の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

このビデオでは、ショウジョウバエ胚の心臓における透過電子顕微鏡法（TEM）の実施方法について解説します。心臓は、細胞移動、細胞間接着、および細胞形態の変化を研究するための有用なモデル系として注目されています。この技術を用いることで、心腔の形状に加えて、細胞膜、細胞間接合、基底膜などの超微細構造を視覚化することが可能です。

この手順を開始するために、ショウジョウバエ胚の透過電子顕微鏡観察に適した固定液を調製します。次に、0時間から20時間まで収集しコーティングした胚を固定液に入れます。完了後、胚を固定液から取り出し、両面テープに貼り付けて扱いやすくします。

脱イオン水バッファーを含むペトリ皿の中で、胚をバッファー中に浮遊させ、ピペットで回収します。その後、胚を後固定し、脱水勾配に供します。樹脂で浸透させた後、包埋型に転移させて配列させます。

得られたブロックをダイヤモンドナイフで切断します。切片を銅製グリッドに回収し、染色して観察します。こんにちは、私はニュージャージー医科歯科大学ロバート・ウッド・ジョンソン医学部、病理学・臨床検査医学研究科のSunita Kramer研究室のNadine Lopです。

ラジ・パテルです。PON病理学の電子顕微鏡専門員を務めています。本日は、透過電子顕微鏡（TEM）用にoph胚を調製し、観察するための手順をご紹介します。

当研究室では、ショウジョウバエの心臓形態形成を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。

ショウジョウバエの胚を取り扱う前に、胚固定のヘプタン透過法に使用する固定液を調製します。ドラフトチャンバー内で、Cate緩衝液を用いた12.5%グルタルアルデヒド新鮮調製溶液 2 mLをガラス製シンチレーションバイアルにピペットで加えます。ここにADAヘプタン 8 mLを加え、激しく振とうします。

その後、1分間待ちます。2つの相を分離させると、上層にグルタルアルデヒドで飽和させたADAヘプタンが含まれており、これが固定液となります。上層をピペットで清潔なバイアルに移し、脇に置いておきます。0時間から20時間の胚を回収するには、取り外し可能なメッシュインサートが付いた小型バスケットである胚回収チャンバーを使用します。

まず、胚が入ったグレープジュースプレートを取り出し、死んでいるハエを除去します。次に、水と筆を用いて、グレープジュースプレートから胚を剥離させ、水を入れたスクイズボトルを用いて胚収集チャンバーに胚を移します。

ブドウジュースプレートから胚を取り出し、余分な酵母を洗い流します。胚を50%漂白剤溶液に2〜3分間、または胚が表面に浮き上がるまで浸し、外側の卵膜を除去します。蒸留水で十分にすすぎ、ペーパータオル上で胚の水気を切ります。

ピンセットを使用して、コーティングされた胚が付着しているはずのメッシュインサートを取り出します。インサートを固定液に入れ、胚をメッシュから脱落させます。オービタルロッカーで攪拌しながら、4 °Cで1時間30分間、胚を固定します。

インキュベーションが完了したら、固定液をできるだけ取り除きながら、両面テープを貼ったペトリ皿に胚を移します。皿を振って胚を単層に広げ、ケミカルフード内に置いてヘプタンを蒸発させます。胚が乾燥したら、0.1% tween hand de vizeを含むバッファーで胚を覆います。

解剖顕微鏡下で、鈍端のタングステン針を用いてステージ16後期の胚を操作します。分離した胚は浮遊するため、パスツールピペットで回収し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。胚を0.1 MのCAC緩衝液でリンスし、その後、1%オスミウムテトラオキサイドを用いて室温で1時間後固定します。

インキュベーション後、胚をCateバッファーで洗浄します。再度、エタノールとアセトンの段階的な系列を用いて胚を脱水します。まず50% ethanolで10分間、次に70% Ethanolで10分間処理し、続いて90% acetoneで10分間脱水し、最後に100% acetoneで10分ずつ段階的に処理します。

アセトンを除去します。樹脂スプレーとアセトンを1:1の割合で混合した液を加え、浸透処理を開始します。試料が真空圧力下にあることを確認し、3分間マイクロ波照射を行います。

さらに5分間、真空圧を維持します。樹脂とアセトンの混合液を100%の樹脂に交換し、再び真空圧下でマイクロ波照射を行います。樹脂を交換し、加圧下でマイクロ波照射を行います。

合計3回の浸透ステップとして、最後に一度行います。胚をマイクロ遠心チューブからシリコン埋め込みモールドに移します。胚の後端がモールドのテーパー状の端に沿うように、胚を一列に整列させます。

ベーコンを70 °Cのオーブンで一晩加熱します。その後、得られたブロックを取り出して切片作成を行います。ミクロトームを用いて、胚を1 µmの厚さに切断します。

ブロックを切削し、胚に到達したら、ループを用いて切片を1枚ガラススライドに移動させ、可視化の前に心臓を観察するための適切な深さに達しているかを確認します。ホットプレートで切片を短時間加熱し、まずスライドにメチレンブルーを1滴加えてから、再び短時間加熱して切片を染色します。

再度、脱イオン水で洗浄し、希望の切断深度で顕微鏡下で切片を確認します。スペースの制約を満たすため、光学顕微鏡で心腔が認識できる必要があります。胚心が見える胚を横断面で最大5個まで含むように、ブロックを再度トリミングします。

ミクロトームを用いて90 nanometerの厚さで薄切します。銅製グリッド上に複数の切片を採取します。グリッドを3%al acetateで10分間染色し、その後、蒸留水で3回洗浄します。

次に、二酸化炭素のない環境を作るため、水酸化ナトリウムペレットを入れたチャンバー内で、グリッドをクエン酸鉛で2分30秒間染色します。インキュベーション後、蒸留水で3回洗浄します。電子顕微鏡を用いて80 kilovoltsで切片を観察し、CCDカメラで撮影します。

セクショニングの深さとステージングが適切に行われたかを確認するために、背側正中線の2つの心臓芽の間に、成熟した心腔が形成されていることが明確である必要があります。細胞膜が完全であるかを確認するには、心腔内に細胞外マトリックスが存在するかを調べ、クリステおよびミトコンドリアの有無を確認してください。以上で、ショウジョウバエ胚心臓の超微構造を決定する方法を説明しました。この手順を行う際は、

ショウジョウバエの胚を適切にステージ分けすること、およびレジンの成分を正確に計量し、十分に混合することを忘れないでください。それでは、ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。