のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

ここでは、胚を収集する手順を示します。バイアルから5バレルの収集チャンバーのチューブに飛来します。次に、チャンバーの上にブドウのアグリプレートを置き、ハエが数時間卵を産むのを待ちます。

胚が正しい段階にあるとき、それらをブドウのエイトから絵筆で両面テープに移します。次に、胚をコンから転がし、腹側を寒天ブロックに並べます。真ん中には、長方形のワックスと一片のダブルスティックテープが入ったスライドがあります 一方の端で、並んでいる胚のブロックの上にダブルスティックテープを反転させ、それを胚に触れてスライドに移します。

彼らはすぐに背側を上にします。胚を覆うように、ワックス長方形で囲まれたスライドの領域にPBSを追加します。上部はスライドの側面図を示し、下部は上部図を示しています。

ガラス解剖針でフィール膜に沿ってスリットを切ります。脳の領域に胚を突いて持ち上げ、ガラスの上で列に動かします。次に、各胚を解剖してフィレを作ります。

手順の最後には、フィレ胚の列が描かれたスライドがあります。これで修正する準備が整いました。こんにちは、カリフォルニア工科大学の生物学部門カイゼン研究室のポスター、ピーター・リーです。

こんにちは、カリフォルニア工科大学のカイゼン研究室の大学院生、アシュリー・ライトです。私はカリフォルニア工科大学の教授であるカイゼンで、私の研究グループはショウジョウバエの神経系の発達に取り組んでいます。今日は、生きたオパール胚を解剖する手順をお見せします。

私たちはこれらの方法を用いて、オーファン受容体リガンドを探索してきました。これは、受容体融合タンパク質による胚の生染色により、発現する細胞表面タンパク質上の系統のコレクションをスクリーニングすることによって行われます。また、実験室ではこの手順を使用して、胚の表現型を研究し、遺伝子スクリーニングを行っています。

私は、ガイダンス表現型に対する運動行為の欠損スクリーニングを実施しました。それでは始めましょう。ピーターがその方法をお見せします。

まず、へらを使用して、胚収集チャンバーの各バレルに対応するブドウ農業卵収集プレートに酵母ペーストのスポットを置きます。次に、ハエのバイアルに炭酸ガスを注入して、ハエを眠らせます。数百匹のハエを直接収集チャンバーに移します。

次に、チャンバーを採卵プレートで覆い、20インチの長さのラベリングテープストラップを使用して、寒天プレートの中央からチャンバーとプレートを一緒に押し下げます。テープは卵収集プレートに重なります。ハエが目覚めたら、インキュベーション後、暗闇で室温で2〜3時間水平にインキュベートし、ハエを軽くたたいてコレクションプレートを交換します。

除去されたプレートの各セクターに存在する胚が100個未満の場合。十分な胚が収集されるまで、2時間の収集を続けます。収集された胚は、添付の書面によるプロトコルの仕様に従ってプールすることができます。

胚を老化させるには、90ミリメートルの円型濾紙の濡れた部分をペトリ皿の蓋に入れ、胚を逆さまにしてコレクションプレートを置きます。プレートを所望の期間、所望の温度でインキュベートし、スライド上に両面粘着テープを貼って胚のステージングと選別のためのスライドを調製します。次に、Sスライドにブドウ寒天の長方形のスラブを置きます。

エッガーは、10〜15個の胚を5〜10列保持するのに十分な大きさである必要があります。胚が目的の段階に達したら、インキュベーターから胚を取り出します。老化した胚をコレクションプレートから両面粘着テープに移します。

濡れた絵筆を使用して、胚をテープ全体に均等に広げます。GFP解剖顕微鏡下で、適切なGFP発現のために胚をSOARします。これは遺伝子型を示します。この実験では、バランサーカーリーアームGFPの発現を欠く胚を選択することにより、ジェノタイピングを行います。

胚のジェノタイピングは使用するバランサーによって異なるため、これを実行する方法の詳細については、添付の書面によるプロトコルを参照してください。歩。次に、鈍い解剖針を使用して、両面粘着テープ上で胚を優しく転がして胚をコーティングします。ステージ16では、腸は3つのバンドに分かれています。

この後、腸は尾の近くに斜めの帯を発達させ始め、その後コイル状になり、胚がより鮮明になります。次に、解剖針を使用して、各胚をコリオンまたは他の胚の上に転がします。テープとの接触を避けて、胚を持ち上げ、それをブドウ寒天のスラブに移します。

このスラブ上のコーティングされた胚を、その背側を寒天スラブに合わせ、後端を下に向けて位置合わせします。次に、スライドを湿った濾紙を入れたシャーレに置き、胚を室温で所望の年齢に達するまでインキュベートします 解剖のためには、両面粘着テープの小さな長方形の部分を切断して、ライブ解剖用のスライドを準備します。ワックスペンを使用して、スーパーフロストプラススライドの一方の端の近くにテープを置きます。

スライドの幅とテープの周りに30〜40ミリメートルの長さの長方形を描きます。ワックスとテープの間には約3ミリメートルのスペースが必要です。次に、スライドを反転させ、並んでいる胚の上にゆっくりと下げて、テープがそれらに接触するようにして、グレートプレートスラブから胚をテープに移します。

胚は後端を下にして向きを変える必要があります。移植後、胚はスライド上の背側を上にして配置され、すぐに胚の上に 1 つの XPBS を追加して、注射針のような針引き手で作られたガラス解剖針を使用してワックスの長方形を埋めます。胚の後端から始めて背側の正中線に沿って切り取ります。

次に、胚の前端を突いて持ち上げます。下部から始めて、胚をテープストリップの右側に移し、バッファーに保持します。胚の解剖と移植を続け、アグリスラブの各列に一致する胚の整然とした列をスライド上に作成します。

解剖針を使用して、体壁のフラップをスライドにそっと押し下げます。表面から材料を引き伸ばしたり取り除いたりしないでください。針は、体壁の背側縁の前方および後方の角にのみ接触する必要があります。

運動軸索はここまで伸びていないので。背側では、すべての胚が移植されてスライドに貼り付けられた後にスライドの針が壊れるため、スライドの針に触れないでください。脳の領域から4つの腸を切断し、腸全体を胚から引き離すことにより、各胚から腸を取り出します。

後腸をスライドにずらします。すべての解剖が完了したら、2つの過去のピペットを使用して、室温、5%ホルムアルデヒドをワックスの1つの角に同時に供給し、長方形にし、反対側の角から溶液を取り除きます。固定液は、総容量約6ミリリットルで3回交換します。

固定液中で胚を45分間インキュベートします。半月板が胚に接触しないようにすることが非常に重要です。過去のピペットを使用して、固定液の大部分を取り除きます。

PB Sで2つの牧草地ピペット法を使用して3回洗浄します。その後、PBTで3回洗浄して胚を透過させます。また、このステップにより、胚は半月板に対する感受性が低下します。

最終洗浄後、スライドを傾けてPBTを慎重に取り除き、ワックスで囲まれた領域の角にキムワイプを軽く触れて余分な溶液を取り除きます。プリロードされたピペットマンを使用して、すぐに200マイクロリットルのブロッキング溶液ブロックを10〜30分間追加します。室温で、キムワイプワイプを使用してブロッキング溶液を取り除きます。.

次に、ブロッキング溶液で希釈した目的の一次抗体200μLを直ちに加えます。スライドを加湿プレートに入れ、摂氏4度で一晩インキュベートします。この実験では、モノクローナル抗体1D fourを使用してモーター軸索を標識します。

翌日、摂氏4度から皿を取り出し、PBTを入れたロッキングプラットフォームで胚を3回、洗濯ごとに少なくとも15分間洗います。すべての洗浄ステップで、ロッキング中にスライドを完全に浸すのに十分なPBTがあることを確認してください。胚を洗浄した後、前と同じようにスライドをブロックします。

ブロッキング後、すぐに200マイクロリットルの二次抗体とブロッキング溶液を添加し、ここで室温で2時間インキュベートし、Alexa 4 88 go抗米国薬をインキュベートします。セカンダリーは、Rodine Phinと併用して筋繊維を標識するために使用されます。繰り返しになりますが、ロッキングプラットフォームでPBTを使用して、1回の洗浄につき少なくとも15分間3回洗浄します。

スライドを別のトレイに移して、残留洗剤を取り除きます。次に、PBSで5分間2回洗います。PBSプロットからスライドを取り出し、ケムワイプでウェルから残りのPBSの大部分をプロットし、すぐに500マイクロリットルの70%グリセロールを加えます。

グリセロールは胚と同じ屈折率を持っているため、このステップを実行すると染色がより目立つようになりますので、胚を室温で2時間、または摂氏4度で一晩透明にします。次に、キムワイプでグリセロールを取り除きます。ほぼすべてのグリセロールを除去すると胚が平らになり、グリセロールの除去が少なくなると、より立体的な構造が得られます。

グリセロールを取り除いたら、ナンバーワンのカバースリップを貼ります。胚はイメージングの準備ができており、解剖および染色された胚は免疫蛍光顕微鏡で視覚化できます。ここでは、解剖された胚をモーター軸索標識抗体1D4で染色しています。

この画像は、免疫蛍光法を用いた可視化にHRP免疫組織化学が用いられている、より一般的に見られる画像と外観が似ています。運動軸索枝の詳細がより鮮明に見える高品質の画像を取得することが可能です。アクチンに結合するrho domine標識フィンによるCos染色により、筋肉の同時可視化が可能になります。

これにより、筋肉の層状化と組織化がより鮮明になり、HRP染色で取得できます。ここでは、1D、4つまたは運動軸索が緑色で示されているか、筋肉が赤色で示されています。私たちは、突然変異株のコレクションから生きたショウジョウバエの胚を解剖する方法を示しました。これらの手順を行うときは、リオ、アルマジロ、GFP、バランス株などの簡単なラインから始めて、一度に数行だけ行うことが重要です。

解剖が専門的で迅速になるにつれて、1日に最大10ラインを行うことができ、これにより、約20日間で約200の変異ラインのコレクションをスクリーニングできるようになります。したがって、これは、すべての手順を実行する専門家になれば、非常に効率的な手順です。というわけで、ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。