Name: の単離と精製ショウジョウバエ末梢ニューロン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学ぶショウジョウバエ末梢ニューロンの磁気ビーズソートによる単離精製法。CD8-GFP融合タンパク質を標的とした抗体コーティング磁気ビーズを用いて、高純度のニューロン集団を効率的に取得し、遺伝子発現解析などの下流応用に活用できます。

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我々は、博士に感謝する。塩原-ティンニン本研究で使用されてこない系統を提供するための月とウェスGrueber。著者らはこの研究の支援（DNC）とジョージメイソン大学の学長のオフィス（EPRI）のためにトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストを認める。

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

ここで紹介するプロトコールは、磁気ビーズ細胞選別の戦略を用いてショウジョウバエの三齢幼虫のクチクラの内側の表面に強固に付着末梢神経細胞の単離および精製のために最適化されています。我々は特にショウジョウバエのDAニューロンを分離するためにこのプロトコルを使用している一方で、開発の幼虫または蛹の段階で表皮に付着する他の細胞型の分離にこのプロトコル（例えば上皮、筋肉、その他の末梢ニューロン）のアプリケーションがで適応させることができるいくつかのパラメータを変化させると、細胞のタイプや金利の種類のラベルの異なるGAL4、UAS - mCD8 - GFPレポーター導入遺伝子を使用して。また、このプロトコルは、目的の遺伝子が遺伝子のどちらかを指示するGAL4遺伝子と結合することができますUAS - mCD8 - GFPの導入遺伝子にクローニングすることができる両方の機能喪失と機能獲得型のアプローチで使用することができます特定の機能喪失（ 例：UAS - RNAi実験 ）または関心の細胞型への機能獲得型。例えば、転写因子の場合には一つの機能喪失または機能獲得型の関心の細胞型におけ...

機器<ul><li> （10）ネオジウムブロックマグネット（K＆J Magnetics、Inc。製、カタログ番号B444B）、代わり™-2（Invitrogen社、カタログ番号123 - 21D）を使用することができますdynamagを。 </li><li>大クリアランス乳棒付きKontesガラスティッシュグラインダー、2ミリリットルの作業能力、（カタログ番号＃885300〜0002） </li><li>セルのフィルタ、例えば、MACSプレセパレーションフィルター（ミルテニーバイオテク社、カタログ番号130-​​041-407） </li><li> 35ミリメートルペトリ皿Sylgard（ダウコーニング社、カタログ番号3097358〜1004）でコーティング</li><li>解剖ツール：デュモン5号鉗子の2ペア（ファイン科学のツール、カタログ番号11251から20。） </li><li> Vannas春顕微解剖用はさみ（ファイン科学のツール、カタログ番号15000〜08） </li><li>使い捨てチップとピペット（P - 1000、P - 100、P - 10） </li><li>細胞と見積もりの​​純度をカウントする標準血球計数器</li><li>標準直径の火ポリッシュのヒントとパスツールピペットは、標準の直径の約50％に縮小し、粉砕のための標準的な直径の約25％に縮小</li><li>テーブルトップマイクロ遠心機（1-16,000（X）g）の</li><li>渦</li><li>蛍光ステレオ顕微鏡（ライカMZ16FAはこのプロトコルで使用されていた） </li></ul>

の単離と精製ショウジョウバエ</em磁気ビーズソート別>末梢ニューロン

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;末梢神経系（PNS）は、機能と分子レベルでのニューロンの発達と樹状突起の形態形成の複雑なプロセスを調査するための強力なモデルです。これらの分析を支援するために、我々は、広く樹状突起の形態形成を研究するために使用されている樹状分枝（DA）ニューロンと呼ばれるPNSニューロンのサブクラスの分離のための戦略を開発している<sup&gt; 1,2</sup&gt;。これらのニューロンは、部分的にそれらの非常に低い発生と厳しいキチン質の幼虫のクチクラ下の彼らの困難な到達位置のために、純粋な集団として分離するのは非常に困難です。新たに開発した手法は、これらの課題を克服し、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いて迅速かつ特異的な細胞の濃縮に基づいています。私たちの磁気ビーズソーティング研究のために、我々はマウスCD8タグ付けされたGFPの融合タンパク質を（表現する年齢をマッチさせた三齢幼虫を用いている<em&gt; UAS - mCD8 - GFP</em&gt;）<sup&gt; 3</sup&gt;クラスIVの樹状突起の分枝のどちらかの制御下にある（DA）ニューロン特異的<em&gt;スリ（PPK）- GAL4</em&gt;ドライバー<sup&gt; 4</sup&gt;またはパン- DAニューロン特異的GAL4の制御<sup&gt; 21から7</sup&gt;ドライバー<sup&gt; 5</sup&gt;。このプロトコルは、いくつかのパラメータを変化させることによって、幼虫のクチクラの内壁に付着しているPNSの細胞を単離するために最適化されているが、同じプロトコルはの幼虫or蛹の段階で表皮に接続されている多くの異なる細胞型を分離するために使用することができるGAL4固有のドライバの発現パターンに応じて幼虫の器官からの開発（例えば上皮、筋肉、oenocytesなど）、または他の細胞型。この方法により単離されたRNAは高品質のものであり、容易にこのようなマイクロアレイの遺伝子発現プロファイリング研究のような下流のゲノム解析に使用することができます。このアプローチは、分離の研究を実行する強力な新しいツールを提供しています<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;樹状分枝（DA）ニューロンは、それによって樹状突起形態形成の分子メカニズムに新たな洞察を提供しています。

このビデオ、記事では、の単離および精製のための方法を提示<em&gt;ショウジョウバエ</em高速磁気ビーズアシスト細胞選別の戦略を使用して&gt;末梢神経。単離された細胞から得られたRNAは、容易にマイクロアレイ解析などのダウンストリームアプリケーションに使用することができます。

ショウジョウバエ（Drosophila）の末梢神経系（PNS）は、ニューロンの発達および樹状突起の複雑な過程を研究するための強力なモデルである。

ニューロン特異的なCD8-GFP融合リポーター導入遺伝子を持つショウジョウバエ幼虫を用いて、DAニューロンを単離します。幼虫のクチクラを裏返しにして末梢神経系を露出させることで、解剖を行います。裏返した幼虫に酵素処理による解離を行い、続いてボルテックス処理とピペッティングによる機械的解離を行います。次に、細胞をろ過して、主に上皮細胞、筋肉細胞、およびニューロンを含む単一細胞懸濁液を得ます。この細胞懸濁液に抗体コート磁気ビーズを添加し、CD8タグ付きGFP融合タンパク質を発現しているニューロンに結合させます。最後に、溶液を強磁場に置くことで磁気ビーズがコートされたニューロンを単離し、高純度のニューロン集団を得ます。ジョージ・メイソン大学クラスノ高等研究 institutes の分子微生物学部から来ました、Dan Coxです。Dan Cox博士の研究室のIsh AERです。本日は、磁気ビーズソート法によるDRG末梢ニューロンの単離および精製の手順をご紹介します。当研究室では、クラス特異的な右側形態形成を制御する分子メカニズムを研究するためにこの手順を用いています。それでは始めていきましょう。まず、齢の揃った3齢の星状幼生を30〜50匹選び、1X PBSを1〜1.2 mL含む1.6 mLマイクロ遠心チューブに入れます。チューブを閉じ、最大設定で1秒間×3回のボルテックスを行う。火炎滅菌したピペットを使用して、上清を完全に除去する。1 mLのPBSを加え、上清から食物粒子やデブリが完全に見えなくなるまで、洗浄とボルテックスの手順を3回繰り返す。70%エタノール1 mLで短時間洗浄を繰り返します。次に、2回蒸留水1 mLで幼虫を2回洗浄します。最後に、RNase-away 1 mLで再度1回洗浄し、さらに2回蒸留水1 mLで3回洗浄して、RNase-awayを完全に除去します。これで、幼虫を解剖できる状態になります。シルガードでコーティングした35 mmペトリ皿の中央に、12〜12匹の幼虫を配置します。幼虫同士が少し離れるように配置し、適切な発生段階にないと思われる個体は取り除きます。次に、鈍いデュモンピンセットで固定し、微細解剖用ハサミを用いて幼虫の前端を切開します。5番目はピンセットです。幼虫を裏返しにします。まず、一方のピンセットを幼虫のクチクラ内に挿入し、後端まで到達させます。ピンセットの先端を合わせて、クチクラの後端を掴みます。クチクラをシルガードの表面に押し付けると、作業が容易になります。もう一方のピンセットを使用して、幼虫のクチクラを裏返しに押し出します。細胞を容易に解離させるため、幼魚が完全に反転し、すべての軟組織が溶液にさらされていることを確認してください。細胞の解離を試みる前に、この操作を数回練習してください。3〜4匹の幼魚を解剖した後、直ちにマイクロ遠心チューブに入れた新鮮な氷冷PBSに移します。非特異的な細胞を除去する前に、必要な30から40匹の幼虫が集まるまでこの操作を繰り返します。すべての幼虫を解剖する段階では、解剖および結合の過程で10から20%の損失が予想されることに留意してください。脂肪体や中枢神経系細胞などの、緩く付着している非特異的な組織を除去します。反転させた幼虫のクチクラが入ったチューブの上清を 700 to 800 µL の氷冷した新鮮な PBS で置換します。最後に、ボルテックスミキサーを用い、最大速度で 3 秒間のパルスを 5 回、マイクロ遠心チューブに加えます。その後、上清を捨て、約700から800 µLの新鮮な氷冷PBSで置換します。この工程を3回繰り返し、最後に幼虫のクチクラを400 µLの新鮮な氷冷PBSに再懸濁します。樹状突起の分枝または幼虫ニューロンを単離するために細胞を解離させる前に、冷PBSを使用します。酵素的解離と機械的解離を組み合わせて行います。過剰な解離は細胞表面マーカーの消失を招き、細胞回収率の低下や生存率の低下につながる可能性があるため注意してください。PBS 400 µLに懸濁させた幼虫クチクラに、1 vialあたり28 unitsの1× Liase Zyme IIIを1.5 µL加えて解離を開始します。溶液を最大設定で1秒間、2〜3回ボルテックスし、クチクラに緩く付着している細胞を溶液中に遊離させます。次に、溶液を室温で5分間インキュベートします。インキュベーション時間は最終的な細胞分取効率に大きく影響するため、インキュベーションパルスの終了時に15分を超えないようにしてください。チューブを最大速度で20〜30回ボルテックスし、1回のパルスにつき2秒間処理します。これにより、筋肉およびその他の非特異的組織が溶液中に放出されます。周辺ニューロンが依然としてクチクラに付着しているかどうかを確認するため、蛍光機能付き実体顕微鏡で定期的にサンプルを観察してください。蛍光対応実体顕微鏡でマイクロ遠心チューブ内を直接観察し、溶液から少量のサンプルを点検して解離レベルを判定します。解離の各工程においてこの確認を継続し、末梢ニューロンがクチクラから溶液中へ解離し始めたところでボルテックス処理を停止します。氷冷した新鮮なPBSを1 mLずつ2〜3回交換し、幼虫のクチクラを短時間洗浄します。最後に、再懸濁を行います。1% BSAを含む冷たい新鮮なPBS 500 µLに懸濁させます。細胞の機械的解離を続けるために、1% BSA含有PBS溶液を用いて、2 mLの組織グラインダーとクリアランスの大きいペッスルを使用します。その後、軽く洗浄し、BSA溶液を捨てます。これにより、幼虫のクチクラがガラス表面に付着するのを防ぎます。続いて、細胞の損傷や溶解を防ぐため、組織ホモジナイザーとペッスルを氷上に数分間置いて予冷します。その後、火炎滅菌したパストールピペットを使用して、クチクラを組織ホモジナイザーに移します。次に、泡立てないように注意しながら、ゆっくりと一定のストロークで組織を約20〜30回押し潰します。ゆっくりと一定の速さで押し潰すようにしてください。そうしないと、細胞が溶解する可能性があります。細胞の解離レベルを評価するために、組織ホモジナイザーの壁面を清潔なキムワイプで拭き取り、蛍光実体顕微鏡下で観察します。ニューロンがクチクラから脱落し、溶液中に見られるはずです。幼虫のクチクラにニューロンが残っていないことが、細胞解離が良好であることの指標となります。しかし、依然としてクチクラに付着しているニューロンが見られる場合、または完全に解離した細胞が不十分な場合は、細胞が単一細胞懸濁液になるまでさらに解離させます。火炎研磨したパスツールピペットを用いて機械的解離を継続してください。標準的なチップ径の約50%まで細めたピペットを用いて、溶液を5回、次いで10回ピペッティングします。標準的なチップ径の約25%まで細くします。無理な回転は細胞を損傷させる可能性があるため注意してください。各ステップの間で細胞の状態をモニタリングし、適宜手順を調整してください。最後に、溶液を30 µmのセルフィルターでろ過し、細胞ろ液を1.6 mLマイクロ遠心チューブに回収します。得られた溶液は単一細胞懸濁液となっており、これで磁気細胞分取が可能な状態になります。anti-CD8抗体をコートした磁気ビーズを使用します。付属の書面プロトコルに従って調製されており、DAニューロンは抗体によって標的となるCD8-GFP融合タンパク質を発現しています。500 µLの細胞懸濁液に15 µLの抗体コート磁気ビーズを添加し、細胞分取を開始します。抗体コート磁気ビーズとともに細胞を氷上で30～60分間インキュベートし、時々手で混ぜ合わせます。より高い温度でのインキュベートや、より長い時間のインキュベートは、抗体の非特異的結合を引き起こす可能性があります。次に、マイクロチューブを強磁場に2分間置きます。ポジティブセレクションされたすべての細胞と未結合のビーズがチューブの壁面に付着します。細胞ペレットを乱さないように上清をゆっくりと吸引し、氷冷した新鮮なPBSで細胞を3〜4回洗浄します。この工程により、残存している非特異的な細胞が除去されます。最後に、細胞の純度と収量を推定するため、30 µLの冷えた新鮮なPBSで細胞を再懸濁します。細胞懸濁液5 µLをヘモサイトメーターの研磨面にピペットで滴下し、蛍光実体顕微鏡下で視認できるすべての蛍光細胞をカウントします。また、非蛍光細胞の量や不純物の有無も確認してください。通常、サンプルには蛍光細胞が高純度で濃縮されています。最後に、pico pure RNA isolation kitを使用して、ビーズに結合した細胞からRNAを単離します。ソートされた細胞に抽出バッファーを添加しますが、カラム精製ステップの前に磁石を用いてビーズを除去してください。抽出したRNAを1 µL用い、Agilent Bioanalyzer 2100で全RNAの品質を評価します。単離されたDAニューロンから精製されたRNAは、Agilent 2100 Bioanalyzerで解析した際に5.8 sおよび28 sリボソームRNAのシャープなピークが確認されたことから、極めて高品質であることが示されました。30〜43時間のスター幼虫を用い、PPK gal fourドライバーを使用して平均300〜500個のクラス4 DAニューロンを、またクラス1、2、3、および4のDAニューロンを1500〜2000個単離することができました。pandaニューロン特異的gal fourドライバーを用い、ニューロン特異的マーカーであるL 11およびfchによる定量RT-PCRを行ったところ、両者ともに顕著な濃縮倍率が認められ、本手法で実証したプロトコルを用いることで、フロースルーと比較してDAニューロンが高度に特異的に濃縮されることが明らかになりました。最後に、pandaニューロンおよびクラス4 DAニューロンから単離したRNAを用いて、Agilent Drosophila Melanogaster全ゲノムオリゴマイクロアレイによる転写発現プロファイリングを行い、DAニューロンの形態形成に関与する多くの因子を同定しました。ここでは、幼虫の3齢期から磁気ビーズソートを用いてショウジョウバエの末梢ニューロンを単離および精製する方法を説明しました。この手順を行う際は、酵素的解離と機械的解離のステップのバランスをとることが重要です。酵素的解離を過剰に行うと、細胞表面マーカーであるCD8が分解され、細胞ソートの効率低下や失敗につながる可能性があります。また、単離したニューロンから精製したRNAの完全性を維持するため、手順全体を通してRNaseフリーの状態を維持することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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