光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

多光子蛍光。光退色手順後の回復は、蛍光色素分子の自由に拡散するサンプルで簡単に実証できます。まず、低強度のレーザービームをサンプルに送り込み、レーザーの焦点体積内のD分子から参照レベルの蛍光を生成します。

次に、焦点ボリューム内の色素分子の一部を光退色するために、短時間の高強度レーザーフラッシュが送られます。最後に、レーザービームは以前の低強度レベルまで減衰され、光漂白された分子が外側に拡散し、焦点ボリュームの外側からの静止した蛍光分子に置き換えられるときに蛍光が監視されます。得られた蛍光を時間曲線の関数として解析し、拡散係数を算出します。

こんにちは、ロチェスター大学生物医学工学科のエドワード・ブラウン研究室のケリー・サリバンです。本日は、光退色後の多光子蛍光回収の方法をご紹介します。私たちの研究室では、この技術を用いて、in vitroおよびin vivoの生体システムにおける拡散を研究しています。

それでは始めましょう。開始するには、目的のレーザー波長を設定し、光電子増倍管またはPMTの前に適切なフィルターを挿入します。次に、PCALセルの損傷を避けるために、レーザー出力を200ミリワット以下に調整します。

pcalセルの上流に4の字に向けられた2つのミラーがあります。これらのミラーは、レーザービームをPCALセルに位置合わせするために必要かつ十分です。pcalセルバイアスコントローラーの電圧オフセットをゼロに設定し、レーザーがフロントウィンドウとバックウィンドウの中央に来るようにpcalセルを通るレーザーパスを調整します。

図 4 の上流のミラーを使用してビームを前面の窓の中央に配置し、図 4 の下流のミラーを使用してビームを背面の窓の中央に配置します。次に、pcalセルクリスタルの両端の電圧を最大値に設定します。適切な値は波長に依存し、pcal細胞の取扱説明書に記載されています。

pcalセルからの出力電力が最大になるまで、pcalセルの上流にある図4のミラーを調整します。次に、水晶の両端の電圧をゼロに切り替え、バイアスコントローラーの電圧オフセットを調整して、PCALセルからの出力電力を最小限に抑えます。PCAL細胞に入射するレーザー出力を実験に必要な値に戻します。

次に、顕微鏡に移り、標準化された蛍光サンプルに視覚的に焦点を合わせます。ここでは、固定蛍光花粉粒を使用しています。焦点を合わせたら、顕微鏡を密閉し、PCALセル結晶の両端の電圧を変更して、レーザー出力をサンプルのイメージングに適したレベルに調整します。

最後に、ライトをオフにし、PMTをオンにします.標準化されたサンプルの繰り返し画像スキャンを開始し、サンプルの鮮明な画像が得られるまで、pcalセルの下流のミラーを調整します。次に、サンプル内の人々の焦点に安全なモニターの力を決定する方法を見てみましょう。

このビデオでは、スライドガラスのくぼみ内に保持され、カバースリップで覆われた水性染料のサンプルを使用します。レーザーを低出力で減衰させますが、サンプル内で蛍光を生成するための妥当な出力にします。顕微鏡を密閉し、PMTからの出力をフォトンカウンターに迂回させます。

ライトを消し、PMTをオンにして、顕微鏡ソフトウェアでポイントスキャンを開始します。フォトンカウンターを、予想される蛍光回復時間よりもはるかに長いタイムスケールで積分するように設定し、妥当な数のデータポイントを記録します。パワーを上げて、別の一連のフォトンカウントデータを取得します。

フォトン数の増加が大幅に減少したように見えるまで、パワーを増やし続けます。パワー増加プロットに関しては、フォトンの対数はパワーの対数の関数としてカウントされます。2の傾きからのずれは、漂白を示しています。

モニター中は、このカットオフを下回る適切なモニター電力を選択します。次に、マルチチャンネルスケーラーとパルスジェネレーターへの入力パラメーターを決定しましょう。パルス発生器で。

ティーチング前の時間を予想半分の回復時間の1〜2倍に設定し、漂白剤の時間をスケーラーの予想される半分の回復時間の10分の1に設定します。ビン幅を漂白剤期間の約 2 分の 1 に設定し、選択したビン幅とレコードあたりのビン数の積が予想される全回復時間よりも大きくなるように、レコードあたりのビン数を設定します。さらに、プレブル時間とブリーチタイムはパルスジェネレータに戻り、プレブルとブリーチシーケンスの周波数を、ビン幅とレコードあたりのビン数を掛けた積の逆数よりもちょうど小さい値に設定します。

最後に、選択したモニター電力での信号強度に基づいて、スケーラーでのスキャンあたりのレコード数を設定します。次に、モニターの電力を安全なレベルに設定し、漂白剤の電力を、モニターの漂白テスト中に決定される漂白カットオフより約200ミリワット上に設定します。これらの電力は両方とも、アルセルクリスタルシールの両端に異なる電圧として設定され、顕微鏡はライトをオフにします。

PMTをオンにします。イメージング・ソフトウェアでポイント・スキャンを開始します。次に、パルス発生器とスケーラーを始動します。

結果の回復曲線を分析するには、3つの重要なポイントをマークします。プレブル蛍光、漂白剤直後の蛍光、およびデータセットの最後に蛍光。漂白剤の前後の蛍光値を使用して、半減回復時間をより正確に推定します。

次に、前の手順で概説したルールを使用して、プレブル漂白剤の値を更新し、幅の期間を開始します。新しいカーブを取り、結果のカーブが強い漂白剤とスムーズな回復を示すまで、パラメーターの微調整を続けます。漂白剤の深さパラメータの対数を電力の対数の関数としてプロットすることにより、励起飽和度を確認します。

傾きが2からずれている場合は、励起飽和を示します。強力な漂白剤を生成するが、飽和を引き起こさない漂白剤の力を選択してください。最後に、適切なパラメータを決定したら、目的のサンプルの光退色またはMP FP曲線の後に、多光子蛍光回収を続けます。

次に、ティールにフィットした正規化されたMP Fラップ曲線での生のMP Fラップデータ、拡散係数、生のMP F frapデータが示す、強力な漂白剤、およびスムーズな回復の両方で、生のMP frapデータの代表的な結果を示します。データの後半については、データに適合するように完全な回復が報告されます。まず、回復を平均プレブル蛍光に正規化し、次に非線形リース二乗近似を実行します。

適切なモデルに関して。どちらのデータセットもフルオレセイン水溶液で採取し、拡散係数を算出しました。文献と一致して、光退色実験後に多光子蛍光回復を行う方法を示しました。

この手順を実行する際には、実験パラメータ、特に漂白期間、漂白およびモニタリング能力をプロトコルで定義された安全限界に設定することが重要です。だから、見てくれてありがとう、そしてあなたの実験に頑張ってください。