のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

ここでは、胚の回収手順について説明します。ショウジョウバエをバイアルから5口の回収チャンバーのチューブへ移します。次に、チャンバーの上にグレープ農業用プレートを載せ、数時間、ハエに産卵させます。

胚が適切な段階に達したら、絵筆を用いてグレープアゲートから両面テープに移動させます。次に、胚をコーンから転がし出し、腹側を下にしてアガーブロック上に並べます。中央に、長方形のワックスと両面テープが貼られたスライドが見えます。両面テープの一端を、胚が並んだブロックの上に反転させて重ね、胚に触れさせてスライドへ転写します。

これにより、胚はすぐに背面が上向きになります。ワックスの長方形で囲まれたスライド上の領域にPBSを加え、胚を覆います。上がスライドの側面図、下が上面図です。

ガラス製解剖針を用いて、卵膜に沿って切り込みを入れます。胚の脳領域を突き、胚を持ち上げて、ガラス板の上に列状に並べます。その後、各胚を解剖してフィレ状にします。

手順の最後に、ゼブラフィッシュ胚が列状に並んだスライドが完成します。これで固定準備が整いました。こんにちは。私はカリフォルニア工科大学生物学部門のKaizen研究室のポスドク、Peter Leeです。

こんにちは。私はKaizen研究室のCaltech大学院生、Ashley Wrightです。私はCaltechの教授であるKaizenです。私の研究グループでは、ショウジョウバエの神経系の発達に関する研究を行っています。本日は、生きたopal胚の解剖手順をご紹介します。

私たちは、これらの手法を用いてオーファン受容体のリガンド探索を行ってきました。具体的には、受容体融合タンパク質を用いて胚をライブ染色し、細胞表面タンパク質を過剰発現させた系統のコレクションをスクリーニングすることでこれを実施しています。また、研究室ではこの手順を胚の表現型の解析や遺伝学的スクリーニングにも利用しています。

私は、ガイダンス表現型における運動行為の欠損スクリーンを実施しました。それでは始めましょう。ピーターがその方法を実演します。

まず、スパチュラを用いて、胚回収チャンバーの各バレルに対応するグレープ農用卵回収プレート上に、酵母ペーストを少量ずつ配置します。次に、ショウジョウバエのバイアルに二酸化炭素ガスを注入して、ハエを麻酔させます。数百匹のハエを回収チャンバーに直接移します。

次に、卵採取プレートでチャンバーを覆い、押し付けます。20インチのラベルテープを用い、アガープレートの中央から始めてチャンバーとプレートを一緒に固定します。テープは卵採取プレート上で重なるようになります。ハエが覚醒した後、水平状態で暗所の室温にて2〜3時間インキュベートします。インキュベーション後、ハエを下に叩き落としてから、採取プレートを交換します。

取り出したプレートの各セクターに胚が100個未満である場合は、十分な数の胚が集まるまで2時間ごとの回収を継続してください。回収した胚は、付属の書面プロトコルの規定に従ってプールすることができます。

胚を成熟させるために、90 mmの円形フィルターペーパーを湿らせてペトリ皿の蓋に置き、その上に胚が入った回収プレートを逆さまに載せます。プレートを目的の期間および温度でインキュベートします。スライドガラスに両面テープを貼り、胚のステージングおよび選別用のスライドを準備します。次に、グレープアガーの長方形の塊をスライドガラスの上に載せます。

エガーは、10～15個の胚を10列から15列まで保持できる十分な大きさである必要があります。胚が目的の段階に達したら、インキュベーターから胚を取り出します。成熟した胚を回収プレートから両面テープに移動させます。

濡らした絵筆を使用して、胚をテープ上に均等に広げます。GFP解剖顕微鏡下でSOAR胚を観察し、ジェノタイプを示す適切なGFP発現を確認します。本実験では、バランサーcurly armのGFP発現が見られない胚を選択することでジェノタイピングを行います。

胚のジェノタイピングは使用するバランサーによって異なるため、詳細については付属の書面プロトコルを参照してください。次に、鈍端の解剖針を用い、胚を両面粘着テープの上で優しく転がして固定します。ステージ16では、腸は3つの帯状に分かれています。

その後、腸の尾端付近に斜めの帯状の構造が発達し始め、続いて巻曲が進むことで、胚の形態がより明確になります。次に、解剖針を用いて、各胚を絨毛膜または他の胚の上で転がします。テープに触れないように注意しながら胚を持ち上げ、グレープアガーのスラブへ移します。

コーティングした胚をこのスラブ上に並べ、背面をアガースラブに密着させ、後端を下に向けます。次に、濡れたフィルターペーパーを入れたペトリ皿にスライドを置き、目的の齢に達するまで室温で胚を培養します。解剖を行う場合は、小さな長方形に切った両面テープを用意し、生体解剖用のスライドを作成します。ワックスペンを使用して、Super Frost Plusスライドの一端付近にテープを貼付します。

テープの周囲に、スライドの幅と同じ幅で長さ30〜40 mmの長方形を描きます。ワックスとテープの間には約3 mmの間隔をあけてください。次に、スライドを反転させ、並べた胚の上にゆっくりと下ろしてテープを接触させ、胚をグレートプレートスラブからテープへと転写します。

胚は後端が下になるように配置します。移送後、胚はスライド上で背面が上を向いた状態になります。直ちに、インジェクションニードルのようにニードルプラーで作成したガラス解剖針を用いて、ワックスの矩形を満たすようにXPBSを胚の上に1滴加えます。胚の後端から背面正中線に沿って切開します。

次に、胚の前端をつつき、持ち上げます。下側から始めて、胚をバッファーに浸したまま、テープストリップの右側に移動させます。引き続き胚の解剖と移動を行い、agri slabの各列に対応するように、スライド上に胚を整然と並べます。

解剖針を使用して、体壁のフラップをスライド上にそっと押し下げます。この際、表面の組織を伸ばしたり、剥離したりしないように注意してください。針は、体壁の背側端にある前方および後方の隅にのみ接触させるようにします。

運動ニューロンの軸索はこの距離まで伸びていないためです。背側では、スライドの針に触れないようにしてください。すべての胚を転送し、スライドに固定した後に針が破損するためです。各胚の脳領域から腸を4箇所切断し、腸全体を胚から引き抜いて除去します。

後腸をスライドガラス上に押し出します。すべての解剖が完了したら、2本のパステールピペットを用い、室温の5% formaldehydeをワックス長方形の片角に注入すると同時に、反対側の角から溶液を除去します。この固定液の交換を計6 mLの総量を用いて3回繰り返します。

胚を固定液中で45分間インキュベートします。メニスカス（液面）が胚に触れると胚が破壊されるため、接触させないことが非常に重要です。パスツールピペットを使用して、固定液の大部分を除去します。

2本のパスツールピペットを用いた手法で、PBSで3回洗浄します。次に、胚を透過処理するためにPBTで3回洗浄します。この工程により、胚がメニスカスによる影響を受けにくくなります。

最終洗浄後、スライドを傾けて carefully にPBTを除去し、ワックスで囲まれた領域の端にKimwipeを軽く触れさせて余分な溶液を取り除きます。あらかじめ溶液を充填したピペットマンを使用して、直ちに200 µLのブロッキング溶液を加え、室温で10〜30分間ブロッキングします。その後、Kimwipeを用いてブロッキング溶液を拭き取ります。

その後、ブロッキング溶液で希釈した目的の一次抗体を200 µL直ちに加えます。スライドを加湿プレートに入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。本実験では、運動ニューロンの軸索を標識するためにモノクローナル抗体1D4を使用します。

翌日、ディッシュを4 °Cから取り出し、ロッキングプラットフォーム上でPBTを用いて胚を3回洗浄します。洗浄は1回につき少なくとも15分間行います。すべての洗浄ステップにおいて、ロッキング中にスライドが完全に浸る十分な量のPBTがあることを確認してください。胚の洗浄後、前述と同様にスライドをブロッキングします。

ブロッキング後、二次抗体およびブロッキング液 200 µLを直ちに加え、室温で2時間インキュベートします。ここでは、Alexa 488 goat anti-US二次抗体が使用されます。この二次抗体は、筋線維を標識するためにRhodamine Phinと併用します。その後、ロッキングプラットフォームを用いて、1回につき少なくとも15分間、PBTで3回洗浄します。

スライドを別のトレイに移し、残留した洗剤を除去します。次に、PBSで5分間、2回洗浄します。スライドをPBSから取り出し、ウェルに残っているPBSの大部分をキムワイプで取り除いた後、直ちに70% glycerolを500 microliters加えます。

グリセロールは胚と同じ屈折率を持つため、この工程を行うことで染色の視認性が向上します。胚を室温で2時間、または4°Cで一晩透明化させます。その後、キムワイプでグリセロールを除去します。グリセロールをほぼすべて除去すると胚は平坦になりますが、除去量を少なくすると、より立体的な構造が維持されます。

グリセロールを除去した後、1番のカバーガラスを載せます。これで胚のイメージング準備が整いました。解剖および染色された胚は、免疫蛍光顕微鏡で可視化できます。ここでは、解剖した胚を運動ニューロン軸索標識抗体1D4で染色しています。

この画像は、免疫蛍光法を用いた可視化にHRP免疫組織化学が使用された、より一般的に見られる画像と外観が似ています。運動神経軸索の分枝の詳細をより明確に確認できる、より高品質な画像を得ることが可能です。アクチンに結合するrho domine標識phinによる共染色を行うことで、筋肉を同時に可視化できます。

これにより、HRP染色で得られるよりも、筋肉の層構造と組織化をより明確に把握することができます。ここでは、運動ニューロンの軸索が緑色で、筋肉が赤色で示されています。以上で、変異体系統のコレクションから生きているショウジョウバエ胚を解剖する方法を実演しました。これらの手順を行う際は、lioやarmadillo-GFPなどの扱いやすいバランスストック系統から始め、一度に少数の系統のみで実施することが重要です。

解剖の技術に習熟し速度が上がれば、1日あたり最大10系統まで処理することができ、これにより200系統ほどの変異体コレクションを20日間ほどでスクリーニングすることが可能になります。したがって、すべての工程の実行に習熟すれば、これは非常に効率的な手順となります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。