6.5 DPCのマウス胚の解剖

私の名前はケリー・シェイです。ニールセン研究室のラボマネージャーおよびリサーチテクニシャンを務めています。多くの人が異なる組織層の区別に苦労するため、ここは非常に難しいところです。基本的には、すべての組織層を剥がして、その下にある胚を露出させる必要があります。この時点での胚は血管分布がほとんどないため、非常に透明で、判別が困難です。

先端が丸いピンセットとハサミを用意します。まず、動物の中線付近をピンセットでつまみ、最初の切開を行います。その後、そこから皮膚を広げることで、動物の腹部を露出させます。

ピンセットで腹膜の薄い層を上に引き上げ、それをハサミで切り離して、後ろに折り返します。次に、動物の正中線に沿って切り込みを入れ、中央でつながっている両側の子宮角を引き離します。根元の部分で切断してください。

脂肪が多く混入すると思われます。動物の子宮角をすべて取り出し、そのままPBSに入れてください。

これが角の内側です。ここが1、2、3、4、5の移植部位になります。ここを切り離してください。

基本的には、ここで着床部位の間を切断します。胚の側面をつかみ、基本的にはそれを押し広げるようにして分けます。この時点で、下にあるより海綿状の組織である脱落膜が露出します。

したがって、胚はこのちょうど真ん中、ここに位置しているはずです。ここが子葉の先端です。先端を上に向けて配置してください。

頂端から約5分の1の位置で切り取ります。胚はこのちょうど中央に位置しているはずです。私は、胚を横向きに配置し、一方のピンセットで掴み、もう一方で固定しながら先端を切り取り、その後、切り離しています。

キャップを外したら、胚を縁で立てます。ご覧の通り、キャップを外した箇所に開口部があります。そこにピンセットを差し込みます。はい。

この時点では、胚は子宮内に非常に緩く収まっています。子宮を切り開いて、胚の基部から持ち上げるようにすれば、基本的には比較的簡単に取り出すことができます。非常に小さいので注意してください。

胚にはまだいくつかの組織が付着しています。胚の先端部分には外胎盤円錐（ecto placental cone）があり、他にもいくつかの組織が付着したままになっています。

そこで、ピペットを用いて胚を吸い上げます。この段階で胚を固定します。あらかじめPFA（パラホルムアルデヒド）を用意しておきます。

我々は候補遺伝子について検討したいと考えました。基本的には、ホールマウントin situハイブリダイゼーション法を用いて、胚内における核酸の産生を可視化しています。我々が特に関心を持っているこれらの特定の遺伝子は、推定上の生殖細胞前駆細胞マーカーをコードしており、また、推定上の生殖細胞前駆細胞から生殖細胞へと発達・成熟するのを助ける特定の時点において、マウス胚で発現すると予測されています。

私たちがまず非常に興味を持っていた因子であり、実際にこれらの胚齢6.5日の胚でホールマウントin situハイブリダイゼーションを行った最初の因子が、骨形成タンパク質4（BMP4）でした。これはTGF-βスーパーファミリーの一員です。この因子は非常に重要であり、生殖細胞の成熟に不可欠です。

また、生殖細胞が胚全体を移動し、胚の原始線付近に位置することも必要です。BMP4は、そのシグナル伝達と、生殖細胞が原始線に位置するために必要な成熟過程の両方において重要な役割を果たします。したがって、まず第一に、何を探しているのかを把握し、それがどの程度の大きさであるか、どのスケールで作業しているのかを理解し、さらに非常に慎重に計画を立てることが重要です。

この手法では、特にどのような解剖顕微鏡を使用するかが重要です。技術的な困難さの一つとして、胚を傷つけないために、多くの操作を非常に慎重かつ安定した手の動きで行う必要があることが挙げられます。そのため、操作スペースが十分に確保された解剖顕微鏡を選定してください。また、解剖中の不要な操作を最小限に抑えるため、実験に必要なすべての準備をあらかじめ整えておくことが重要です。

それ以外については、非常にゆっくりと慎重に、個々の組織層を剥離して、現在の状況を正確に把握する必要があると思います。そして、胚がどこに位置しているかを必ず確認してください。