Name: 光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶ 多光子蛍光回復法による拡散係数測定の手法。レーザー光路調整と蛍光回復曲線のフィッティングで、蛍光色素分子の動的挙動を定量的に解析し、生物学的分子相互作用の理解に貢献します。

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この作業はホープScholarの賞の防衛時代の部（第W81XWH - 05から0396まで）とエドワードB.ブラウンIIIに医歯薬学総合研究賞のPewの学者によって賄われていた。

1。光学系の位置を合わせます。 MP - FRAP実験のための重要な設備は、次のとおりです。モード同期レーザ光源、ポッケルスセル（光変調用）、パルスジェネレータ、ダイクロイック、対物レンズ、蛍光発光フィルター、ゲート光電子増倍管、およびデータ記録システム（光子計数器をとマルチチャンネルスケーラ）。 2。安全モニターの電源を決定します。 <ol><li>サンプル内で蛍光を生成するための、低い、しかし合理的なパワーにレーザーを減衰させる。 </li><li>サンプル内にフォーカス。 </li><li>はるかに長い予想される蛍光の回復よりも時間スケールを介して統合するフォトンカウンタを設定します。焦点体積が試料内の固定された（私達の顕微鏡のソフトウェアでこれはポイントスキャンによって達成される）と、フォトンカウントデータの合理的な数を記録。 </li><li>電力を増加させると光子のカウントデータの別のシリーズを取る。フォトンカウントの増加が電力の増加を基準にして大幅に減少すると表示されるまで繰り返します。 </li><li>ログ（電力）の関数としてプロットログ（光子計数）。二つの傾きからの偏差は、モニター中に漂白示します。お使いのモニタの電源として、以下のこのカットオフですが、これはノイズ比に対する合理的な信号を可能にする電源を選択してください。 </li></ol> 3。パルス発生器とマルチチャンネルスケーラに入力パラメータを決定する。 <ol><li>拡散係数と回復時間の文献に基づいて、及び/またはStokes - Einsteinの方程式および拡散方程式の一般向けのエンベロープの推定値を決定する。 </li><li>パルス発生器とスケーラ上で必要なパラメータ値を設定します。 <ol class="lalpha"><li>パルスジェネレータでは、事前に漂白剤や漂白剤回数を設定します。経験則の良いセットは、事前に漂白剤が予想される半分の回復時間に比べ1-2倍大きくなるはず、と漂白時間は十分の一、期待半分の回復時間でなければならないということです。 </li><li>スケーラーで、約半分漂白剤の持続時間にビンの幅を設定し、記録ごとのビンの数を設定して、選択されたビンの幅と、レコードごとのビンの製品がより大きいか、予想される完全な回復に加えて、事前にほぼ等しくなるように - 漂白剤や漂白剤の回。 </li><li>パルス発生器に戻ると、ビンの幅の倍の製品レコードあたりのビンの数の逆数よりちょうど小さい値に等しいpre-bleach/bleach/monitorシーケンスの頻度を設定します。 * </li><li>最後に、レコード数を設定/選択したモニターの電源での信号強度に基づいて、スケーラーにスキャン。 *これは、パルス発生器で設定した完全なpre-bleach/bleach/monitorシーケンス（1/frequency）のための時間は、スケーラに設定されたデータ収集時間（ビン幅×ビン/記録）を超えていることを非常に重要です。この基準が満たされていない場合は、複数の漂白剤のトリガーは、スケーラの単一のレコード内に表示されることがあります。 </li></ol></li><li>以前に決定された許容レベルにモニターの電源を設定します。モニター漂白テスト中に決定される漂白カット上記で200mW程度に漂白剤のパワーを設定します。これらの力は、PCの結晶間の異なる電圧などのセットの両方があります。 </li><li>顕微鏡をシール、ライトを遮断し、PMTをオンにして、パルスジェネレータとスケーラを開始する、顕微鏡のソフトウェア上のポイントのスキャンを開始します。 </li><li> 1）事前に漂白剤蛍光、2）蛍光直後の漂白剤、およびデータセットの最後に3）蛍光：曲線をプロットし、3つの重要なポイントをマークすることで、その結果回復曲線を分析する。蛍光値を使用して前と直後の漂白剤よりハーフリカバリ時間を推定する。 </li><li>ハーフ回復時間のこの見積もりで、新しいプレ漂白剤、漂白剤の値、およびビンの幅の期間を決定する前に概説した親指のルールを使用してください。また、より完全な回復を達成するために必要な時間を見積もるために、データセットの最後にプリ漂白剤蛍光と蛍光を使用してください。経験則として、データはデータの後半のために報告されるように完全な回復を可能にする期間のために収集する必要があります。 </li><li>あなたのカーブが強い漂白剤とスムーズな回復を示すまで、パルスジェネレータとスケーラ上でパラメータを調整、パラメータを新しいカーブを取り、調整を続ける。可能であれば、漂白剤の持続時間ができることに留意してください、そして、親指のルールの下に小さくする必要があります。浅すぎる、または深すぎる、漂白剤が達成されている場合は漂白剤のパワーをも調整することができます。 </li></ol> 4。励起の飽和のためのテスト。 <ol><li>以前に決定された適切なモニターと漂白剤の力を、使用して、MP - FRAP曲線の一連を取る。適切な数学的形態と非線形最小二乗フィッティングアルゴリズム（以下、"データ解析"を参照）を使用して、事前に漂白剤蛍光に対して正規化各回復を、分析する。漂白剤の深さのパラメータの近似値を記録します。</li><li>漂白剤のパワーの値を増加させることMP - FRAPカーブの連続するシリーズを取り、分析を続行。 </li><li>ログ（電力）の関数としてプロットログ（漂白剤の深さのパラメータ）。二つの斜面から逸脱すると、励起の飽和を示している。強力な漂白剤が得られるが、飽和が発生しない漂白パワーを選択してください。 </li></ol> 5。 MP - FRAP曲線の服用を続け。 <ol><li>上記のように、すべてのパラメータが正しく設定される、曲線の服用を続け。 </li></ol> 6。データ解析。 <ol><li>蛍光データから事前に漂白剤や漂白剤、データなど時間のデータを設定し、調整を取り外しますその直後の漂白剤蛍光値はt = 0に対応。 </li><li>平均的なプレ漂白剤蛍光に関して生じる蛍光の回復を正規化する。 </li><li>適切な数学モデルやMATLABなどのlsqcurvefitは関数として非線形、最小二乗フィッティングアルゴリズムを使用して、正規化曲線をフィット。ここで紹介するモデルは、拡散と対流の影響を受けて蛍光回復を占めている。 <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="方程式" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="式"> F oは事前に漂白剤の平均蛍光ここで、βは、漂白剤の深さのパラメータである、τDは特徴的な拡散性の回復時間は、Rは半径方向（W R）幅の軸方向の二乗の比率（w Z）です。二光子焦点ボリューム、τVX = W R / V X、τVY = W R / V Y、τVZ = W のz / V Z、およびV 2 = V × 2 + V Y 2 + V Z 2である対流の速度。結像面に限局フローの場合、τVZ→∞と1 /τVX + 1 /τVYは、1 /τVRに置き換えることができます。対流がない場合には、分子の両方の指数が1に移動し、式が大幅にのみ2つのフィッティングパラメータ、β、τ、Dに、低減されます。拡散係数は、簡単にD = W R 2 /8τDとして計算されます。 </li></ol> 7。代表的な結果。 <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1代表的な漂白剤とFITC - BSAのための回復曲線。良好な回復曲線は、データの後半のために報告されている完全な回復での蛍光で、強力な漂白剤とスムーズな回復を示す。 <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。FITC - BSA（赤）と関連付けられている最小二乗フィット（黒）のための正規化された回復曲線。このフィットは、文献と一致52.9 UM2 / sの拡散係数を、もたらします。

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li>
</ol>

光退色後の多光子蛍光回復の力は、3次元分解能で厚さのサンプルを調査する能力にあります。 1990年代の開発以来、MP - FRAPは細胞体、 生体外で厚い組織切片、 および in vivo組織と間質への拡散係数を（または類似のトランスポートパラメータ）を決定するために使用されています。この記事では、MP - FRAP実験、ならびに、実験パラメータの設定データを取得し、回復曲線を分析する、ビームのパスを整列させるための適切な手順を実行するために必要な機器を発表した。 適切な励起波長と発光フィルターの選択肢は2つの光子断面積と放射スペクトルによって導かれるべきである。この情報は頻繁に様々な染料のための技術データに含まれています。また、レーザービームの位置合わせで、それは客観のバックレンズの適切な過剰充填を達成することが重要です。これは、多くの場合、光学系にビームエキスパンダーを追加することによって実現されます。適切な過剰充填は、軸方向および半径方向の両方で、サブ解像度固定蛍光ビーズをスキャンして、プロットと文献値との比較のために1 ...

<table><tbody><tr><td>Ti:サファイアレーザー</td><td>Newport Corp.</td><td>Mai Tai</td><td></td></tr><tr><td>ポッケルスセル</td><td>Conoptics</td><td>350-80</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>ショートパスダイクロイックミラー</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>670 DCSX-2P</td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>フォトンカウンタ</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 400</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルスケーラ/アベレージャ</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 430</td><td></td></tr><tr><td>パルスジェネレータ</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG 535</td><td></td></tr><tr><td>FITC-BSA</td><td>Invitrogen</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

光退色後のマルチ蛍光回復は、高分子の拡散係数を（または類似のトランスポートパラメータ）を測定するために使用する顕微鏡技術である、との両方に適用することができます。<em&gt; in vitroで</em&gt;と<em&gt; in vivoで</em&gt;生物系。光退色後のマルチ蛍光回復は、ビームを減衰し、photobleached分子を置換するための関心のびまん性の領域の外側から、まだ、蛍光分子などの蛍光をモニターする、強力なレーザーフラッシュを使用して、蛍光試料内に関心領域を退色によって実行されます。我々は、ポッケルスセル（レーザー変調器）を介して、サンプルへのレーザースキャンボックスと対物レンズを介して光路に沿ってレーザービームを調整することで、私たちのデモを開始します。簡単にするために、我々は、水性蛍光色素のサンプルを使用します。私たちは、その後、適切な実験を含めて我々のサンプルのパラメータ、モニターや漂白力、漂白剤の持続時間、ビン幅（フォトンカウンティング用）、および蛍光回復時間を決定します。次に、我々は、回復曲線、主に強化されたスループットは、LabVIEW（ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）を経由して自動化できるプロセスをとるための手順を説明します。最後に、拡散係数は、MATLAB（Mathworks社、ネイティック、マサチューセッツ州）などのソフトウェアを使用して容易にプログラム可能な最小自乗法のアルゴリズムを使用して、適切な数学モデルにリカバリデータをフィッティングによって決定されます。

この記事では、光退色後の多光子蛍光の回復を使用して拡散係数を測定するための手順を説明します。我々は、サンプルへの光路に沿ってレーザーを合わせ、適切な実験パラメータを決定することによって開始されます、その後の生成を続行し、最終的にフィッティング蛍光回復曲線。

多色光退色後蛍光回復（multi-fluorescence recovery after photobleaching）は、拡散係数（または同様の輸送パラメータ）を測定するために用いられる顕微鏡技術であり、...

多光子蛍光退色後回復（FRAP）の手順は、自由に拡散する蛍光色素分子の試料を用いて容易に実証できます。まず、低強度のレーザービームを試料に照射し、レーザーの焦点体積内にあるD分子から基準となる蛍光レベルを生成させます。次に、短時間の高強度レーザーフラッシュを照射し、焦点体積内の染料分子の一部を光退色させます。最後に、レーザービームを前の低強度レベルまで減衰させ、光退色した分子が外側に拡散し、焦点体積外からまだ蛍光を持つ分子が補充される際の蛍光をモニターします。得られた時間関数としての蛍光曲線から、拡散係数を算出します。こんにちは、ロチェスター大学生物医学工学科のエドワード・ブラウン研究室のケリー・サリバンです。本日は、マルチフォトンの光退色後蛍光回復（FRAP）の実施方法について解説します。当研究室では、この手法を用いて、in vitroおよびin vivoの両方の生物学的システムにおける拡散の研究を行っています。それでは始めていきましょう。まず、希望するレーザー波長を設定し、光電子倍増管（PMT）の前面に適切なフィルターを挿入します。次に、pcalセルの損傷を防ぐため、レーザー出力を200 milliwatts以下に調整してください。pcalセルの上流に、4の字型に配置された2枚のミラーがあります。これらのミラーは、pcalセルを通過するレーザービームを調整するために必要かつ十分です。pcalセルバイアスコントローラーの電圧オフセットをゼロに設定し、レーザーが前面および背面ウィンドウの中心を通るようにpcalセル内のレーザー光路を調整してください。図4の上流にあるミラーを使用してビームをフロントウィンドウの中央に合わせ、図4の下流にあるミラーを使用してビームをバックウィンドウの中央に合わせます。次に、pcalセル結晶の両端にかける電圧を最大値に設定します。適切な値は波長によって異なり、pcalセルの取扱説明書で確認できます。pcalセルの上流にある図4のミラーを調整し、pcalセルからの出力パワーが最大になるようにします。次に、結晶にかかる電圧を0に切り替え、バイアスコントローラーの電圧オフセットを調整して、pcalセルからの出力パワーを最小限に抑えます。pcalセルに入射するレーザーパワーを、実験に必要な値に戻します。次に顕微鏡へ移り、標準的な蛍光サンプルを用いて適切に視覚的なフォーカスを合わせます。ここでは、固定した蛍光花粉粒を使用しています。フォーカスが完了したら、顕微鏡を密閉し、pcalセル結晶にかける電圧を変更して、サンプルのイメージングに適したレベルまでレーザー出力を調整します。最後に、照明を消してPMTの電源を入れます。標準サンプルの繰り返し画像スキャンを開始し、サンプルの鮮明な画像が得られるまで、pcalセルの下流にあるミラーを調整してください。それでは、サンプル内での焦点における安全なモニター出力の決定について見ていきましょう。本ビデオでは、ガラススライドのくぼみに保持され、カバーガラスで蓋をされた水溶性染料のサンプルを使用します。サンプルの蛍光を発生させるために、レーザーを低出力ながら適切な強度まで減衰させます。顕微鏡を密閉し、PMTからの出力をフォトンカウンターに切り替えます。照明を消し、PMTの電源を入れ、顕微鏡ソフトウェアでポイントスキャンを開始します。フォトンカウンタの設定を行い、予想される蛍光回復時間よりも十分長い時間スケールで積分させ、適切な数のデータポイントを記録します。出力を上げ、さらに一連のフォトンカウントデータを取得します。光子数の増加が著しく減少するように見えるまで、出力を上げ続けます。出力増加のプロット（電力の対数に対する光子数の対数の関数）において、傾きが2から逸脱した場合は、退色が起きていることを示します。モニタリング中、このカットオフ値を下回る適切なモニタ電力を選択してください。次に、マルチチャンネルスケーラーとパルスジェネレータへの入力パラメータを決定します。パルスジェネレータについて説明します。スケーラーのプリティーチ時間を予想される半回復時間の1～2倍に、ブリーチ時間を予想される半回復時間の10分の1に設定します。ビン幅をブリーチ時間の約半分に設定し、1レコードあたりのビン数を、選択したビン幅と1レコードあたりのビン数の積が予想される完全回復時間を上回るように設定します。プリブリーチ時間とブリーチ時間を加算し、パルスジェネレーターに戻り、プリブリーチおよびブリーチシーケンスの周波数を、ビン幅と1レコードあたりのビン数の積の逆数よりわずかに小さい値に設定します。最後に、選択したモニター出力での信号強度に基づいて、スケーラーのスキャンあたりのレコード数を設定します。次に、モニター出力を安全なレベルに設定し、漂白出力を、モニター漂白テストで決定した漂白カットオフより約200 milliwatts高い値に設定します。これらの出力は、いずれもALセル結晶シールの異なる電圧として設定され、顕微鏡の照明が消灯します。PMTの電源を入れます。イメージングソフトウェアでポイントスキャンを開始します。次に、パルスジェネレーターとスケーラーを始動させます。得られた回復曲線を解析するために、3つの重要な点をマークします。漂白前の蛍光強度、漂白直後の蛍光強度、およびデータセット終了時の蛍光強度です。漂白前と直後の蛍光値を用いることで、半回復時間をより正確に推定できます。次に、前のステップで概説したルールを使用して、preble bleachおよびbegin widthの持続時間の値を更新します。新しいカーブを作成し、得られるカーブが強い漂白（bleach）とスムーズな回復を示すまで、パラメータの微調整を続けます。漂白深さパラメータの対数をパワーの対数の関数としてプロットし、励起飽和を確認してください。傾きが2から外れた場合は、励起飽和を示しています。強力な漂白が得られ、かつ飽和を引き起こさない漂白出力を選択してください。最終的に、適切なパラメータが決定したら、目的のサンプルの多光子蛍光回復後漂白（MP FRAP）曲線の測定を継続します。次に、生のMP FRAPデータと、拡散係数を算出するためにフィッティングを行った正規化MP FRAP曲線の代表的な結果を示します。生のMP FRAPデータでは、強い退色とスムーズな回復が見られます。データに適合させるため、後半のデータを用いて完全回復を報告しています。まず、回復量を退色前の平均蛍光強度で正規化し、その後、非線形最小二乗法によるフィッティングを行います。適切なモデルに関して、両方のデータセットは水溶液中のフルオレセインで取得され、拡散係数が得られました。文献と一致しています。以上で、多光子蛍光回復後光漂白実験の実施方法について説明しました。この手順を行う際は、注意深く実験パラメータを設定することが重要です。特に、漂白時間、および漂白・モニタリングパワーを、プロトコルで定義された安全な範囲内に設定してください。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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