Name: 6.5 DPCのマウス胚の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶマウス胚の解剖法。6.5 DPCの初期原条期胚を鈍い鑷子と剪刀を用いて分離し、組織層を慎重に剥がして透明な胚を可視化する技術です。発生生物学における遺伝子パターニングと細胞系譜決定の研究に応用できます。

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雌のマウスからの生殖器官の解剖<ol><li>妊娠動物は、圧縮ガスを使用してCO 2窒息により安楽死させる。 </li><li>吸収性パッド上に動物の仰臥位に置き、マウスの毛で解剖を汚染の危険性を減らすために70％エタノールに浸けます。 </li><li>皮膚をつまんで、通常の手術用はさみで正中線にある小さな横切開を行います。しっかりと切開の上下の皮膚を持ち、腹部を露出する頭部と尾部に向かって離れて皮膚を引っ張る。 </li><li>鉗子で腹膜を掴んで、腹腔を露出するカット。 </li><li> two子宮角、卵管と卵巣：体腔の背側領域での生殖器官を見つけます。 </li></ol>プリミティブストリーク段階（6.5 DPC）解剖<ol><li>卵管下子宮を把握し、子宮角を取り出して、子宮間膜に沿って、それがフリーカット。氷冷PBSで切除した子宮を置きます。 <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_2/160_figure-1.jpg" alt="図1" width="263" height="132"> 図1 </li><li>子宮角に沿って注入部位との間で切断することにより、各胚を区切ります。 <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_7_8_3/160._figure-2.jpg" alt="図2" width="575" height="171"> 図2 </li><li>周囲の筋層と包ま脱落膜組織との間に時計メーカーの鉗子をスライドさせて筋肉の子宮内膜をつかみます。筋層バックピール、脱落膜を露出させる。 <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_4/160_Figure-3.png" alt="図3" width="593" height="166"> 図3 </li><li>同封の胚のmidventralまたは遠位端を露出される頂点（脱落膜組織の約1 / 5）で露出脱落膜の一部をオフにクリップ。 <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_5/160_Figure-4.png" alt="図4" width="589" height="212"> 図4 </li><li>胚は、鉗子の先端を使用して砲撃することができます。ピアース離れて脱落膜を引き裂くために胚とオープン鉗子を取り巻くピンセットで脱落。 <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_6/160_Figure-5.png" alt="図5" width="249" height="200"> 図5 </li><li>一度胚が削除される、Reichartの膜はまだだけでなく、栄養膜のコーン（栄養膜）を結合することができる。胚は、慎重に解剖によって、さらに解剖することができます。 <img src="/files/ftp_upload/old/160_2008_8_15_7/160_Figure-6.png" alt="図6" width="356" height="222"> 図6 </li></ol>

<ol><li>Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).</li>
</ol>

マウスのPostimplantationは4.5 DPCと出産の間で発生します。この解剖の方法は、前または後5.5〜8.5 DPCでのステージの胚を分離するために、基本的に前述のように、適用することができます。

<table><tbody><tr><td>マイクロ解剖ピンセット（ギザ付き、直線型）</td><td>器具</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5130</td><td>2ペア</td></tr><tr><td>マイクロ解剖用ツイーザー（パターン#55 INOX）</td><td>器具</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td>2ペア</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s リン酸緩衝生理食塩水 (1x)</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 滅菌済みポリスチレン製ペトリ皿</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (PBS溶液)</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直線型鋭尖解剖用ハサミ</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>妊娠雌マウス</td><td>動物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

6.5 dpcのマウス胚の解剖

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

哺乳類の胚発生の初期段階での遺伝子発現パターンの解析は、遺伝子の機能、細胞間相互作用とシグナル伝達機構そのガイド胚のパターン形成についての重要な手がかりを提供することができます。しかし、まもなく移植後の脱落膜からマウス胚の解剖は、挑戦的な手順にすることができ、このプロセスの詳細なステップバイステップの資料が不足している。 ここでは、移植後（6.5 DPC）胚が最初に妊娠マウス（膣栓が指定されていた一日0.5 poistの交尾の検出）の子宮を解剖し、その後母体脱落膜から胚を解剖によって分離されている方法を示しています。ライヘルトの膜の郭清は、栄養膜の円錐の除去と同様に記述されています。

postimplantation段階の胚の分離は1つが遺伝子のパターンを研究し、胚発生時にプロセスを作る細胞系譜の決定を分析することができますが、初期胚の適切な解剖は挑戦することができます。このプロトコルは、初期の原始-ストリーク段階の胚を単離する方法を説明します（〜6.5日後に交尾[DPC]）。

6.5 DPCのマウス胚の解剖

哺乳類胚発生の初期段階における遺伝子発現パターンの解析は、遺伝子機能や細胞間相互作用に関する重要な手がかりを提供します。

私の名前はケリー・シェイです。ニールセン研究室のラボマネージャーおよびリサーチテクニシャンを務めています。多くの人が異なる組織層の区別に苦労するため、ここは非常に難しいところです。基本的には、すべての組織層を剥がして、その下にある胚を露出させる必要があります。この時点での胚は血管分布がほとんどないため、非常に透明で、判別が困難です。先端が丸いピンセットとハサミを用意します。まず、動物の中線付近をピンセットでつまみ、最初の切開を行います。その後、そこから皮膚を広げることで、動物の腹部を露出させます。ピンセットで腹膜の薄い層を上に引き上げ、それをハサミで切り離して、後ろに折り返します。次に、動物の正中線に沿って切り込みを入れ、中央でつながっている両側の子宮角を引き離します。根元の部分で切断してください。脂肪が多く混入すると思われます。動物の子宮角をすべて取り出し、そのままPBSに入れてください。これが角の内側です。ここが1、2、3、4、5の移植部位になります。ここを切り離してください。基本的には、ここで着床部位の間を切断します。胚の側面をつかみ、基本的にはそれを押し広げるようにして分けます。この時点で、下にあるより海綿状の組織である脱落膜が露出します。したがって、胚はこのちょうど真ん中、ここに位置しているはずです。ここが子葉の先端です。先端を上に向けて配置してください。頂端から約5分の1の位置で切り取ります。胚はこのちょうど中央に位置しているはずです。私は、胚を横向きに配置し、一方のピンセットで掴み、もう一方で固定しながら先端を切り取り、その後、切り離しています。キャップを外したら、胚を縁で立てます。ご覧の通り、キャップを外した箇所に開口部があります。そこにピンセットを差し込みます。はい。この時点では、胚は子宮内に非常に緩く収まっています。子宮を切り開いて、胚の基部から持ち上げるようにすれば、基本的には比較的簡単に取り出すことができます。非常に小さいので注意してください。胚にはまだいくつかの組織が付着しています。胚の先端部分には外胎盤円錐（ecto placental cone）があり、他にもいくつかの組織が付着したままになっています。そこで、ピペットを用いて胚を吸い上げます。この段階で胚を固定します。あらかじめPFA（パラホルムアルデヒド）を用意しておきます。我々は候補遺伝子について検討したいと考えました。基本的には、ホールマウントin situハイブリダイゼーション法を用いて、胚内における核酸の産生を可視化しています。我々が特に関心を持っているこれらの特定の遺伝子は、推定上の生殖細胞前駆細胞マーカーをコードしており、また、推定上の生殖細胞前駆細胞から生殖細胞へと発達・成熟するのを助ける特定の時点において、マウス胚で発現すると予測されています。私たちがまず非常に興味を持っていた因子であり、実際にこれらの胚齢6.5日の胚でホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った最初の因子が、骨形成タンパク質4（BMP4）でした。これはTGF-βスーパーファミリーの一員です。この因子は非常に重要であり、生殖細胞の成熟に不可欠です。また、生殖細胞が胚全体を移動し、胚の原始線付近に位置することも必要です。BMP4は、そのシグナル伝達と、生殖細胞が原始線に位置するために必要な成熟過程の両方において重要な役割を果たします。したがって、まず第一に、何を探しているのかを把握し、それがどの程度の大きさであるか、どのスケールで作業しているのかを理解し、さらに非常に慎重に計画を立てることが重要です。この手法では、特にどのような解剖顕微鏡を使用するかが重要です。技術的な困難さの一つとして、胚を傷つけないために、多くの操作を非常に慎重かつ安定した手の動きで行う必要があることが挙げられます。そのため、操作スペースが十分に確保された解剖顕微鏡を選定してください。また、解剖中の不要な操作を最小限に抑えるため、実験に必要なすべての準備をあらかじめ整えておくことが重要です。それ以外については、非常にゆっくりと慎重に、個々の組織層を剥離して、現在の状況を正確に把握する必要があると思います。そして、胚がどこに位置しているかを必ず確認してください。

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生物学

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6.5 DPCのマウス胚の解剖

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