマウントが回転し、接眼レンズを目的の方向に向けることができます。ヘリウムネオンビームを接眼レンズの中央に通します。赤外線対物レンズとFMスキャナーを接続し、ビームストップを取り付けます。スキャナー上にサンプルを配置し、ヘリウムネオンビームを入力光学チューブに通します。ビームが十分な幅を持ち、ビーム外まで広がっていることを確認してください。接眼対物レンズのネジを調整して停止させます。サンプルに集光させたビームの鮮明な像を得ます。次に、FMヘッドを取り付け、プローブをサンプルに接触させます。ヘリウムネオンビームをイメージングカンチレバーの先端に集光させます。もしそうしたことでビームが入力光学チューブの中央からずれた場合は、ビームが中心に位置するまでチューニングの手順を繰り返します。パラボラミラーの最終調整を開始するには、出力ピンホールをパラボラミラーの焦点位置にあるアイリスに交換し、ゲルマニウムウィンドウと赤外線検出器を取り除きます。赤外線検出器の位置をマークしておくことを忘れないでください。アイリスの後方、レンズのおおよその焦点距離の位置に追加レンズを取り付けます。これで、レンズを通して接触しているカンチレバーが確認できるはずです。閉じたアイリスを通して、放物面鏡の位置を調整し、チップの先端中心に合わせます。ヘリウムネオンビームがチップに正しく集光されると、チップとそのサンプル表面への反射像の間に明るい輝点が見えることに注意してください。ゲルマニウム窓を再度取り付け、カンチレバーを視覚的に観察しやすいように調整します。アイリスをピンホールに交換します。赤外線検出に使用するピンホールは、ゲルマニウムウィンドウによる赤外線ビームの変位があるため、中心からずらして配置する必要があることに注意してください。赤外線検出器をあらかじめ印をつけた位置に配置し、赤外線ビームがチューニングに使用した可視光ビームと同経路で進むように調整します。それでは、日常的な調整手順について説明します。セットアップの調整は、不可視の赤外線ビームよりも、可視のヘリウムネオンビームを用いる方が容易です。ヘリウムネオンビームと赤外線ビームの光路は、傾斜ミラーで合流します。このミラーを下に傾けると、ヘリウムネオンレーザーが通過します。ミラーが元の位置にある場合、赤外線は近視野へと向かいます。これは、ビームの一方をアライメントするためのセットアップです。他のパスとは共通していない2枚のミラーを使用します。ホモダインアーム内のビームを確認すると、コロナのようなビームプロファイルが見えるはずです。これで、ニアフィールドステージとの精密な位置合わせのために、FMがフォースフィードバックと共に機能します。反射顕微鏡対物レンズを移動させ、光が散乱している先端に焦点を合わせます。ゲルマニウムウィンドウを光学キューブに挿入します。パラボラミラーの後、ビームはこの点にパラボラミラーによって集光されます。ゲルマニウムウィンドウを用いて、チップとその試料表面への反射の鮮明な像が見えるまで、ステージを前後に移動させます。次に、ヘリウムネオンビームなしでカンチレバーとチップを確認できるよう、望遠鏡の中を覗きます。まだ赤い光が見えますが、これはAFM距離制御による内部光です。チップの先端に明るい赤色の輝点が見えるまで、ステージを右、左、上下方向に移動させます。ホモダイン場を散乱光に重ね合わせるために、まずホモダインアームを開きます。その後、接眼レンズを通して観察します。強度が次第に弱くなる3つ以上のスポットが一直線上に現れます。ホモダインアーム内のミラーを動かし、2番目のスポットを、チップとその反射像が重なり合う位置にあるチップの像と重ね合わせてください。検出器を配置するために、追加のミラーを取り除きます。ヘリウムネオンビームが、チューブ背後の検出器の方向に向かいます。少なくとも2つのリング状のスポットが確認できるはずです。右から2番目のスポットが、検出器前にある熱遮蔽箔の穴を通り、センシングエレメントに当たるように調整してください。定常的な調整が完了すると、最も強度の高いスポットがホールの中心に確認できるはずです。次に、赤外線ビームのアライメントを確認しましょう。赤外線ビームをアライメントするには、100 milliwatts以上の強度を持つ一酸化炭素レーザーラインを使用してください。これにより、アライメントが容易になります。まず、検出器に液体窒素を充填します。キネマティック・フリップマウントに取り付けられたミラーを跳ね上げ、赤外線ビームを顕微鏡に向くように調整します。最初のアイリスの後ろにパワーメーターを配置し、キネマティック・フリップマウントに取り付けられたミラーの前にあるミラーを調整します。最大電力を得るには、ニアフィールドステージに最も近いアイリスの後ろにパワーメーターを保持し、最大電力が得られるまで傾斜ミラーを動かしてください。このアライメント工程では、1F信号を確認しながら、これらの手順を数回繰り返します。1F信号を確認するには、アンプのロックのリファレンスを1f（FM発振周波数）に切り替え、フォースプロットモードで3 µmのZsスキャンサイズに設定します。アライメントが不適切である場合、3 µmスケール上に幅広のバンプが現れます。これを修正するには、アライメントが改善されるまで、前のステップを繰り返し実行する必要があります。アライメントが不十分な場合は、最初のピークの曲率がわずかに凹状に見えますが、2番目のピークは1番目よりも大きくなります。この状態では、1枚または両方のアライメントミラーを調整して、アライメントの修正を試みてください。アライメントが適切であれば、2つのピークのみが観察され、1番目のピークが2番目よりも高くなります。最初のピークの右側の曲率は負になります。アライメントが適切に完了したら、ミラーを移動させて最初のピークの最大値を高めることができます。1F信号は5 Vから12 Vの間にあるはずですが、それよりも最初のピークの形状の方が重要です。最後に、2fに切り替え、信号をさらに改善させます。ミラーをわずかに回転させて位相を調整することで、2f信号が0.6Vから2Vの間に収まるようにします。実験的トポグラフィーおよび近接場。21〜31本のペプチド線維の画像を示す。上のスケールはナノメートル単位の高さを示し、下のスケールはロックイン電圧による近接場コントラストを示す。ここに示されているのは、1,631 cm⁻¹の放射光を用いて得られた近接場画像と同時に収集されたトポグラフィー画像である。1,691 cm⁻¹を用いて得られた近接場画像と同時に収集されたトポグラフィー画像。放射線が表示されています。ラベルは特定のFIを表しており、各FIがどのような二次確認を行っているかを強調するために使用されます。ここでは、ラインの組み立て方法と、アパーチャリスト近接場走査型赤外分光顕微鏡の使用方法について説明しました。アライメントが正しく行われなかった場合に手順を遡れるよう、アライメント中に実施した操作を記録しておいてください。そして何よりも、忍耐強く取り組んでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りします。

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原子間力顕微鏡-赤外線分光法(AFM-IR)は、細菌研究のための強力なプラットフォームを提供し、ナノスケールの分解能を達成することを可能にします。いずれも、細胞内変化(例えば、細胞分裂時)のマッピング、ならびに化学組成の比較研究(例えば、薬剤耐性から生じる)のマッピングは、細菌中の単一細胞レベルで行うことができる。...

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