Name: のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいRFPレポーターショウジョウバエ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学ぶショウジョウバエの眼成虫原基の解剖法とRFPレポーターによる細胞可視化技術。この手法は神経発生と眼発生研究において特定細胞型の同定と標識に有用である。

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この作品は、ロンドン大学キングスカレッジと王立協会によって資金を供給された。

<ol&gt;<li&gt;まず場所解剖顕微鏡下Sylgard皿にPBSのドロップ。</li&gt;<li&gt;次のスパチュラを用いてバイアルやボトルからいくつかの放浪三齢幼虫を除去し、PBS中に置いてください。</li&gt;<li&gt;解剖は、幼虫の後部に向かって3分の2を把握してから前方端に濃い色の口のフックを保持するために他のペアを使用する（あなたは右利きの場合）左手のピンセットを使用開始する。</li&gt;<li&gt;今すぐ静かに互いから離れてピンセットの両方のペアを移動して離れて幼虫を引き出します。口器は、添付の目/脳、複雑で体の他の部分から離れて来る必要があります。</li&gt;<li&gt;氷上で30-45分のための4％パラホルムアルデヒド/ PBS溶液に配置することにより、この時点でディスクを固定する免疫蛍光のために目のディスクを染色する。その後、PBSTでディスクを4回洗浄し、適切な抗体として染色。</li&gt;<li&gt;直接スライドに目のディスクを分析するのが最も簡単です。スライド上でPBSのドロップを配置し、口器を持って、PBSのドロップにディスクを移動します。</li&gt;<li&gt;成虫の組織は、半透明と目のディスクが識別するのが難しいので、最初です。それは容易に蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使ってそれらを識別するように。アイ- RFPレポーターラインを使用して目のディスクは、明らかに球状の光のローブ（図1）オーバーレイの赤色蛍光組織として見ることができます。</li&gt;<li&gt;これがディスクをより大きなコントラストを与えるように、スライドに対して斜めの角度で光を導く光ファイバ冷光源を使用している場合。アイ/触角ディスクは、後部で眼茎を経由して光のローブにして前方で触角ディスクからの茎を経由して口器に接続されています。</li&gt;<li&gt;目のディスクは、ピンセットのペアを1つ使用して口器を保持解剖し、幼虫脳から目のディスクを分離するために他のペアを使用するには。次の口器から目のディスクを切り離す。最後に平らにカバースリップを防ぐことができますこれらのようにスライドから口器を削除します。</li&gt;<li&gt;あなたが解剖したときにすべての目のディスクが軽くスライドを傾けて、余分なPBSをふいて乾かす。その後Vectashieldのドロップを追加し、軽く上にカバースリップを配置。</li&gt;<li&gt;ディスクには、今落射蛍光または共焦点顕微鏡（図2）のいずれかの方法でイメージを作成する準備が整いました。</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt;代表的な結果</p&gt;<p class="jove_content"&gt;正しく解剖すると眼/触角ディスクは、脳などの余分な組織の明確なスライド上に平らになるように置いてください。目のディスクの背側と腹側のポールを湾曲し、そのフォールドする傾向があるが、これは共焦点顕微鏡のZシリーズを取り、投影からこれらのセクションを省略することで回避することができますされています。ディスクは、単層上皮であるが、原子核の変数の位置は、ディスクの全体像を得るためにZシリーズの投影が必要です。共焦点顕微鏡で撮影した代表的な目- RFPの眼/触角ディスクの突起を図2に示されています。我々は通常、20倍または40倍レンズを使用してディスクを介して1μm以下のセクションを取る。アイ- RFPのレポーターは、ローカライズされた核であり、したがって、図2に見られるパターンは、RFPを発現する細胞の核を表しています。</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt;図1。目RFP三齢ショウジョウバエの幼虫から目/脳、複雑なの初期の解剖。</strong&gt;眼/触角成虫原基は（概説）口器（MP）に接続されていると脳の視葉を（OL）オーバーレイ見ることができます。画像は、目のディスクでのRFPの発現を示す蛍光解剖顕微鏡を用いて撮影された。前方は左にあります。スケールバー：300μmである。</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt;図2。目成虫原基の眼- RFPのレポーターの発現。</strongRFPの発現（赤）を示す目RFPの幼虫から解剖&gt;三齢の眼（ED）/触角ディスク（AD）。ディスクは、ファロイジン（緑色）で染色し、その染色頂端細胞の表面と形態形成の溝（矢印）を示していた。 RFPは、光受容体1,6,7と錐体細胞で、MFの周り前駆細胞に発現している。前方は左にあります。スケールバー：25μmである。</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

ショウジョウバエの眼成虫のディスクの解離は簡単ですが、マスターに時間がかかることがあります。重要なステップは、離れて幼虫脳から目のディスクとその解剖の同定です。目のディスクの識別は、眼- RFPのラインは、ここで説明を使用して容易になります。実行可​​能な変更は、触角ディスクまたはperipodial膜を除去する、または脳に入るPRの軸索を可視化するために接続されている視葉を残すことです。 アイ- RFPのラインは、predをH -スティンガーエンハンサー-レポーターベクター3に尖ったP2遺伝子 2の第2イントロンからクローニング小説眼特異的エンハンサー要素によって生成され、トランスジェニックハエを作成するには、このを使用していました。アイ- RFPのレポーターは、PRSの特定のサブセットにと錐体細胞（図2。）で表される。したがって、目的の遺伝子が、これらの細胞型で発現しているかどうかを判断するために使用することができます。アイ- RFPの行では、リクエストで利用可能です。 </...

のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいrfpレポーターショウジョウバエ</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

市販<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;目には神経発生、シグナル伝達と神経変性などの分野を研究するための強力なモデルシステムです。このシステムを使用して行ったの発見の多くは発展途上の目成虫原基における視細胞分化の時空間的性質の利用しています。このシステムを使用するには、それは目のディスクを識別し、解剖することを学ぶために研究者のためにまず必要です。私たちは、目のディスクと発展途上眼内の特定の細胞型の可視化の同定に役立つように新たなRFPのレポーターを説明します。我々は詳細三齢幼虫から目成虫原基の解離のための方法論を、目をRFPのレポーターはこの解剖に役立てることができる方法について説明します。この目- RFPのレポーターは、目で表され、信号の増幅を必要とせずに生きている組織、あるいは固定後、蛍光顕微鏡を用いて可視化することができます。我々はまた、このレポーターが目のディスク内の特定のセルのタイプを識別するために使用できる方法を示します。このプロトコルと目RFPレポーターの使用は、使用して研究者を支援します<em&gt;ショウジョウバエ</em根本的に重要な生物学的な問題に対処するために&gt;目。

我々は、特異的に発現される新規の赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターの説明<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;目。私たちは、細部目成虫原基の解離のための方法論をどのようにこの記者は、解剖、発展途上の目で特定の細胞型の同定を支援するために使用することができます。

のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいRFPレポーターショウジョウバエ</em

ショウジョウバエの眼は、神経発生、信号伝達、神経変性などの領域を研究するための強力なモデルシステムである。多くの発見が……

新規のトランスジェニックIRFPリポーターショウジョウバエ系統は、眼の成虫原基における特定の細胞で赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現します。このトランスジェニック系統は、発達中の眼における特定の細胞種の同定、摘出、および標識に有用です。眼の成虫原基を摘出するために、遊走期3齢幼虫をスパチュラを用いてバイアルの側面から取り出します。次に、幼虫をシルガードディッシュ上のPBSの一滴の中に置きます。ピンセットを使用して、眼原盤が付着した口器を幼虫の体から切り離します。その後、眼原盤をスライドグラスに移動させ、口器および脳から解剖により分離します。こんにちは、キングス・カレッジ・ロンドンのウルフソン加齢疾患センター、ジョセフ・ベイトマン研究室のアムナ・コールです。本日は、ショウジョウバエ（Drosophila）から眼原基を摘出する手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて神経発生に関与する遺伝子の研究を行っています。それでは始めていきましょう。眼原基ディスクの解剖を開始するために、Sylgardコーティングを施したシャーレの上にPBSを1滴落とします。解剖顕微鏡下で作業を行う際、Sylgardコーティングは解剖中にピンセットが損傷するのを防ぐのに役立ちます。次に、スパチュラを使用して、3齢幼虫を1匹取り出し、PBSの滴の中に置きます。両手にピンセットを持ち、一方のピンセットで幼虫の後端から3分の2あたりの位置を掴みます。もう一方のピンセットを使用して、幼虫の前端にある暗色の口器を保持します。ピンセットを互いに離すように動かし、幼虫をゆっくりと引き離します。口器は、眼脳複合体が付着した状態で体の他の部分から離れます。次に、スライドグラスの上にPBSを1滴滴下し、口器を持ってディスクをそのPBSの滴へと移動させます。眼の成虫原基のみがRFPを発現しているため、実体顕微鏡を蛍光モードに切り替えます。これにより、球状の視葉に重なる赤色蛍光組織として眼の成虫原基を容易に識別でき、コントラストを高めることができます。光ファイバー式冷光照明をスライドに対して斜角から照射します。眼の成虫原基は、後方では視神経柄を介して視葉に、前方では触角原基から伸びる柄を介して口器に付着しています。眼の成像円盤を解剖するには、1組のピンセットで組織を固定し、もう1組のピンセットを用いて眼の成像円盤を幼虫の脳から切り離します。次に、眼の成像円盤を口器から分離します。口器を眼の成像円盤から切り離した後、口器をスライドから取り除きます。眼原基円盤は、スライドガラス上に平らに配置され、脳組織などの不要な組織が付着していない状態である必要があります。残りの眼原基円盤の解剖を続けてください。すべての眼原基円盤の解剖が完了したら、スライドガラスをゆっくりと傾け、少量のペーパータオルを使用して余分なPBSを拭き取ります。次に、Vector Shield封入剤を1滴加え、カバーグラスをそっと上に被せます。これで、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡によるディスクの観察準備が完了しました。後で観察を行う場合は、スライドを4°Cで保存してください。RFPは少なくとも1年間は可視状態で維持されます。Zスタック画像を取得する場合は、共焦点顕微鏡またはZeiss AxiCaze顕微鏡を用い、20倍または40倍の対物レンズを使用して1 µm間隔で撮影してください。その後、顕微鏡ソフトウェアを用いて投影画像を生成できます。IRFPを発現するショウジョウバエから成虫盤を摘出し、Phalloidinで染色しました。その後、Zeiss AxiCaze顕微鏡を用い、20倍レンズを使用して1 µm間隔でイメージングを行いました。RFPを発現している眼盤の細胞が赤色で示されています。形態形成溝はfoid染色によって可視化され、緑色で示されています。眼 discs の背腹極は湾曲しており、折りたたまれる傾向があります。これらの部分は最終的な投影画像から除外することができます。眼原基は単層上皮ですが、核の位置が変動するため、全体像を把握するにはZシリーズ投影が必要です。IRFPレポーターは核に局在しているため、ここで見られるパターンはRFPの核内発現を表しています。以上で、ドロソフィラから幼虫の眼原基を解剖する方法について説明しました。この手順を実施する際は、精細ピンセットを使用することをお勧めします。また、作業中はコーヒーなどの飲み物を控えるのが賢明でしょう。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

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生物学

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ソース: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp.

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