Name: のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 学ぶショウジョウバエ胚のライブ解剖法による遺伝スクリーニング。フィレット標本作製で神経発生と発生生物学の研究を効率化し、高品質な蛍光イメージングを実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々はこれらのプロトコルの開発への貢献のためにニッキーフォックスとAloisiaシュミットに感謝。この作品は、KZ、NS28182にNIH RO1の助成金によって支えられている。

<ol><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatases+are+required+for+motor+axon+guidance+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo.</a> Cell. 84, 599-609 (1996).</li>
<li>Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+genetic+interactions+among+four+receptor+tyrosine+phosphatases+regulate+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila.</a> Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).</li>
<li>Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+RNAi%3A+a+method+for+evaluating+the+functions+of+gene+families+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila.</a> Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).</li>
<li>Fox, A. N., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heparan+sulfate+proteoglycan+syndecan+is+an+in+vivo+ligand+for+the+Drosophila+LAR+receptor+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase.</a> Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).</li>
</ol>

我々は、このビデオのデモは、それらが今容易にショウジョウバエの遺伝学と発生学のいくつかの経験を有する者により実行可能であることを十分に詳細で生きている胎児の解剖や染色のために我々の方法を表示していることを願っています。もちろん、かなりの練習が依然として主に解剖自身のために、必要となります。我々の経験では、ライブ解剖の方法を学ぶすべての人は彼/彼女は最も急速に高品質のアレイ解剖を生成することができる微妙に異なる解剖のプロトコルを作成します。このプロセスは、完全な開発のための数ヶ月を必要とします。しかし、ほとんどの人は練習の数週間後に高品質の解剖を生成することができます。 我々はスクリーニングのためのライブ解剖の使用を支持するが、固定された解剖のプロトコルは胚の段階のより広い範囲に適用することができるので、彼らは、固定された解剖を置き換えることはできません。例えば、モータの軸索ガイダンスの表現型のための私達のDFキットの分析では、我々は、糸状仮足を含めて、モータ軸索の枝、、の詳細は、従来の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）免疫組織化学的可視化によるよりも、ライブフィ...

<table><tbody><tr><td>フィラメント入りホウケイ酸ガラス管</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-60-10</td><td></td></tr><tr><td>ナリシゲ PC-10 ニードルプラー</td><td>Narishige International</td><td></td><td>加熱レベル 58.9 で管を抽出</td></tr></tbody></table>

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

胚発生の段階で14と17との間のショウジョウバエの胚は、容易に&quot;フィレット&quot;の準備を生成するために解剖することができます。これらの製剤では、中枢神経系では、真ん中の下に実行され、ボディの壁に挟まれている。多くの異なる表現型は、このような調製物を用いて検討されています。ほとんどの場合、切り身は、抗体染色の固定ホールマウント胚の解剖によって生成されました。これらの&quot;固定された解剖では、&quot;しかし、いくつかの欠点を持っている。彼らは、実行には手間がかかる上に、​​それは突然変異がGFPのバランサー染色体にわたって維持されている銘柄から変異体（GFP陰性）胚をソートすることは困難です。 2002年以来、私たちのグループは、オーファン受容体に対するリガンドを同定するために欠乏し、異所性発現の画面に行ってきました。これを行うために、我々は生きている胎児の解剖とバランスのとれた、数百行を含むコレクションの抗体染色のための合理化されたプロトコルを開発した。我々はそれが固定された解剖ではなく、ライブ解剖による株式の大規模なコレクションの表現型を調べるためにかなり効率的であると結論付けている。ここで記述されたプロトコルを使用して、単一の訓練を受けた個人が化合物の顕微鏡下でそれぞれのラインから4月7日変異体胚を調べて、表現型の1日あたり10行まで選別できます。これは微妙な、低浸透表現型を付与する変異の同定を可能にする、行あたり最大70 hemisegments以降は40X水浸レンズと高倍率で採点されます。

我々は、特定の遺伝子型のショウジョウバエの胚の&quot;フィレット&quot;の準備を生成するための合理化プロトコルを記述する。このプロトコルは、遺伝子スクリーニングの様々な効率的な実行が可能になります。また、後期胚における構造物の優れた視覚化することができます。

胚発生のステージ14から17の間にあるショウジョウバエの胚は、容易に解剖して「フィレ」標本を作成することができます。これらの標本では、...

ここでは、胚の回収手順について説明します。ショウジョウバエをバイアルから5口の回収チャンバーのチューブへ移します。次に、チャンバーの上にグレープ農業用プレートを載せ、数時間、ハエに産卵させます。胚が適切な段階に達したら、絵筆を用いてグレープアゲートから両面テープに移動させます。次に、胚をコーンから転がし出し、腹側を下にしてアガーブロック上に並べます。中央に、長方形のワックスと両面テープが貼られたスライドが見えます。両面テープの一端を、胚が並んだブロックの上に反転させて重ね、胚に触れさせてスライドへ転写します。これにより、胚はすぐに背面が上向きになります。ワックスの長方形で囲まれたスライド上の領域にPBSを加え、胚を覆います。上がスライドの側面図、下が上面図です。ガラス製解剖針を用いて、卵膜に沿って切り込みを入れます。胚の脳領域を突き、胚を持ち上げて、ガラス板の上に列状に並べます。その後、各胚を解剖してフィレ状にします。手順の最後に、ゼブラフィッシュ胚が列状に並んだスライドが完成します。これで固定準備が整いました。こんにちは。私はカリフォルニア工科大学生物学部門のKaizen研究室のポスドク、Peter Leeです。こんにちは。私はKaizen研究室のCaltech大学院生、Ashley Wrightです。私はCaltechの教授であるKaizenです。私の研究グループでは、ショウジョウバエの神経系の発達に関する研究を行っています。本日は、生きたopal胚の解剖手順をご紹介します。私たちは、これらの手法を用いてオーファン受容体のリガンド探索を行ってきました。具体的には、受容体融合タンパク質を用いて胚をライブ染色し、細胞表面タンパク質を過剰発現させた系統のコレクションをスクリーニングすることでこれを実施しています。また、研究室ではこの手順を胚の表現型の解析や遺伝学的スクリーニングにも利用しています。私は、ガイダンス表現型における運動行為の欠損スクリーンを実施しました。それでは始めましょう。ピーターがその方法を実演します。まず、スパチュラを用いて、胚回収チャンバーの各バレルに対応するグレープ農用卵回収プレート上に、酵母ペーストを少量ずつ配置します。次に、ショウジョウバエのバイアルに二酸化炭素ガスを注入して、ハエを麻酔させます。数百匹のハエを回収チャンバーに直接移します。次に、卵採取プレートでチャンバーを覆い、押し付けます。20インチのラベルテープを用い、アガープレートの中央から始めてチャンバーとプレートを一緒に固定します。テープは卵採取プレート上で重なるようになります。ハエが覚醒した後、水平状態で暗所の室温にて2〜3時間インキュベートします。インキュベーション後、ハエを下に叩き落としてから、採取プレートを交換します。取り出したプレートの各セクターに胚が100個未満である場合は、十分な数の胚が集まるまで2時間ごとの回収を継続してください。回収した胚は、付属の書面プロトコルの規定に従ってプールすることができます。胚を成熟させるために、90 mmの円形フィルターペーパーを湿らせてペトリ皿の蓋に置き、その上に胚が入った回収プレートを逆さまに載せます。プレートを目的の期間および温度でインキュベートします。スライドガラスに両面テープを貼り、胚のステージングおよび選別用のスライドを準備します。次に、グレープアガーの長方形の塊をスライドガラスの上に載せます。エガーは、10～15個の胚を10列から15列まで保持できる十分な大きさである必要があります。胚が目的の段階に達したら、インキュベーターから胚を取り出します。成熟した胚を回収プレートから両面テープに移動させます。濡らした絵筆を使用して、胚をテープ上に均等に広げます。GFP解剖顕微鏡下でSOAR胚を観察し、ジェノタイプを示す適切なGFP発現を確認します。本実験では、バランサーcurly armのGFP発現が見られない胚を選択することでジェノタイピングを行います。胚のジェノタイピングは使用するバランサーによって異なるため、詳細については付属の書面プロトコルを参照してください。次に、鈍端の解剖針を用い、胚を両面粘着テープの上で優しく転がして固定します。ステージ16では、腸は3つの帯状に分かれています。その後、腸の尾端付近に斜めの帯状の構造が発達し始め、続いて巻曲が進むことで、胚の形態がより明確になります。次に、解剖針を用いて、各胚を絨毛膜または他の胚の上で転がします。テープに触れないように注意しながら胚を持ち上げ、グレープアガーのスラブへ移します。コーティングした胚をこのスラブ上に並べ、背面をアガースラブに密着させ、後端を下に向けます。次に、濡れたフィルターペーパーを入れたペトリ皿にスライドを置き、目的の齢に達するまで室温で胚を培養します。解剖を行う場合は、小さな長方形に切った両面テープを用意し、生体解剖用のスライドを作成します。ワックスペンを使用して、Super Frost Plusスライドの一端付近にテープを貼付します。テープの周囲に、スライドの幅と同じ幅で長さ30〜40 mmの長方形を描きます。ワックスとテープの間には約3 mmの間隔をあけてください。次に、スライドを反転させ、並べた胚の上にゆっくりと下ろしてテープを接触させ、胚をグレートプレートスラブからテープへと転写します。胚は後端が下になるように配置します。移送後、胚はスライド上で背面が上を向いた状態になります。直ちに、インジェクションニードルのようにニードルプラーで作成したガラス解剖針を用いて、ワックスの矩形を満たすようにXPBSを胚の上に1滴加えます。胚の後端から背面正中線に沿って切開します。次に、胚の前端をつつき、持ち上げます。下側から始めて、胚をバッファーに浸したまま、テープストリップの右側に移動させます。引き続き胚の解剖と移動を行い、agri slabの各列に対応するように、スライド上に胚を整然と並べます。解剖針を使用して、体壁のフラップをスライド上にそっと押し下げます。この際、表面の組織を伸ばしたり、剥離したりしないように注意してください。針は、体壁の背側端にある前方および後方の隅にのみ接触させるようにします。運動ニューロンの軸索はこの距離まで伸びていないためです。背側では、スライドの針に触れないようにしてください。すべての胚を転送し、スライドに固定した後に針が破損するためです。各胚の脳領域から腸を4箇所切断し、腸全体を胚から引き抜いて除去します。後腸をスライドガラス上に押し出します。すべての解剖が完了したら、2本のパステールピペットを用い、室温の5% formaldehydeをワックス長方形の片角に注入すると同時に、反対側の角から溶液を除去します。この固定液の交換を計6 mLの総量を用いて3回繰り返します。胚を固定液中で45分間インキュベートします。メニスカス（液面）が胚に触れると胚が破壊されるため、接触させないことが非常に重要です。パスツールピペットを使用して、固定液の大部分を除去します。2本のパスツールピペットを用いた手法で、PBSで3回洗浄します。次に、胚を透過処理するためにPBTで3回洗浄します。この工程により、胚がメニスカスによる影響を受けにくくなります。最終洗浄後、スライドを傾けて carefully にPBTを除去し、ワックスで囲まれた領域の端にKimwipeを軽く触れさせて余分な溶液を取り除きます。あらかじめ溶液を充填したピペットマンを使用して、直ちに200 µLのブロッキング溶液を加え、室温で10〜30分間ブロッキングします。その後、Kimwipeを用いてブロッキング溶液を拭き取ります。その後、ブロッキング溶液で希釈した目的の一次抗体を200 µL直ちに加えます。スライドを加湿プレートに入れ、4 °Cで一晩インキュベートします。本実験では、運動ニューロンの軸索を標識するためにモノクローナル抗体1D4を使用します。翌日、ディッシュを4 °Cから取り出し、ロッキングプラットフォーム上でPBTを用いて胚を3回洗浄します。洗浄は1回につき少なくとも15分間行います。すべての洗浄ステップにおいて、ロッキング中にスライドが完全に浸る十分な量のPBTがあることを確認してください。胚の洗浄後、前述と同様にスライドをブロッキングします。ブロッキング後、二次抗体およびブロッキング液 200 µLを直ちに加え、室温で2時間インキュベートします。ここでは、Alexa 488 goat anti-US二次抗体が使用されます。この二次抗体は、筋線維を標識するためにRhodamine Phinと併用します。その後、ロッキングプラットフォームを用いて、1回につき少なくとも15分間、PBTで3回洗浄します。スライドを別のトレイに移し、残留した洗剤を除去します。次に、PBSで5分間、2回洗浄します。スライドをPBSから取り出し、ウェルに残っているPBSの大部分をキムワイプで取り除いた後、直ちに70% glycerolを500 microliters加えます。グリセロールは胚と同じ屈折率を持つため、この工程を行うことで染色の視認性が向上します。胚を室温で2時間、または4°Cで一晩透明化させます。その後、キムワイプでグリセロールを除去します。グリセロールをほぼすべて除去すると胚は平坦になりますが、除去量を少なくすると、より立体的な構造が維持されます。グリセロールを除去した後、1番のカバーガラスを載せます。これで胚のイメージング準備が整いました。解剖および染色された胚は、免疫蛍光顕微鏡で可視化できます。ここでは、解剖した胚を運動ニューロン軸索標識抗体1D4で染色しています。この画像は、免疫蛍光法を用いた可視化にHRP免疫組織化学が使用された、より一般的に見られる画像と外観が似ています。運動神経軸索の分枝の詳細をより明確に確認できる、より高品質な画像を得ることが可能です。アクチンに結合するrho domine標識phinによる共染色を行うことで、筋肉を同時に可視化できます。これにより、HRP染色で得られるよりも、筋肉の層構造と組織化をより明確に把握することができます。ここでは、運動ニューロンの軸索が緑色で、筋肉が赤色で示されています。以上で、変異体系統のコレクションから生きているショウジョウバエ胚を解剖する方法を実演しました。これらの手順を行う際は、lioやarmadillo-GFPなどの扱いやすいバランスストック系統から始め、一度に少数の系統のみで実施することが重要です。解剖の技術に習熟し速度が上がれば、1日あたり最大10系統まで処理することができ、これにより200系統ほどの変異体コレクションを20日間ほどでスクリーニングすることが可能になります。したがって、すべての工程の実行に習熟すれば、これは非常に効率的な手順となります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

live-dissection-drosophila-embryos-streamlined-methods-for-screening

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

成人を準備するために標準的なアプローチ...

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

ここでは、ショウ ジョウバエ...

後期胚 性ショウジョウバエ生殖腺 の解剖とライブイメージング

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

この研究では、斬首、固定、凍結切片、蛍光染色、免疫染色、およびイメージングを含む組織処理の簡略化されたプロトコルを提示します。これらは共焦点および多光子イメージングに拡張できます。この方法は、複雑な解剖に匹敵する有効性を維持し、高度な運動能力の必要性を回避します。定量的な画像分析は、広範な調査の可能性を提供します。...

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

本記事では、試薬を節約し、少数の想像椎間板を取り扱いやすくする効率的な幻想椎間板解剖および抗体染色プロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエ・メラノガスターからの眼触角および翼の想像円板の小規模解剖および抗体染色

学ぶショウジョウバエ胚のライブ解剖法による遺伝スクリーニング。フィレット標本作製で神経発生と発生生物学の研究を効率化し、高品質な蛍光イメージングを実現します。

のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

さらに動画を探す