組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ

このビデオでは、天然の細胞外マトリックスの構造とスケールを模倣した繊維足場を作成するために、組織工学や細胞培養で広く用いられている手法であるポリマーの電界紡糸（エレクトロスピニング）について解説します。本動画では、光照射によって架橋可能な光反応性ヒアルロン酸を電界紡糸し、さらに、細胞浸潤と組織分布を向上させるためのチャネル、足場、およびマルチスケール多孔性を形成するフォトパターニングなどの後処理アプリケーションを紹介します。加えて、2種類の異なるポリマーを同一のマット内に電界紡糸できるマルチポリマー足場形成法を用い、足場の力学的特性や分解性の調整、および細胞浸潤に向けた多孔性の最適化を行います。

こんにちは。私はペンシルベニア大学バイオエンジニアリング学科のJason Burdick研究室のJamie Koviです。こんにちは、同じくBurdick研究室のHarini Swinです。本日は、組織工学に向けた電界紡糸法による繊維スキャフォールドの作製手順をご紹介します。

さらに、フォトパターニングおよびマルチポリマー・スキャフォールド形成による追加の加工能力についても紹介します。当研究室では、これらの手順を用いて、ヒアルロン酸スキャフォールドにおけるHMSE細胞の相互作用と浸潤を研究しています。また、これらの技術を他の様々なポリマーに適用し、半月板や心筋などの繊維強化組織の研究にも利用しています。

それでは始めましょう。光開始剤の0.5%重量溶液を調製します。Irgacure 2959またはI2959を脱イオン水に溶解させ、37 °Cで数日間溶解させてキュアします。

電界紡糸に光反応性ポリマーが必要な場合は、I cureを使用します。電界紡糸溶液を調製するため、脱イオン水を用いて、最終濃度が2重量%のメチル化ヒアルロン酸（MEHA）、3重量%のポリエチレンオキシド（PEO）、および0.05重量%のI 2 9 5 9溶液となるように混合し、5分間ボルテックスした後、37°Cで一晩インキュベートします。溶液を溶解させるために、溶液をシリンジに移し、末端に18ゲージで長さ6インチの鈍端針を取り付けます。

次に、シリンジポンプを使用し、吐出速度を1.2 milliliters per hourに設定します。シリンジエンジンの針をシリンジポンプに挿入します。高電圧電源のアースリードを回収装置に取り付けます。

本手順では、秒速約10メートルで回転するマンドレルを使用します。配向したファイバーを回収するために、正極リードをニードルに取り付け、ニードルまたは回収装置を調整して、両者の距離を15センチメートルに設定します。シリンジポンプのフローを開始し、ニードルの先端に液体が見えたら、電源をオンにし、電圧を22キロボルトに設定してください。

目的の厚さに達するまで、スキャフォールド上にファイバーを収集します。収集時間は、目的の厚さと使用するエレクトロスピン溶液の量によって異なります。フォトパターニングには、16時間エレクトロスピンしたマットを使用します。

回収完了後、回収装置からスキャフォールドを取り出し、溶媒を完全に除去するために真空状態で一晩保存します。ハサミを用いて、スキャフォールドマットから5 mm × 5 mmのサンプルを5つ切り出します。架橋処理の準備として、各スキャフォールドをアルミホイルを敷いたガラススライドの上に配置し、スキャフォールドにフォトマスクを直接重ねて、さらにきれいなガラススライドで覆い、スライドの両端をバインダークリップで固定します。

窒素チャンバーを使用して、酸素への曝露による架橋の減少を抑制するためにスキャフォールドをパージします。スキャフォールドのセットアップを窒素チャンバー内に配置し、コリメーティングアダプターを用いて、約10 milliwatts per centimeter squareの365 nanometer光を5分間照射します。各スキャフォールドを取り出し、12ウェル組織培養プレートに配置します。

それぞれに脱イオン水を2 mL加えます。水の蒸発による異常を防ぐためプレートを適切に密閉し、37 °Cで24時間静置します。8時間ごとに、真空ピペットを用いてウェルから脱イオン水を吸引し、水を交換してください。

ホットプレートを用いて、90%エタノールでPEOの5%重量溶液を調製します。手順を開始する前に、50 °Cにて700 RPMで少なくとも2時間攪拌します。攪拌後、最終濃度が10 µg/mLとなるようにDPIを添加します。

PEOおよびDPI溶液を3 mLシリンジに移し、遮光のためアルミホイルで包みます。次に、第2セクションで説明したエレクトロスピン溶液を調製し、最終濃度が25 µMとなるようにmethoxy ethyl biocarbon mole rod domine Bをマイクロピペットで3 mLシリンジに加えます。その後、遮光のためアルミホイルで包みます。

22 mm × 22 mmのメチル化ガラスカバーガラスの端を、マンドレル周囲にフィットするように、セロハンテープで慎重にマンドレル表面に固定します。長さ5 mmのシリコンチューブを用い、片端をルアーロック付きシリンジのいずれかに接続します。もう一方の端に針を取り付け、シリンジをシリンジポンプにセットし、ファンにある穴に針を通します。

ファナーはマンドレルの長手方向に移動し、得られるスキャフォールド内で両方のポリマーが均等に分布するようにするために使用されます。MEHAを含むシリンジの針先がマンドレルの中心に位置していることを確認してください。針先をマンドレルから15 centimetersの位置に配置し、ファナーを針先から6 centimetersの距離に設定します。

シリンジポンプを毎時 1.2 milliliters で送液するようにプログラムし、電源を 22 kilovolts に設定します。PEO のシリンジも全く同様にセットアップしますが、針先をマンドレルから 10 centimeters の位置に配置し、電源を 15 kilovolts に設定します。その後、照明を消し、マンドレルとシリンジポンプを起動します。

両方の針先に液体が見えたら、シリンジからアルミホイルを取り除きます。回収が完了したら、電源を入れ、同時にファナーを接続します。電源とマンドレルを切断し、慎重にファナーのプラグを抜いてください。

カミソリを使用して、カバーガラスとテープを取り除きます。繊維は、ルミンおよびdpi用のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で観察できます。エレクトロスピンポリマーが付着した各カバーガラスを、6ウェルプレートの個々のウェルに入れます。

ウェルプレートを用いて、溶媒および不純物を完全に除去するため、スキャフォールドを 2 mL の PBS で一晩インキュベートします。24 時間後、真空吸引でウェルプレートから PBS を除去し、ラミナーフローフード内の殺菌用 UV ランプ下で 30 分間照射します。滅菌後、標準的な細胞培養を行い、目的の細胞密度で濃縮細胞懸濁液を調製します。

例えば、22 by 22 millimeterのカバースリップに対して100 millilitersの細胞懸濁液を使用します。インキュベーター内で1時間静置します。それぞれに適切な量の細胞培養培地を加えます。

スキャフォールドをインキュベーターに戻します。Invitrogen社製の市販のLive/Deadキットを用いて細胞を染色し、トリシンおよびフィコシアニン用フィルターを備えた蛍光顕微鏡で細胞と繊維を可視化します。接地したフラットプレート上で回収したスキャフォールドでは、予想通りに繊維がランダムに分布します。一方、回転マンドレル上で回収したスキャフォールドでは、繊維が配向して生成されます。

スキャニング電子顕微鏡で観察した際に整列した繊維を生成するため、スキャホールドを脱イオン水および非反応性haに浸漬させた後、スキャホールドと光源の間にフォトマスクを配置して光架橋を行います。光が遮られた領域のPEOは除去され、蛍光染料から明らかなようにマクロポアが形成されます。MEHAとPEOのジェットを同時に電界紡糸することで、個々のポリマーからなる明確な繊維集団を含む複合スキャホールドが得られます。

HMCは繊維と良好に相互作用していると考えられます。緑色の染色から明らかなように、生存しているだけでなく、赤色の繊維に沿って配向するように誘導されているようです。以上で、組織工学のための繊維足場をエレクトロスピンする方法について説明しました。

また、フォトパターニングやマルチポリマー電界紡糸などの追加機能も導入しました。この手順を行う際は、さらなる実験を試みる前に、均一な繊維を形成できるよう、各ポリマーの電界紡糸パラメータを最適化することが重要です。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。