の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管
2009年12月21日
我々は、固定、包埋、切片、および後期のイメージングのためのプロセスについて説明ショウジョウバエ胎児心臓の管のTrasmission電子顕微鏡のための胚。この手法は、心臓の管の内腔の可視化だけでなく、線心の内腔を基底膜、が可能になります。
このビデオでは、ショウジョウバエの胚カートで透過型電子顕微鏡(TEM)を行う方法を説明しています。心臓は、細胞の移動、細胞の接着、細胞の形状変化を研究するための貴重なモデルシステムとして浮上しています。この技術により、心臓の内腔形状だけでなく、細胞膜、細胞細胞接合部、基底膜などの超微細構造成分を可視化することができます。
この手順を開始するために、ショウジョウバエの胚の透過型電子顕微鏡法に適した固定溶液を調製します。次に、被覆胚の0〜20時間のコレクションを固定溶液に入れる。終了したら、胚を固定液から取り出し、両面テープに貼り付けた状態で手軽に使用します。
緩衝液を含むシャーレでは、脱イオン胚が緩衝液中に浮遊し、ピペットで回収されます。その後、胚は接尾辞となり、脱水勾配を受けます。樹脂を浸透させると、包埋型に移され、そこで整列されます。
出来上がったブロックをダイヤモンドナイフでカットします。切片は銅板でピックアップされ、染色され、検査されます。こんにちは、ニュージャージー医科歯科大学ロバートウッドジョンソン医科大学の病理学および臨床検査医学科のSunita Kramer研究室のNadine Lopです。
ラージ・パテルです。私もPON病理学の電子顕微鏡学者です。本日は、透過型電子顕微鏡用のoph胚を調製し、イメージングする手順をご紹介します。
当研究室では、この手順を用いてショウジョウバエの心臓の形態形成を研究しています。それでは始めましょう。さっそく始めましょう。
ショウジョウバエの胚を取り扱う前に、胚固定のヘプタン浸透法のための固定液を新たに調製してください。ヒュームフードで、ケイトバッファーに12.5%のグルタルアルデヒドを含む作りたての溶液を2ミリリットルピペットでガラスシンチレーションバイアルに入れます。8ミリリットルのADAヘプタンを加え、激しく振る。
その後、1 分待ちます。2つの相を分離させることで、上相には、固定液であるグルタルアルデヒドで飽和したADAヘプタンが含まれています。上相をきれいなバイアルにピペットで入れ、脇に置きます 0時間から20時間の胚を採取するには、取り外し可能なメッシュインサート付きの小さなバスケットである胚採取チャンバーを使用します。
まず、胚が入ったグレープジュースプレートを取り出し、死んだハエを取り除きます。次に、水と絵筆を使用します。グレープジュースプレートから胚をほぐし、水の入った四角いボトルを使用して胚収集チャンバーに胚を移します。
グレープジュースプレートから余分な酵母の胚を洗い流します。胚を50%漂白剤溶液に2〜3分間浸すか、胚が表面に浮くまで浸すことにより、外側のコリオン膜を取り除きます。蒸留水で十分にすすぎ、ペーパータオルで胚を洗い流します。
鉗子を使用して、メッシュインサートを手に取り、コーティングされた胚で覆われているはずです。インサートを固定液にセットし、胚がメッシュから落下することを確認します。胚を摂氏4度で1時間半固定し、軌道ロッカーで混合します。
インキュベーションが終了したら、固定剤をできるだけ少なくして、両面テープで裏打ちされたペトリ皿に胚を入れます。皿を振って胚を単層に広げ、次に化学フードに入れてヘプタンを蒸発させます。胚が乾燥したら、0.1%tween hand de vizeを含むバッファーで胚を覆います。
鈍いタングステン針を用いた解剖顕微鏡下での後期16胚。サイジングされた胚は浮遊し、牧草地のピペットで胚を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移すことができます。胚を0.1モルケート緩衝液で洗い流し、次いで室温で1時間四酸化オスミウムに後置する。
インキュベーション後、胚をケイトバッファーですすいでください。もう一度、エタノールとアセトンのグレードシリーズで胚を脱水します。50%エタノールで10分間、次に70%エタノールで10分間、次に90%アセトンで10分間脱水し、最後に100%アセトンステップでそれぞれ10分間脱水します。
アセトンを取り除きます。浸透プロセスを開始するには、einスプレー樹脂とアセトンの1対1の混合物を追加します。サンプルが真空圧下にあり、マイクロ波で3分間下にあることを確認します。
さらに5分間真空圧を維持します。樹脂アセトン混合物を100%樹脂と交換し、再度真空圧下でマイクロ波加熱します。圧力下で樹脂とマイクロ波を交換します。
合計 3 つの潜入ステップの最終的な時間。マイクロフュージチューブから胚をシリコーン包埋型に移します。胚の後端が型の先細りの端と揃うように、胚を列に整列させます。
ベーコンは一晩で摂氏70度のオーブンです。次に、結果のブロックをセクショニング用に削除します。ミクロトームを使用して、1マイクロメートルの切片を胚に切り込みます。
ブロックを切片にして胚に到達したら、ループを使用して1つの切片をスライドガラス上に移動し、視覚化する前に心臓を視覚化するための適切な深さが達成されたかどうかを判断します。ホットプレート上の切片を短時間加熱し、最初にスライドに一滴加えて切片をメチレンブルーで染色します。そして、短時間加熱します。
再度、脱イオン水ですすぎ、顕微鏡で目的の切片切片の深さで切片を検査します。心臓の内腔は、スペースの制約を満たすために、光学顕微鏡で認識できる必要があります。ブロックを再トリミングして、胚の心臓を示す断面に最大5つの胚を含めます。
ミクロトームを使用して90ナノメートルの切片を切断します。銅線グリッド上の複数のセクションをピックアップします。グリッドを3%アルアセテートで10分間染色し、蒸留水で3回すすぎます。
次に、水酸化ナトリウムペレットを含むチャンバー内でグリッドをクエン酸鉛で2分半染色し、二酸化炭素を含まない環境を作り出します。インキュベーション後、蒸留水で3回すすいでください。80キロボルトの電子顕微鏡で切片を調べ、CCDカメラで撮影します。
切片の深さと病期分類が適切に行われたかどうかを判断するためには、背側正中線の2つのカーディオブラストの間に成熟した心臓内腔が形成されていることが明らかになり、細胞膜が無傷であるかどうかを判断し、心臓内腔に細胞外マトリックスが存在するかどうかを調べ、クリスティとミトコンドリアの存在を探します。そこで、ショウジョウバエの胚の心臓の超構造を決定する方法を紹介しました。この手順を実行する場合。
ショウジョウバエの胚を適切にステージングし、樹脂の成分を正確に測定してよく混合することを忘れないことが重要です。だから、見てくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。
概要
この記事では、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて後期のショウジョウバエ胚の固定、埋め込み、断面化、および画像化のための詳細なプロトコルについて説明します。この技術により、心臓管腔と関連する基底膜の可視化が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- ショウジョウバエ胚は心臓形成の研究モデルとして役立ちます。
- 透過型電子顕微鏡は細胞構造の高解像度画像を提供します。
- 胚性心臓管は細胞の移動と接着の理解に重要です。
- 適切な固定と埋め込みは超微細構造の詳細を保存するために不可欠です。
研究目的
- TEMのためのショウジョウバエ胚の準備のための信頼性の高い方法を開発すること。
- 胚性心臓の構造要素を可視化すること。
- 細胞レベルでの心臓発達の理解を深めること。
使用方法
- 固定液の調製と胚の収集。
- 脱水後の樹脂による胚の埋め込み。
- マイクロトームを用いた埋め込んだブロックの断面化。
- 銅グリッド上での切片の染色と画像化。
主な結果
- 心臓腔と基底膜の成功した可視化。
- 細胞接合部と膜の詳細な画像化。
- プロトコルは心臓形成の研究において再現可能な結果を可能にします。
- ヘプタン透過法の有効性を示しました。
結論
- 開発されたプロトコルはショウジョウバエの心臓発達を研究する研究者にとって貴重なツールです。
- 透過型電子顕微鏡は細胞構造に関する洞察を提供します。
- 今後の研究では、この方法を基に胚発生の他の側面を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Transmission electron microscopy (TEM) of Drosophila embryonic heart tubes enables high-resolution visualization of cellular structures critical for understanding morphogenesis, cell migration, and adhesion. This workflow addresses the challenge of imaging subcellular features in small, developmentally dynamic tissues, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. Reliable ultrastructural data from this model system inform mechanistic de-risking and portfolio triage in cardiovascular and developmental biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cell-cell junctions and basement membrane for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular architecture during morphogenesis.
- Provides high-resolution evidence for pathway interrogation and hypothesis testing.
- Facilitates triage of candidate targets based on structural integrity and developmental phenotypes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological reference standards for downstream imaging assays.
- Improves reproducibility and standardization of ultrastructural readouts across experiments.
- Enables quantitative assessment of lumen formation and membrane features for assay development.
- Supports screening readiness by confirming model system fidelity at the cellular level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns model system findings with disease-relevant structural biomarkers in preclinical research.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to translational validation of morphogenetic processes.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming mechanistic hypotheses in a genetically tractable system.
Pipeline & Workflow Integration
This TEM-based workflow integrates into the early discovery continuum, bridging target validation and preclinical model development for cardiovascular and developmental programs.
- Discovery Biology: Provides ultrastructural evidence for hypothesis testing and pathway clarification in morphogenesis studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of lumen size, membrane integrity, and junctional architecture for comparative analysis.
- Translational Research: Connects model system findings to preclinical biomarker alignment when structural endpoints are relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging capability for diverse developmental and disease-relevant systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes fixation, embedding, and imaging protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy and developmental model handling.
- Demands access to TEM instrumentation and sample preparation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of fixation and sectioning protocols.
- May require adaptation for different developmental stages or model organisms.
- Dependent on precise staging and accurate reagent preparation for optimal results.
