Name: 組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぼう、組織工学と細胞培養のための電気紡糸法による繊維状足場の作製。光反応性ヒアルロン酸を用いた架橋とフォトパターニング、多層ポリマー足場形成の応用技術を含む。

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この作品は、JLIとヒース助成R01AR056624の国立研究所にアメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップによってサポートされていました。

A.単一のポリマーエレクトロスピニング<ol><li>エレクトロスピニング溶液を調製する前に、数日間37℃で溶解して脱イオン水でイルガキュア2959（I2959）、、光開始剤の0.5重量％溶液を作る。光反応性ポリマーが使用されていない場合、この手順は必要ありません。 </li><li> 2重量％MeHA、3重量％の最終濃度で溶液を調製メタクリル化ヒアルロン酸（MeHA、バーディックらを参照してください。合成のため）、ポリ（エチレンオキシド）（PEO、900 kDaの）、および脱イオン水でI2959を組み合わせるPEO、および0.05重量％I2959。それが透明になるまで溶液を混合するために渦を使用してください。ポリマーの種類および濃度、ならびに使用される溶媒は、所望の足場の特性に応じてこのステップで変更することができます。 </li><li>シリンジに液を移し、最後に18ゲージ、長さは6インチ、平滑末端の針を取り付けます。 </li><li> 1.2 mLの/ hrの速度で排出するプログラムシリンジポンプ。デバイスへの注射器と針を挿入します。 </li><li>収集装置に高電圧電源の接地リード線を取り付けます。ランダムに分散した繊維は平らな金属板を使用して収集し、または整列繊維を収集するために〜10 m / sで回転するマンドレルを使用する。針に正に帯電したリードを取り付けます。エレクトロスピニング装置の概略図1を参照してください。 </li><li> 、両者の間を15cmの距離があるような針や収集装置を調整します。 </li><li>シリンジポンプの流量を開始します。流体が針の先端に視覚化されるときは、電源をオンにし、22 kVに電圧を設定します。 </li><li>コレクションは、（薄膜の数分から、最大厚いマットのための24時間まで）の完了後、収集装置から足場を削除し、溶剤の完全除去を確実にするために一晩真空下で保管してください。 </li><li>走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて繊維の形態を視覚化する、代表的な足場が整列し、非整列の両方の構造については図1に示されています。 </li></ol>注：サンプル流量、収集装置までの距離、および電圧は、ポリマーと溶媒の組み合わせに依存しており、通常はSEMで足場の形態を観察することによって、各システム用に最適化されている必要があります。 B.の光架橋と光パターニング<ol><li>足場のマットから5mm × 5mmの試料を切り出した。 </li><li>きれいなスライドガラスで覆うとバインダークリップで両端をクリッピング、足場上で直接フォトマスクを配置し、スライドガラスをカバーフォイルで各足場を置くことによって、架橋のために準備する。注：4つのサンプルは一度に行うことができる、とパターンが必要ない場合は、パターンのない透明性、架橋のために使用することができます。 </li><li>パージ足場は、窒素のチャンバー内に設定します。架橋を阻害することができる酸素、より構造がフリー状態にしておくことが重要です。 </li><li> 5分間コリメートアダプター付き〜10 MW / cm 2の 365nmの光の下で窒素チャンバ内の場所に足場のセットアップ。 図2の回路図を参照してください。 </li><li>各足場を取り外し、12ウェルプレートの場所。 </li><li> 37水と場所の蒸発を防ぐために、各ウェルに精製水2 mLをパラフィルムプレート追加℃で24時間。水を3回変更してください。 </li><li>光学顕微鏡下で孔形成を可視化する（ 図2の例を参照）。足場は、使用する準備は完了です。 </li></ol>注：光架橋は、ポリマーの多くの種類のために必要ではない、しかし、光パターニングは、光反応性ポリマーを使用することができます。 蛍光ファイバーの可視化とC.デュアルポリマーエレクトロスピニング<ol><li> 90％エタノールでPEO（200 kDa）の5重量％の溶液を調製します。 50℃より前のエレクトロスピニングに少なくとも2時間、700 rpmで攪拌​​。 </li><li>シリンジにPEOのソリューションを移し、エレクトロスピニング溶液中に10 mg / mLの濃度の最終濃度のためにDAPIを追加。光から保護するために、アルミホイルでシリンジを包みます。 </li><li>また、エレクトロスピニング溶液中で25μMの最終濃度methacryloxyethylチオカルバモイルローダミンB（MeRho、683.24グラム/モル）を追加する場合を除き、ステップA2で説明した同じ溶液を調製します。光から保護するために、アルミホイルでシリンジを包みます。 </li><li>注意深くマンドレルの表面にメタクリルガラス製カバースリップを（Khademhosseini らを参照してください。）確保するためにスコッチテープを使用してください。注：繊維は、メタクリルガラス製カバースリップに縛らになります。 </li><li>シリンジのいずれかにルアーロックの添付ファイル付きのシリコンチューブの5 mm長部分の一端を添付して、針にもう一方の端を取り付けます。シリンジポンプにシリンジを挿入し、送風機の穴から針を刺します。マンドレルの反対側のサイト上で他の注射器とあおぐ人で繰り返します。 fannersはlを翻訳マンドレルのengthと結果足場の両方のポリマーの平等な分配を確保するために使用されています。 図3の回路図を参照してください。 </li><li>適切に表1にしたがってセクションで説明されているパラメータを調整します。針の先端がマンドレルを中心にされていることを確認します。 表1。デュアルポリマーエレクトロパラメータ <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 注射器 </td><td> ニードルチップ（cm）にあおぐ人 </td><td> マンドレル（cm）に針の先端 </td><td> 流量（mLの/時） </td><td> 印加電圧（kV）の </td></tr><tr><td> MeHA </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li>すべてが適切に配置されると、ライトをオフにしてマンドレルとシリンジポンプをオンにします。シリンジからアルミホイルを取り外します。流体は、両方の針の先端上に表示されているときに、同時にfannersでの電源とプラグをオンにします。 </li><li>収集が完了すると、電源装置とマンドレルをオフにしてfannersを抜いてください。慎重にカミソリの刃を使用してカバースリップとテープを取り外します。 </li><li>ローダミンおよびDAPI用フィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて繊維を可視化する。 図3の例を参照してください。注：蛍光繊維は、短期間（&lt;3分）のためのエレクトロスピニングは、しかしながら、このプロセスは、特にガラス製カバースリップを使用せずに、厚い構造を作成するために時間を無制限に拡張することができるときに表示するには、最も明確である。 </li></ol>足場上でD.シーディングセル<ol><li>適切なサイズのウェルプレートの個々のウェルに接続されているエレクトロポリマーを使用して各カバースリップを配置。注：繊維と細胞間相互作用は、メタクリルガラス製カバースリップの上にエレクトロスピニングによって簡単に表示されている。また、MeRhoは再び繊維の可視化に使用することができます。 </li><li>溶剤の完全除去と副産物すべての可能な浸出性を確保するために一晩PBSで足場をインキュベートする。 </li><li>井戸からPBSを削除します。 </li><li>足場を殺菌するために、30分間層流フードで殺菌灯の下に配置します。完全な足場はシードされている場合、別の30分間殺菌灯の下で上の足場と場所を反転させる。 </li><li>標準細胞培養を行い、（例えば、6,000細胞cm -2）の所望の細胞密度で濃縮された細胞懸濁液を準備する。例えば、22㎜× 22 mmのカバースリップのために細胞懸濁液100 mLを使用してください。 1時間培養器に置きます。 </li><li>各ウェルに細胞培養培地の適切な量を追加。インキュベーターに戻して足場を置きます。 </li><li>市販のライブ/デッドキットを用いて細胞を染色。注：このようなDAPI​​（細胞核）と蛍光標識ファロイジン（アクチンストレスファイバー）などの細胞の染色の他のタイプは、細胞を可視化に適用することができます。 </li><li> TRITCおよびFITC用のフィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて細胞と繊維を可視化する。 図4の例を参照してください。 </li></ol>代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="図1" /> 図1非整列足場の形成（上）とアライン足場の形成（下）のデバイスのセットアップを示す回路図。足場の各タイプの例走査型電子顕微鏡の画像が表示されます。スケールバー=5μmの。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="図2" /> 図2。パターニング方法の概略図。パターンは、光架橋時の光源と足場の間にフォトマスクを配置し、離れて未反応のポリマーを洗浄することによって形成される。孔形成および凍結乾燥後の足場のフォトマスクとSEM像。スケールバー= 100μmの。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="図3" border="0" /> 図3マルチポリマーエレクトロの設定と必要な処理パラメータの回路図、ならびに2つのファイバの集団（例：赤MeHAと青PEO）の混合物の代表的な蛍光画像のマルチポリマー足場を形成するために同時にエレクトロスピニングされた。スケールバー= 100μmの。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">ここをクリックして</a>大きい版？を参照する図3のn。 <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="図4" /> 図4ヒト間葉系幹細胞とエレクトロの繊維との相互作用の例デッド/ライブ染色像。スケールバー= 100μmの。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">ここをクリックして</a>図4の拡大バージョンを参照すること。

<ol><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li>
<li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+on+the+Straight+and+Narrow%3A+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+B%22%5BJournal%5D)">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., Von Recum, H. avon <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

エレクトロスピニングは、高分子から繊維質足場を準備するために使用されていました。ヒアルロン酸に基づいて光架橋の足場は、露光が架橋のために必要とされる説明の例として使用した。このようなMeHAような反応性マクロマー、を使用すると、以前に強化された細胞分布を実証しているチャンネルは、マクロとミクロ多孔足場を形成する光架橋時のマスクを用いて足場に編入された。また、二つの異なるポリマーが、同時に私たちのカスタム装置を用いてエレクトロスピニングされた。二つの異なる繊維の集団の存在は、後に蛍光顕微鏡を用いて表示された各エレクトロソリューションへの蛍光色素を加えて検証した。マルチポリマー足場は細胞分布だけでなく、単一の高分子エレクトロの足場からの相対特定のアプリケーションのためのより良い調整力学と足場の劣化を促進するために使用することができます。さらに、足場の滅菌と細胞播種が実証されています。これらの手法の多くは汎用性がありますし、組織工学および細胞の培養のためのアプリケーションのための多様な足場を製造するために、異なるポリマーの範囲に使用できます。

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>I2959</td><td>試薬</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEO 200 kDa</td><td></td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17503</td><td></td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>試薬</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>DMSOでストック溶液を調製する</td></tr><tr><td>Live/Dead Stain Kit</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Calcein（生存細胞を緑色に染色）およびエチジウムホモダイマー（死細胞を赤色に染色）を含む</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>機器</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td>デュアルポリマー紡糸には2台必要</td></tr><tr><td>電源</td><td>機器</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td>デュアルポリマー紡糸には2台必要</td></tr><tr><td>モーター</td><td>機器</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>カスタム製作のマンドレルに取り付ける必要がある</td></tr><tr><td>タコメーター</td><td>機器</td><td>Network Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>マンドレルの回転速度の監視に使用する</td></tr><tr><td>コリメートアダプター付きOmnicure UVスポットキュアシステム</td><td>機器</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンチューブ</td><td>機器</td><td>McMaster-Carr</td><td>51135K151</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックメスアダプター</td><td>機器</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックオスアダプター</td><td>機器</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>機器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>機器</td><td>Corning</td><td>2875-22</td><td></td></tr></tbody></table>

組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

組織工学の分野が発展するにつれて、より複雑な臓器や組織の要件（例えば、力学と血管）に対処するために、より適切な素材と加工技術を生成するために非常に大きな需要があります。エレクトロスピニングは、ネイティブの細胞外マトリックスのアーキテクチャと大きさのスケールを模倣繊維状足場を作成するための一般的な手法です。繊維が細胞挙動を指示するために使用することができるので、これらの繊維状の足場は、幹細胞の分化（Mauckによる大規模なレビューをすべて見る含め、また、細胞培養の基質として有用である<em&gt;ら。</em&gt;とシル<em&gt;ら。</em&gt;詳細については）。この記事では、ポリマーのエレクトロスピニングの一般的なプロセスを説明し、例として、electrospin光照射による架橋が可能な反応性ヒアルロン酸（参照Ifkovits<em&gt;ら。</em&gt;光架橋材料の見直しのため）。我々はまた、光パターニング及びマルチポリマー足場の形成など、さらなる処理能力をご紹介。光パターニングは、細胞浸潤と組織分布を向上させるチャンネルとマルチスケール空隙率と骨格を作成するために使用することができます。マルチポリマー足場は良い細胞​​浸潤のために気孔を合わせた含む足場の性質（力学と劣化）を、調整するのに便利です。さらに、これらの技術は成功した組織工学的構造の開発に必要な手がかりを提供する複雑な足場を作成するためのポリマーと反応性マクロマーの広い配列を含むように拡張することができます。

組織工学と細胞培養のためのポリマーをエレクトロスピニングのプロセスは、この記事で取り上げられています。特に、光パターニング及びマルチポリマーエレクトロスピニングの追加の処理能力を持つ光反応性マクロマーのエレクトロスピニングが記載されている。

組織工学の分野が発展するにつれて、……に対処するため、より適切な材料や加工技術を開発することへの需要が非常に高まっています。

このビデオでは、天然の細胞外マトリックスの構造とスケールを模倣した繊維足場を作成するために、組織工学や細胞培養で広く用いられている手法であるポリマーの電界紡糸（エレクトロスピニング）について解説します。本動画では、光照射によって架橋可能な光反応性ヒアルロン酸を電界紡糸し、さらに、細胞浸潤と組織分布を向上させるためのチャネル、足場、およびマルチスケール多孔性を形成するフォトパターニングなどの後処理アプリケーションを紹介します。加えて、2種類の異なるポリマーを同一のマット内に電界紡糸できるマルチポリマー足場形成法を用い、足場の力学的特性や分解性の調整、および細胞浸潤に向けた多孔性の最適化を行います。こんにちは。私はペンシルベニア大学バイオエンジニアリング学科のJason Burdick研究室のJamie Koviです。こんにちは、同じくBurdick研究室のHarini Swinです。本日は、組織工学に向けた電界紡糸法による繊維スキャフォールドの作製手順をご紹介します。さらに、フォトパターニングおよびマルチポリマー・スキャフォールド形成による追加の加工能力についても紹介します。当研究室では、これらの手順を用いて、ヒアルロン酸スキャフォールドにおけるHMSE細胞の相互作用と浸潤を研究しています。また、これらの技術を他の様々なポリマーに適用し、半月板や心筋などの繊維強化組織の研究にも利用しています。それでは始めましょう。光開始剤の0.5%重量溶液を調製します。Irgacure 2959またはI2959を脱イオン水に溶解させ、37 °Cで数日間溶解させてキュアします。電界紡糸に光反応性ポリマーが必要な場合は、I cureを使用します。電界紡糸溶液を調製するため、脱イオン水を用いて、最終濃度が2重量%のメチル化ヒアルロン酸（MEHA）、3重量%のポリエチレンオキシド（PEO）、および0.05重量%のI 2 9 5 9溶液となるように混合し、5分間ボルテックスした後、37°Cで一晩インキュベートします。溶液を溶解させるために、溶液をシリンジに移し、末端に18ゲージで長さ6インチの鈍端針を取り付けます。次に、シリンジポンプを使用し、吐出速度を1.2 milliliters per hourに設定します。シリンジエンジンの針をシリンジポンプに挿入します。高電圧電源のアースリードを回収装置に取り付けます。本手順では、秒速約10メートルで回転するマンドレルを使用します。配向したファイバーを回収するために、正極リードをニードルに取り付け、ニードルまたは回収装置を調整して、両者の距離を15センチメートルに設定します。シリンジポンプのフローを開始し、ニードルの先端に液体が見えたら、電源をオンにし、電圧を22キロボルトに設定してください。目的の厚さに達するまで、スキャフォールド上にファイバーを収集します。収集時間は、目的の厚さと使用するエレクトロスピン溶液の量によって異なります。フォトパターニングには、16時間エレクトロスピンしたマットを使用します。回収完了後、回収装置からスキャフォールドを取り出し、溶媒を完全に除去するために真空状態で一晩保存します。ハサミを用いて、スキャフォールドマットから5 mm × 5 mmのサンプルを5つ切り出します。架橋処理の準備として、各スキャフォールドをアルミホイルを敷いたガラススライドの上に配置し、スキャフォールドにフォトマスクを直接重ねて、さらにきれいなガラススライドで覆い、スライドの両端をバインダークリップで固定します。窒素チャンバーを使用して、酸素への曝露による架橋の減少を抑制するためにスキャフォールドをパージします。スキャフォールドのセットアップを窒素チャンバー内に配置し、コリメーティングアダプターを用いて、約10 milliwatts per centimeter squareの365 nanometer光を5分間照射します。各スキャフォールドを取り出し、12ウェル組織培養プレートに配置します。それぞれに脱イオン水を2 mL加えます。水の蒸発による異常を防ぐためプレートを適切に密閉し、37 °Cで24時間静置します。8時間ごとに、真空ピペットを用いてウェルから脱イオン水を吸引し、水を交換してください。ホットプレートを用いて、90%エタノールでPEOの5%重量溶液を調製します。手順を開始する前に、50 °Cにて700 RPMで少なくとも2時間攪拌します。攪拌後、最終濃度が10 µg/mLとなるようにDPIを添加します。PEOおよびDPI溶液を3 mLシリンジに移し、遮光のためアルミホイルで包みます。次に、第2セクションで説明したエレクトロスピン溶液を調製し、最終濃度が25 µMとなるようにmethoxy ethyl biocarbon mole rod domine Bをマイクロピペットで3 mLシリンジに加えます。その後、遮光のためアルミホイルで包みます。22 mm × 22 mmのメチル化ガラスカバーガラスの端を、マンドレル周囲にフィットするように、セロハンテープで慎重にマンドレル表面に固定します。長さ5 mmのシリコンチューブを用い、片端をルアーロック付きシリンジのいずれかに接続します。もう一方の端に針を取り付け、シリンジをシリンジポンプにセットし、ファンにある穴に針を通します。ファナーはマンドレルの長手方向に移動し、得られるスキャフォールド内で両方のポリマーが均等に分布するようにするために使用されます。MEHAを含むシリンジの針先がマンドレルの中心に位置していることを確認してください。針先をマンドレルから15 centimetersの位置に配置し、ファナーを針先から6 centimetersの距離に設定します。シリンジポンプを毎時 1.2 milliliters で送液するようにプログラムし、電源を 22 kilovolts に設定します。PEO のシリンジも全く同様にセットアップしますが、針先をマンドレルから 10 centimeters の位置に配置し、電源を 15 kilovolts に設定します。その後、照明を消し、マンドレルとシリンジポンプを起動します。両方の針先に液体が見えたら、シリンジからアルミホイルを取り除きます。回収が完了したら、電源を入れ、同時にファナーを接続します。電源とマンドレルを切断し、慎重にファナーのプラグを抜いてください。カミソリを使用して、カバーガラスとテープを取り除きます。繊維は、ルミンおよびdpi用のフィルターを備えた蛍光顕微鏡で観察できます。エレクトロスピンポリマーが付着した各カバーガラスを、6ウェルプレートの個々のウェルに入れます。ウェルプレートを用いて、溶媒および不純物を完全に除去するため、スキャフォールドを 2 mL の PBS で一晩インキュベートします。24 時間後、真空吸引でウェルプレートから PBS を除去し、ラミナーフローフード内の殺菌用 UV ランプ下で 30 分間照射します。滅菌後、標準的な細胞培養を行い、目的の細胞密度で濃縮細胞懸濁液を調製します。例えば、22 by 22 millimeterのカバースリップに対して100 millilitersの細胞懸濁液を使用します。インキュベーター内で1時間静置します。それぞれに適切な量の細胞培養培地を加えます。スキャフォールドをインキュベーターに戻します。Invitrogen社製の市販のLive/Deadキットを用いて細胞を染色し、トリシンおよびフィコシアニン用フィルターを備えた蛍光顕微鏡で細胞と繊維を可視化します。接地したフラットプレート上で回収したスキャフォールドでは、予想通りに繊維がランダムに分布します。一方、回転マンドレル上で回収したスキャフォールドでは、繊維が配向して生成されます。スキャニング電子顕微鏡で観察した際に整列した繊維を生成するため、スキャホールドを脱イオン水および非反応性haに浸漬させた後、スキャホールドと光源の間にフォトマスクを配置して光架橋を行います。光が遮られた領域のPEOは除去され、蛍光染料から明らかなようにマクロポアが形成されます。MEHAとPEOのジェットを同時に電界紡糸することで、個々のポリマーからなる明確な繊維集団を含む複合スキャホールドが得られます。HMCは繊維と良好に相互作用していると考えられます。緑色の染色から明らかなように、生存しているだけでなく、赤色の繊維に沿って配向するように誘導されているようです。以上で、組織工学のための繊維足場をエレクトロスピンする方法について説明しました。また、フォトパターニングやマルチポリマー電界紡糸などの追加機能も導入しました。この手順を行う際は、さらなる実験を試みる前に、均一な繊維を形成できるよう、各ポリマーの電界紡糸パラメータを最適化することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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この記事は、亜臨界 CO2流体の減圧による 3 次元 (3 D) 足場に伝統的な 2 次元 (2 D) エレクトロスピニング ナノファイバー マットを拡大する方法を示します。これらの拡張の足場は 3 D、厳密に模倣細胞 nanotopographic...

2 次元エレクトロスピニング ナノファイバー マットの 3 次元足場への拡張

組織工学への実験的アプローチ

学ぼう、組織工学と細胞培養のための電気紡糸法による繊維状足場の作製。光反応性ヒアルロン酸を用いた架橋とフォトパターニング、多層ポリマー足場形成の応用技術を含む。

組織工学と細胞培養のための繊維状重合体の足場をエレクトロ

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