Name: 解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-10T17:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: 学ぶ解離成体哺乳類神経細胞へのcDNA核内マイクロインジェクション法。分裂後細胞への高効率トランスフェクション技術で、タンパク質機能を生理学的環境で研究可能にする。

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当研究室の研究は、NIHの学内研究プログラム、アルコール乱用やアルコール依存症の国民の協会によってサポートされています。

<html>注射のためのI.準備このセクションでは、神経細胞の核内にcDNAを注入する前に取られる必要のある準備の手順を説明します。神経細胞の分離手順については、この資料の範囲外ですが、それは個々の細胞に解離神経細胞を持っていると（これを達成するために役立つヒントのためのディスカッションを参照）35 mmの細胞培養皿の底面によく付着することが重要です。別のニューロンの様々な潜在的に使用することができるが、それらが便利にアクセス可能であり、神経細胞の多数を得るため、そのような上頚神経節（SCG）または背根神経節などの末梢神経節は解剖のために好ましい。 SCGニューロンを使用しての付加的な利点は、比較的均一な細胞の集団と十分に特徴付けられた1,2,3,4であることです。 注射のためのcDNAをプラスミドのA.の準備<ol><li> DNAの汚染あるいは破壊を防止するために、手袋は準備中に着用してください。 </li><li>関心のあるタンパク質をコードするDNAは、非常にと構成的に活性なサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下で、PCIなどの適切な哺乳動物発現ベクター、（プロメガ社、マディソン、WI）にサブクローン化されています。タンパク質にラベルが付いていない場合、例えばレポータープラスミド、エンコードEGFP（pEGFPを- N1、BD Biosciences社クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）は、成功した注射や表現を確認するために共同注入されます。 DNAは高品質の分離カラムを用いて単離し（例えばQIAfilterミディプレップキット、キアゲン社、チャッツワース、カリフォルニア州）とさらにで微粒子を除去するためにPVDFフィルター（0.1μm以下、ミリポア、ベッドフォード、MA）で遠心フィルターユニットを用いて精製する注入処理中に注入ピペットを妨害できるプラスミドの調製、。プラスミドは、適切なDNAの記憶のバッファー（10 mMトリス、1mMのEDTA、pH8.0の例：TEバッファー）で約1μg/μlの濃度で-20℃で保存されています。 </li><li>マイクロインジェクションの直前に、プラスミドのcDNAをTEバッファーまたはH 2 O中の所望の最終濃度に希釈し、混合されています通常は、5〜10 ngの/レポーター遺伝子の液は注入​​された細胞を標識するのに十分であり、そしてDNAが高濃度で粘度が高いとインジェクションピペットを詰まらせることができるので、注入されるcDNAの合計濃度が200 ng /μLのを超えてはならない。注入（5〜10μlの）のためのcDNAの少量をパラフィルムの小片（裏紙の下側）の清浄表面上の解の滴を混合することによって調製される。 pipetorで数回上下にペッティングで一緒にソリューションの滴を混合し、混合時に気泡を導入することは避けてください。 </li><li> microloaderのピペットチップ（エッペンドルフ、ブリンクマンインスツルメンツ、ウェストベリー、ニューヨーク州）を使用して、特別に調製されたヘマトクリット管（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）のcDNA溶液を移す。ヘマトクリット管を（材料表）の準備の手順については、材料のセクションを参照してください。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにcDNA注射液を含むヘマトクリットチューブを置きます。 </li><li>室温（20〜24 ° C）底質粒子へのcDNA溶液でブロックすることがありますその時に、固定角度やスイングバケットローター（エッペンドルフ）を搭載したマイクロ遠心機で10 000 gで15〜30分間チューブを遠心マイクロインジェクションピペット。 cDNAの注射液を注入セッション中に室温で保存することができます。 </li></ol>インジェクションピペットのB.作製<ol><li>使い捨てガラスマイクロインジェクションピペットは（マイクロインジェクションピペット当たり10ドル）が便利ですが、高価である、（例えばFemtotips、エッペンドルフ）市販されている。インジェクションピペットは、プログラム可能なP - 97燃えるブラウンピペットプラー（サター器械公司、ノヴァト、カリフォルニア州）とfilamented、薄肉ホウケイ酸ガラス毛細管（世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州）を用いて実験室で製造することができる。このオプションは、コスト効率が高くなりますし、マイクロインジェクションピペットの形状とサイズの制御が可能になります。 </li><li>二段階のプログラムが狭いマイクロインジェクションピペットチップをプルするために使用されます。マイクロインジェクションピペットの開口部は光学顕微鏡下で検査するには狭すぎるので、インジェクションピペットの品質は、プログラムの設定が確定される前に少数の細胞を注入することにより直接評価する必要があります。 ;（プル2）640、130、65、200（プル1）600、115、15、250：以下、熱、プル、速度と時刻の設定のためのおおよその設定です。これらの設定は、ガラスの異なるバッチとし、引き手の加熱フィラメントの状態によって様々であり、必要に応じて調整する必要があります。詳細については5を参照してください。 </li><li>注射のセッション中に損害や問題の場合には、注入される神経細胞のディッシュあたり数（2-5）注射のピペットを引き出します。マイクロインジェクションピペットチップゴミの浸入を防ぐために蓋をした容器に注入ピペットを保管してください。 </li></ol> II。核内微量注入テント&quot;&gt;このセクションでは神経細胞の核へのcDNAを投入するプロセスには、基本的なマイクロインジェクションは、セットアッププロセスを可視化するために倒立位相差顕微鏡（例えばニコンDiaphot TMD、ニコン、メルヴィル、ニューヨーク州）、マイクロマニピュレーターを（含まれています例：ピペットからcDNA溶液を追放するために射出ピペットと圧力注入器（例えば、エッペンドルフFemtoJetエクスプレス）の動きを制御する。マニピュレータに圧力注入器を接続するエッペンドルフ5171）は、注射時に後者の二つのプロセスの同期が可能になります。その他オプションですが、強く推奨、コンポーネントがマウントされているビデオ監視システム（CCDカメラ、Cohu社、サンディエゴ、カリフォルニア州、黒と白のビデオモニター、ソニー株式会社、東京、日本）が含まれます。このシステムは、注射のための絶対条件ではない。ただし、黒と白のモニタは、細胞核のimproved可視化のために高いコントラストを提供し、長い注射セッション中に、より快適な視聴体験を提供しています。さらに、ハンドヘルドコントローラを操作するソフトウェアを実行しているラップトップコンピュータが、半利用でき​​る（詳細については説明を参照）注射のプロセスを自動化。 SCG神経細胞を注入するために理想的な時間は3-6時間後の解離です。この段階で、細胞がしっかりと皿の底に取り付けられた、球状であり、そして核は、単一または複数の核小体（図を含む、暗い膜と中央の丸い細胞小器官として、位相差顕微鏡下で、はっきりと見ることが1A）。 <ol><li>顕微鏡ステージの中央に解離ニューロンの皿を置きます。フォーカスを調整し、神経細胞の核がはっきり見えるように顕微鏡の位相差光学系を最適化する。 </li><li> microloaderのピペットチップを使用してマイクロインジェクションピペットに調製したcDNA溶液のピペットを2μl。これは遠心操作中に定住微粒子を巻き起こす可能性があるため、ヘマトクリット管の底部近くに解決策を策定することは避けてください。マイクロインジェクションピペットのフィラメントは、先端に解決策を描くのに役立ちますが、小さな気泡が消えない場合は、静かにそれらを取り除くために、ガラスの側面をフリックしてください。 </li><li>圧力インジェクタのキャピラリーホルダーにマイクロインジェクションピペットを挿入し、マイクロマニピュレータにホルダーを固定します。ホルダーは、45 °の角度で固定されています。 </li><li>皿にマイクロインジェクションピペットを下げます。ピペットで培養液に入ると、メニスカスは、光の屈折に影響を与えると神経細胞の画像品質を低下させるように形成されている。神経細胞の核が再びはっきりと見えるようになるまでこの問題を軽減するために、位相リングのタレットはわずかに相殺することができます。 </li><li>何らかの圧力噴射システムは、短時間マイクロインジェクションピペットの先端から最大空気圧を適用する&quot;クリーン&quot;機能を持っている。先端が詰まっているような場合開始する前に、注射時の破片のピペットを消去するには、この関数を使用します。この機能を使用中に払拭流体が画面上に表示されていない場合は、新しいインジェクションピペットで交換してください。 </li><li>中央視聴モニターのマイクロインジェクションピペットとニューロンの横と核小体と同じ焦点面で先端を合わせます。マイクロマニピュレータの下限z軸リミットとしてこの位置を設定します。この位置は、マイクロインジェクションピペットを注入中に進出する深さです。マイクロインジェクションピペットはニューロンの上部をクリアするので、今は約30μmのこの点、上記のヒントを置きます。 </li><li>エッペンドルフ5171マイクロマニピュレータの&quot;挿入&quot;モードは、核内注入を実行するには、以下の設定を使用して定義することができます。 注入機能がオンに設定され、 自由に動けなくする機能がオフに左をおいた。斜め注入パスは、（x -とz -軸に沿って）細胞の損傷の最小量を生成するため、 軸方向のモードは、注射のために使用する必要があります。 300μmの/ sの射出速度は十分であり、マイクロインジェクションピペットをセットz軸の上限に達すると圧力がビルドアップと同期させます。 </li><li>圧力注入器は、核内に注入されたcDNA溶液の量を制御します。 &quot;自動&quot;注入モードでは、DNAの配信は、接続されたマニピュレータによるリアルタイム制御と開始されます。 射出圧力 （Piは）100から200ヘクトパスカル（; 1ヘクトパスカル〜0.015 PSI HPA）;の間で設定する必要があります高い噴射圧は、注射の成功率や品質を改善しないと、マイクロインジェクションピペットチップのサイズやDNAの純度で他の問題を示している可能性があります。 0.3秒とピペットチップ内に培養液から粒子を吸蔵エントリを避けるために一定の正圧を供給する30 hPaの、、の補償の圧力 （PC）の注射の持続時間 （TI）を使用する必要があります。 </li><li>顕微鏡のXY軸ステージの制御を使用してマイクロインジェクションピペットの先端の下に注入されるニューロンを配置します。 Tの間の前後に着目して核の中心部に上記ピペットの先端を合わせます彼は先端および核小体。 </li><li>注入ボタンを（マイクロマニピュレータ上）を押して、核を注入する。射出工程では、マイクロインジェクションピペットおよびcDNA溶液の放出の動きは、マニピュレータによって制御されます。それは、目で成功した核内注射を確認することは困難ですが、比較的低粘度のcDNA溶液の注入（粘性原子力環境と比較して）は、多くの場合、位相差光学系の下に白い噴煙として表示され、注入の指標として用いることができる核内へ。時には、マイクロインジェクションピペットには核膜を貫通していないと、単に核をnudges。同じ位置での目の注射の試みは、核へのDNAの成功注入につながる可能性があります。細胞の腫脹は、通常、意図的でない細胞質注入を示している。また、重要な核の腫脹はよくすぐにその後の細胞死における神経細胞と通常の結果によって容認されていない、したがって、射出圧力および持続時間は、推奨値を超えないようにしてください。 </li><li>マイクロインジェクションピペットの下に次のニューロンを揃えるために顕微鏡のステージを再配置することによって神経細胞を注入し続ける。体系的に一晩インキュベーションインキュベーターにニューロンの皿を返す前に約50の核を注入するために料理をナビゲート。が正常に注入された神経細胞は、レポーター遺伝子の発現により翌日識別することができます。 </li></ol> III。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：上頸神経節（SCG）ニューロン。 ニューロンのSCGの位相コントラスト画像3時間後に解離（A）。この段階で、核はマイクロインジェクションピペットチップの配置を支援する目的を明確に表示されます。核は、単一の（左）または複数（右）暗い核小体を持つニューロンの中央に表示されます。 核（B）へのcDNA EGFPの注射を、次のニューロン16時間をSCG。左、位相コントラスト照明下で観察ニューロンをSCG。右、成功注入を示すと、一つのニューロンにEGFPの発現を生じる同じニューロンの落射蛍光像。 白いスケールバーは20μmである。 <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="図2" border="0" /> 図2：電流の全細胞記録異種発現したG -蛋白質を通じて、SCG神経細胞からK +（GIRK）チャンネルを整流内側に結合。 GIRK電流（I GIRK）は -140〜-60 mVの保持電位から+40 mV〜200ミリ秒の電圧ランプ（の挿入図）ノルエピネフリンによる内因性α2 -アドレナリン受容体の以下の活性化（NE、10μM）によって誘発された。スーパーインポーズのトレースは、同じニューロンからの録音であると示す前に（黒）とNE単独で（青）またはNEプラスの10mMのBa 2 +（赤）のどちらかの適用後。破線は、ゼロ電流レベルを示している。 私GIRK、含まれている外部の溶液（mMで）130のNaCl、5.4 KClを、10 HEPES、10のCaCl 2、0.8のMgCl 2、15グルコース、15ショ糖、および0.0003 TTXを記録するため、NaOHでpH7.4に調整。のMgCl 2、10 HEPES、4 MgATP、および0.3のNa 2 GTPのCaCl 2、2（mMで）135のKCl、11 EGTA、1が含まれている内部のレコーディングソリューションは、KOHでpH7.2に調整する。 現在の不足がuninjected SCGニューロンでNEの存在下で電圧ランプにより誘発される（）SCGニューロンは内因性のGIRKチャネルを発現していないことを示しています。 NE（B、左）にさらされるとプラスミドをコードするcDNAの成功注入機能GIRKチャネル11は、電圧ランプの間に大電流を生じさせる。 Gタンパク質共役受容体アゴニスト（NE）、内向き整流、および推定されるGIRKチャネルブロッカーによる電流のブロックは、Ba 2 +（B、右の赤のトレース）による活性化：電流がGIRKチャネルを流れる電流の典型的な特徴を持っている。オープンと黒丸は、私はそれぞれ、保持とピーク電流でGIRK表しています。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">ここをクリックして</a>図2の拡大バージョンを参照すること。

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<li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li>
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<li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4%2C+the+two+subunits+of+the+KACh+channel%2C+using+functional+homomeric+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li>
</ol>

一般的な問題が発生したため、提案： 前述したように、成功した核注射は組織培養プレートに接着細胞を持つに依存します。注射の開始を延期する細胞解離の手順に従って、数時間は、神経細胞が皿の底に付着することができます。加えて、高分子量ポリ- L -リジン（シグマ、セントルイス、MO）皿の底面にニューロンのエイズの付着の0.1 mg / mlのあるコーティングの料理。 マイクロインジェクションピペットの閉塞は、DNAの高濃度を注入しようとする場合は特に、頻繁に問題になる可能性があります。プラスミドDNAを単離精製する高品質の分離カラムを使用して、と説明した追加の精製の手順を実行する（スピンフィルター、ヘマトクリット管で回転する）前に注入するの微粒子を除去することができます。注射時には、圧力インジェクタの&quot;クリーン&quot;機能が（0.2秒で十分です）を使用できますが、それでも問題が解決しない場合は、新しいインジェクションピペットを使用する必要があります。マイクロインジェクションピペットの大半は注射セッション中に目詰まりした場合、大きな開口部にマイクロインジェクションピペットチップを生成するためにガラスのピペットプラーの設定を変更することを検討。 核の注入時に発生するもう1つの問題は、組織培養皿の底面の凹凸です。この変動は、直接注射時のピペットを通過するが固定されている深さ以来核にインジェクションピペットチップのターゲティング精度に影響を与えます。したがって、このz軸の制限が同じ皿内注射の過程で調整する必要があります。核注入の兆候（核または細胞には白色噴煙が完全に失われていない）がないもの、または注入ピペットの先端に近いセルを​​圧縮する皿の底（に来る：調整が必要なときにそれは明らかであろうまたは偶数）皿の底にピペットチップをクラッシュ。ガラスクローニングシリンダー（外径10ミリメートル、カタログ番号2090から01010、Bellcoガラス、ヴァインランド、ニュージャージー州）より小さく、より狭い場所でそれらを制限するニューロンのメッキ時に使用することができるので移動させるのに必要な距離を最小限に抑える注射の間に注入ピペット。これらのクローニングシリンダーはmicroinjectionsを実行する前に削除されます。 手法の欠点： 核内microinjectionsは、技術的にオペレータによって忍耐と手先の器用さの高い学位を必要とする、要求している。この手法の能力は、他のスキルと同じように、練習が付属しています。したがって、実際の実験を試みる前に、単独でレポーター遺伝子の核内注射を練習することをお勧めします。さらに注入プロセスを支援するために、それはコンピュータプログラムにマイクロマニピュレータと圧力インジェクタの手順を統合することも可能です。このようなイゴールプロ（WaveMetrics社、オレゴン州レイクオスウィーゴ）などのプログラムはのための6,7,8を参照してマイクロインジェクションの設定を保存すると（注入プロセスを半自動化する多機能コントローラ（ShuttlePro、輪郭のデザイン、ウィンダム、NH）をプログラムするために利用することができます。詳細）。 核マイクロインジェクション法のもう一つの欠点は、低い成功率です。試行された核注射の約10〜20％はタンパク質発現につながる。 、この効率性が発現する細胞の多数を必要としないアプリケーションのための十分な可能性がある例のための電気生理学をしながら、様々な生化学的アッセイのためにこれが十分でない可能性があります。 技術のアプリケーション： その欠点にもかかわらず、DNAの核内マイクロインジェクションは、異種神経細胞でタンパク質を発現させるために非常に有用な技術である。 タンパク質発現の高レベルがあるため注射時の核、遺伝子の転写を調節する非常にアクティブなCMVプロモーター、および核内のプラスミドの長期安定性に放出されたプラスミドの多数の核microinjectionsで達成されています。 - 過剰発現タンパク質は、異種タンパク質の高レベルの内因性タンパク質を圧倒するために必要なドミナントネガティブの実験では特に便利です。核内注射のもう一つの利点は、複数の構成要素が注入されると核へのcDNA構築物の一貫性のある割合を提供する能力です。他のトランスフェクション法と、それは再現性よく同じ皿の中とトランスフェクションの間に別の細胞にそれぞれのDNA構築物の同比率を導入することが困難です。核へのcDNA溶液の直接注入は、変動のこのソースを排除し、発現したタンパク質の比率が効果的に滴定することができます。 従来のトランスフェクション法では低いため核9へのDNAの取り込みとreagトランスフェクションに関連付けられている化学物質の毒性の有糸分裂後の細胞に限られた有効性を持っているents 10。核microinjectionsは核内に機械的に遺伝物質を導入することにより、これらの問題を克服する。この手法はより複雑であるが、機能的な生物学的システムにおけるタンパク質の影響を研究する能力は、このテクニックの骨の折れる性質を補うよりも、内因性シグナル伝達経路で完了します。 動物のすべての実験手順は、動物実験のための健康のガイドラインの国立研究所に従って行った。

<table><tbody><tr><td>Ultrafree-MC フィルターユニット</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Durapore PVDF フィルター、孔径 0.1 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>TE バッファー</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>マイクロヘマトクリット毛細管</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>非ヘパリン処理済み。調製法：&lt;br/&gt;100% エタノールに一晩浸漬する。脱イオン水で3回十分に洗浄し、オーブン（95&amp;#x00B0;C）でガラスを乾燥させる。洗浄済みのヘマトクリット管をダイヤモンドカッターで 3-4 cm の長さに切り、ピンセットでガラスを保持しながら、片端を火炎で封止する。きれいなガラスビーカーに入れ、蓋をして埃の蓄積を防いで保管する。</td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>固定角ローターまたはスイングバケットローター付き</td></tr><tr><td>Microloader 20 &amp;mu;l ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション用毛細管ガラス</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>フィラメント付き薄壁、外径 1.2 mm、内径 0.9 mm、長さ 100 mm</td></tr><tr><td>火炎式/Brown マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>白金イリジウムボックスフィラメント付き（部品番号 FB330B）</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD 倒立顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>20x および 40x 位相差対比対物レンズ、除振台に設置</td></tr><tr><td>電荷結合素子 (CCD) カメラ</td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>ビデオモニター</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>白黒、9&amp;#8221; スクリーン</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーターシステム</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションユニット</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションコントローラー</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>プログラマブル・マルチメディアコントローラー</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Version 4.05A</td><td>S. Ikeda により作成されたマイクロインジェクションコントローラー制御用コマンドプログラム</td></tr></tbody></table>

解離成体哺乳類の神経細胞へのdnaの核内マイクロインジェクション

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

初代神経細胞培養は、不死化細胞株に比べてより多くの生物学的に関連するシステムを表すため、蛋白質機能を研究する貴重なツールです。しかし、一次ニューロンの有糸分裂後の性質は、例えば、エレクトロまたは化学的媒介トランスフェクションなどの一般的な手順を使用して効果的な異種タンパク質の発現を防ぐことができます。従って、他の技術が効果的にこれらの非分裂細胞中のタンパク質を発現させるために採用されている必要があります。 この記事では、解離大人の交感神経ニューロンへのcDNA構築物の核内注射を行うために必要な手順を説明します。神経細胞の種類に適用されているこの技術は、正常に異種タンパク質の発現を誘導することができる。マイクロインジェクションの手順に不可欠な装置は、細胞、N 2（g）の圧力の配信システムに接続されているcDNA溶液で満たされたガラスの注入ピペット、およびマイクロマニピュレータを視覚化する倒立顕微鏡が含まれています。マニピュレータは、ピペットの先端からcDNA溶液を排出するために加圧N 2の短いパルスをマイクロインジェクションピペットの注入の動きを調整します。 この手法は、他の多くのトランスフェクション法に関連する毒性を持ち、一貫性のある比率で発現する複数のDNA構築物を有効にしていません。注入された細胞の数が少ないとよくそのような電気生理学的記録および光イメージングのような単一細胞の研究に適したマイクロインジェクションの手順を行いますが、細胞と高いトランスフェクション効率の大きい数を必要とする生化学的アッセイに理想的な場合があります。核内microinjectionsは機器と時間の投資が必要ですが、生理学的に適切な環境での異種タンパク質の高レベル発現を達成する能力は、この手法をタンパク質の機能を調査するために非常に有用なツールになります。

cDNAの直接核内注入は、有糸分裂後の細胞のための効果的なトランスフェクションの手法です。このメソッドは、単一または複数のcDNA構築物から異種タンパク質の発現の高いレベルを提供し、単一細胞アッセイの様々な生理学的に適切な環境で検討するタンパク質の機能を有効にします。

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

初代神経細胞培養は、...と比較して生物学的に妥当性の高い系であるため、タンパク質の機能を研究するための有用なツールとなります。

この注入手順の最初のステップとして、DNA溶液を作業濃度に調製し、遠心分離して沈殿させます。次に、ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブで作製した粒子状物質注入用ピペットに、DNA溶液を満たします。細胞を顕微鏡ステージに配置し、細胞核の可視化を最適化します。ピペットを核に合わせ、細胞に注入します。翌日、各ディッシュで複数の細胞に注入を行います。注入に成功した細胞は、レポーター遺伝子の発現によって識別されます。こんにちは。私は国立衛生研究所（NIH）国立アルコール乱用・アルコール依存症研究所のStephen Akeda博士の研究室のVan Muです。同じくAkeda研究室のDamien Williamsです。そして、AKEDA研究室のEugene runです。本日は、解離ニューロンへのCDNA構築物のINTERCLEARマイクロインジェクションの手順をご紹介します。これは、従来はトランスフェクションが困難であったポストミトーティック細胞において、目的タンパク質を異種発現させるための有効な手法です。当研究室ではこの技術を用いて、NチャネルのGタンパク質変調の根底にあるメカニズムを研究しています。それでは、暗い歯（dark teeth）を準備しましょう。まず、0.1 mg/mLの高分子量ポリL-リシンでコーティングした細胞培養皿に、解離させた成体哺乳類ニューロンを播種します。これにより、ニューロンの皿底面への接着が促進されます。ガラス製クローニングシリンダーを使用すると、播種したニューロンをより狭い限定的な領域に濃縮させることができます。これにより、注入対象となるニューロン間の距離を最小限に抑えることが可能です。核内マイクロインジェクションを行う前に、細胞がディッシュの底面に十分に接着するよう、37 °Cのインキュベーター内で3〜6時間静置してください。ニューロンをインキュベートしている間に、Sutter P 97 フレーミングブラウン・プラーと薄壁ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを用いて、マイクロインジェクション用ピペットを作製します。1回目のプルおよび2回目のプルに対して、以下の設定による2段階のプルプログラムを使用します。必要な設定は、ガラスのバッチやプラー内の加熱フィラメントの状態によって異なるため、必要に応じて調整してください。注入セッション中にピペットが破損したり、問題が発生したりする場合に備え、ニューロン1ディッシュにつき少なくとも5本の注入用ピペットを製作しておく必要があります。製作した注入用ピペットは、注入直前にマイクロインジェクションピペットのチップに埃が入るのを防ぐため、蓋付きの容器に保存してください。プラスミドcDNAをワーキング濃度まで希釈します。作業台の上に小さなパラフィルムを置き、剥離紙を剥がします。CD NAストック溶液とTEバッファーをparamに添加します。CD NAを希釈する場合、最終的なCDNA濃度を200 nanograms per microliter未満とし、全量を2～10 microlitersにすることを推奨します。CD NAによってコードされるタンパク質にタグが付いていない場合は、例えばEGFPをコードするレポータープラスミドを、実験用のCD NAと共注入することができます。注入と発現が成功したことを確認するため、ピペッティングで数回吸い上げと吐き出しを繰り返し、perfil上でCD NNA溶液を混合してください。cDNA溶液中の粒子が後のマイクロインジェクションピペットを詰まらせる可能性があるため、気泡が入らないように注意して沈殿させます。マイクロローダーピペットチップを使用して、洗浄し、片端を切断して火炎密封したヘマトクリット管に溶液を移します。次に、ヘマトクリット管を1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに入れ、15 to 30分間遠心分離します。室温で10,000 gで遠心分離します。遠心分離が完了したら、cDNA注入溶液の入ったチューブを置いておきます。この溶液は、注入操作中の1〜2時間は室温で保存可能です。細胞を播種した後、ガラス製クローニングシリンダーを取り除きます。その後、注入セッションまでの残りの培養期間の間、播種した細胞をインキュベーターに戻します。注入を開始するには、まず、インキュベーターからニューロンを播種したディッシュを取り出し、注入装置の顕微鏡ステージ上に置きます。装置は、倒立位相差顕微鏡、マイクロマニピュレーターに接続された圧力注入器、およびビデオモニタリングシステムで構成されています。位相差観察下では、ニューロンは球状の細胞として現れ、中心にある暗い膜を持つ円形のオルガネラとして核が明確に観察され、単一または複数の核小体が含まれている場合があります。マイクロローダー用ピペットチップを用いて、ヘマトクリット管から調製済みのCD NAを2 µL吸い上げます。粒子が沈殿している可能性があるチューブ底部の溶液を避けるように注意してください。溶液をマイクロインジェクションピペットに移します。マイクロインジェクションピペット内のフィラメントが、溶液をチップ先端まで引き上げる助けとなります。しかし、小さな気泡が残っている場合は、ガラスの側面を軽く叩いて気泡を取り除き、プレッシャーインジェクターのキャピラリーホルダーが45度の角度で固定されていることを確認します。次に、マイクロインジェクション用ピペットをキャピラリーホルダーに挿入し、ホルダーをマイクロマニピュレーターに固定します。続いて、マイクロマニピュレーターを用いてマイクロインジェクション用ピペットをディッシュ内に降ろします。ピペットが培地に進入すると、メニスカスが形成されて標本を通過する光の経路が変化するため、ニューロンの画像品質が低下します。この問題を解消するため、ニューロンの核がはっきりと見えるまで位相リングを調整します。注入を開始する前に、圧力注入システムのクリーニング機能を使用して、ピペット内のゴミを除去し、マイクロインジェクションピペットの品質を確認してください。排出された溶液が画面上で確認できるはずです。この機能を使用すると、最適サイズのピペットチップから液体が細い流れとして排出されます。マイクロインジェクションピペットが詰まっているか、あるいは細すぎる場合は、クリーニング機能を使用しても液体が排出されません。チップが広すぎたり、破損していたりする場合、液体が広い流れとなってチップから排出されます。注入中にチップの状態が最適でないと思われる場合は、注入用ピペットを交換してください。次に、ビューイングモニターでマイクロインジェクションピペットを中央に合わせます。核に焦点を合わせたまま、ピペットの先端がニューロンに隣接して焦点が合うまで、先端を下げてください。この位置をマイクロマニピュレーターのZ軸の下限として設定します。この位置は、注入時にマイクロインジェクションピペットが進む深さとなります。次に、先端をこの点から約30 µm上の位置に移動させます。これで、マイクロインジェクション用ピペットがニューロンの上部に到達しました。次に、マイクロインジェクションを行うためのマイクロマニピュレーターの設定をプログラムします。細胞へのダメージを最小限に抑えるため、Einarマイクロマニピュレーターの注入モード（inject mode）をONに、刺入機能（impale function）をOFFに設定してください。マイクロインジェクションの際、アキシャルモードを選択して対角線上の注入経路を指定します。注入速度を 300 micrometers per second に設定し、リミットでの圧力上昇を同期させます。次のプログラムへ進みます。プレッシャーインジェクターの設定で、注入圧力（PI）を100〜200 hPa、注入時間（ti）を0.3秒、補正圧力（PC）を30 hPaに設定します。マニピュレーターの設定調整後、核内注入が可能になります。顕微鏡のXY軸ステージ制御を用いて、マイクロインジェクションピペットの先端の下にニューロンを配置します。ピペットの先端と核の間のフォーカスを上下に調整し、先端を核の中心に合わせて配置します。マイクロマニピュレーターの注入ボタンを押し、核に注入します。比較的低粘度の物質を注入します。cDNA溶液は、位相差顕微鏡で観察すると、核内に白い煙状に見えることがよくあります。顕微鏡ステージを移動させて次のニューロンをマイクロインジェクションピペットの直下に合わせ、ニューロンへの注入を続けてください。ディッシュ内を系統的に移動します。引き続き核への注入を行います。マイクロインジェクションピペットの品質を確認するため、10〜15回の注入ごとに、前述のクリーン機能を使用してください。ピペットが詰まったか破損している場合は、新しい注入用ピペットに交換してください。組織培養皿の底面の不均一性により、注入ピペットが細胞を外したり、核内の白いプルーム（煙状の拡散）が見えなくなったりすることがあります。このような場合は、マイクロインジェクションピペットの先端を核と同じ焦点面に合わせ、それを新しいx軸の制限として設定してください。その後、ニューロンへの注入を続けます。マイクロインジェクションピペットが核膜を貫通せず、単に核を押し出すだけの場合があります。その場合は、同じ位置で再度注入を試みることで、核内へのDNA注入に成功することがあります。細胞の膨潤は、通常、意図しない細胞質への注入を示しています。50個から100個の核への注入が完了したら、ニューロンのディッシュをインキュベーターに戻し、一晩培養します。16時間後、レポーター遺伝子の発現によって、注入に成功したニューロンを特定することができます。本手法では、1つの上頸神経節（SCG）ニューロンに注入が行われており、EGFPの発現によって同定可能です。内因性のGタンパク質共役内向き整流カリウム（grk）チャネルを持たない非注入のSCGニューロンでは、電圧ランプ印加時に測定可能な電流は発生しません。対照的に、機能的なgrkチャネルをコードするプラスミドDNAの注入に成功したニューロンに、Gタンパク質共役受容体アゴニストであるノルエピネフリンを投与すると、電圧ランプ印加時に大きな電流が発生します。ここで測定された電流はKirチャネルに典型的であり、ノルエピネフリンによる活性化、内向き整流性、および推定されるgrkチャネル遮断薬による抑制を特徴としています。バリウムについて、ニューロンの核にcDNAを注入する方法を説明しました。この手法を実施する際は、4つの重要な点に注意してください。1つ目は、注入前にDNAを遠心分離させるため。2つ目は、核がはっきりと見えることを確認するため。3つ目は、ディッシュ内を移動する際にZ軸の制限を再調整するためです。そして4つ目に、インジェクションの合間にPepTipの品質を定期的に確認することです。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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学ぶ解離成体哺乳類神経細胞へのcDNA核内マイクロインジェクション法。分裂後細胞への高効率トランスフェクション技術で、タンパク質機能を生理学的環境で研究可能にする。

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

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