のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいRFPレポーターショウジョウバエ

新規のトランスジェニックIRFPリポーターショウジョウバエ系統は、眼の成虫原基における特定の細胞で赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現します。このトランスジェニック系統は、発達中の眼における特定の細胞種の同定、摘出、および標識に有用です。眼の成虫原基を摘出するために、遊走期3齢幼虫をスパチュラを用いてバイアルの側面から取り出します。

次に、幼虫をシルガードディッシュ上のPBSの一滴の中に置きます。ピンセットを使用して、眼原盤が付着した口器を幼虫の体から切り離します。その後、眼原盤をスライドグラスに移動させ、口器および脳から解剖により分離します。こんにちは、キングス・カレッジ・ロンドンのウルフソン加齢疾患センター、ジョセフ・ベイトマン研究室のアムナ・コールです。

本日は、ショウジョウバエ（Drosophila）から眼原基を摘出する手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて神経発生に関与する遺伝子の研究を行っています。それでは始めていきましょう。

眼原基ディスクの解剖を開始するために、Sylgardコーティングを施したシャーレの上にPBSを1滴落とします。解剖顕微鏡下で作業を行う際、Sylgardコーティングは解剖中にピンセットが損傷するのを防ぐのに役立ちます。次に、スパチュラを使用して、3齢幼虫を1匹取り出し、PBSの滴の中に置きます。両手にピンセットを持ち、一方のピンセットで幼虫の後端から3分の2あたりの位置を掴みます。もう一方のピンセットを使用して、幼虫の前端にある暗色の口器を保持します。

ピンセットを互いに離すように動かし、幼虫をゆっくりと引き離します。口器は、眼脳複合体が付着した状態で体の他の部分から離れます。次に、スライドグラスの上にPBSを1滴滴下し、口器を持ってディスクをそのPBSの滴へと移動させます。

眼の成虫原基のみがRFPを発現しているため、実体顕微鏡を蛍光モードに切り替えます。これにより、球状の視葉に重なる赤色蛍光組織として眼の成虫原基を容易に識別でき、コントラストを高めることができます。光ファイバー式冷光照明をスライドに対して斜角から照射します。眼の成虫原基は、後方では視神経柄を介して視葉に、前方では触角原基から伸びる柄を介して口器に付着しています。

眼の成像円盤を解剖するには、1組のピンセットで組織を固定し、もう1組のピンセットを用いて眼の成像円盤を幼虫の脳から切り離します。次に、眼の成像円盤を口器から分離します。口器を眼の成像円盤から切り離した後、口器をスライドから取り除きます。

眼原基円盤は、スライドガラス上に平らに配置され、脳組織などの不要な組織が付着していない状態である必要があります。残りの眼原基円盤の解剖を続けてください。すべての眼原基円盤の解剖が完了したら、スライドガラスをゆっくりと傾け、少量のペーパータオルを使用して余分なPBSを拭き取ります。

次に、Vector Shield封入剤を1滴加え、カバーグラスをそっと上に被せます。これで、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡によるディスクの観察準備が完了しました。後で観察を行う場合は、スライドを4°Cで保存してください。

RFPは少なくとも1年間は可視状態で維持されます。Zスタック画像を取得する場合は、共焦点顕微鏡またはZeiss AxiCaze顕微鏡を用い、20倍または40倍の対物レンズを使用して1 µm間隔で撮影してください。その後、顕微鏡ソフトウェアを用いて投影画像を生成できます。IRFPを発現するショウジョウバエから成虫盤を摘出し、Phalloidinで染色しました。その後、Zeiss AxiCaze顕微鏡を用い、20倍レンズを使用して1 µm間隔でイメージングを行いました。RFPを発現している眼盤の細胞が赤色で示されています。

形態形成溝はfoid染色によって可視化され、緑色で示されています。眼 discs の背腹極は湾曲しており、折りたたまれる傾向があります。これらの部分は最終的な投影画像から除外することができます。

眼原基は単層上皮ですが、核の位置が変動するため、全体像を把握するにはZシリーズ投影が必要です。IRFPレポーターは核に局在しているため、ここで見られるパターンはRFPの核内発現を表しています。以上で、ドロソフィラから幼虫の眼原基を解剖する方法について説明しました。

この手順を実施する際は、精細ピンセットを使用することをお勧めします。また、作業中はコーヒーなどの飲み物を控えるのが賢明でしょう。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。