Name: 細胞のLenslessオンチップイメージングは、ハイスループット細胞生物学および医学診断のための新しいツールを提供します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶレンズフリーオンチップイメージングLucasプラットフォームを用いた細胞の高速解析手法。CCDセンサーアレイでデジタルホログラムを記録し、カスタムアルゴリズムで自動細胞識別を実現。医療診断とハイスループット細胞生物学に革新的なツールを提供する。

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ここでは、LUCAS [1-3]に関与している実験的な手順を説明します。 LUCASの概念実証を説明するために我々は、全血サンプルのイメージングプロセスを説明します。 A.イメージングセットアップ LUCASイメージングプラットフォームは、特に資源が限られた設定のために、既存のポイントオブケアサイトメトリーや医療診断ツールに費用対効果の高い、コンパクトな代替手段を提供するために重要な利点を示す。むしろ細胞の画像を検出するよりも、LUCASは、代わりに背景光との各セルからの散乱光の干渉によって作成されているセルのデジタルホログラムをキャプチャします。照明の部分的な空間的コヒーレンスの注意深い制御は、ホログラフィック記録を有効にするために重要です。 1。デジタルセンサーアレイ LUCASプラットフォームは、デジタル、個々のセルのホログラムを記録する光センサアレイを利用しています。使用することができます：または相補型金属酸化膜半導体チップ（MT9P031、マイクロンCMOS、サンプルモデル）：、この目的のために、いくつかのデバイスを（KAI - 11002、KAF - 39000、コダックからのサンプルモデルCCD）にてご利用いただけます。それぞれ、アクティブな10平方センチメートルのFOV、18平方センチメートル、および24.4平方ミリメートルで、コダックのためのピクセルサイズはいくつかのデバイス、KAI - 11002、KAF - 39000を充電し、マイクロンCMOSイメージセンサーは9μm、6.8μmおよび2.2μmです。 [1-2]。 2。ライトソース他のほとんどの顕微鏡イメージングのモダリティとは異なり、LUCASは、レーザーを必要としないため、さらに簡単な発光ダイオード（LED）は照明用に使用することができます。波長可変光源を有効にするために、我々はまた、繊維の束（77564、ニューポート）とのピンホールで構成される標準グレードフューズドシリカ繊維と一緒にキセノンランプ（コーナーストーンT260、ニューポート社）とモノクロメータを利用することができます〜直径100μm、センサ表面上に5〜10 cmの位置。この波長可変光源の構成は、細胞のホログラフィック署名が調整できる柔軟なプラットフォームを提供し、ハイブリッドデジタル署名は、優れた特性評価の精度と特異性のために信号対雑音比を向上させるために合成することができる。 [3] B.サンプルの調製とイメージングイメージングチップに基づいて、LUCASの概念実証は、下記のように不均一溶液を用いて実証される。同様のプロトコルは、様々な他の細胞タイプ[1-3]に適用することができる。 1。全血の希釈と不均一溶液の準備<ol><li>プロセスを開始するには、全血サンプルと様々な直径（5、10、20μmである。デュークサイエンティフィック）のポリスチレンビーズを取得し、室温にそれらのすべてをもたらす。 </li><li>滅菌5mLのポリプロピレンチューブに、希釈剤としてRPMI 1640古典的な液体培地（フィッシャーサイエンティフィック社）の2 mlを加え。 </li><li> 30分間の全血サンプルをインキュベートした後、沈降した赤血球試料の10μLをピペットおよびRPMI溶液中にそれを転送する。 </li><li>赤血球RPMIの希釈に20μLポリスチレンのマイクロビーズの合計量を追加し、穏やかにピペッティングしたり、攪拌棒でマグネチックスターラーを使用して、細胞溶液を攪拌。 </li><li>カバースリップの上に5から15μL不均一溶液の総量を配置し、鉗子を使用して、ソリューション秒以上、同一のカバースリップを配置。サンプルは均等に2つのカバースリップの間に挟まれるべきである。 </li><li>その後、真空ペン（NT57 - 636、エドモンドオプティクス）を使用すると、イメージングのためのセンサアレイの活性領域にサンプルをロードします。 </li></ol> 2。全血の染色<ol><li> 0.1％の混合物の製造から始めては電力型の純粋なエオシンY（MW = 691.85、アクロスオーガニック）、亜鉛を含​​まない純粋な新規メチレンブルー色素（MW = 347.90、アクロスオーガニック）を使用して、エオシンYおよび希薄化後のニューメチレンブルー溶液をバッファとシュウ酸カリウム一水和物（99.0％試薬ACS、アクロスオーガニック）、各溶液は、水性白血球の染色のための0.45μmの孔径Syringlessフィルター（ワットマン）で精製される。 </li><li>その後、静かに2分間マグネチックスターラーを使用することによりポリプロピレンのビーカーで1:1の体積比で全血検体を溶解した水溶液染色試薬を攪拌し、10分間インキュベートする。 </li><li> 5mLのポリプロピレンチューブに50μLのステンド血液を移し、1:200の体積比を取得するために1.95 mLのRPMI 1640古典的な溶液（フィッシャーサイエンティフィック）で希釈する。その後、渦30秒のための希釈。異なる希釈率も、この段階で導入することができる。 </li><li>カバーガラスの間やマイクロ流体貯留層内で10〜100μLの染色細胞液をピペットで。その後、真空ペン（NT57 - 636、エドモンドオプティクス）を使用して、センサアレイの活性領域の上に試料を配置。 </li></ol>駐在結果ve_content"&gt; <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig1tmb.jpg" alt="図1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：LUCASはどんなレンズ、レーザーや他の大型の光学部品を使用せずに正確なカウントと様々な細胞とその2次元ホログラフィック署名に基づくマイクロオブジェクトのデジタル分化を可能にする。様々なマイクロオブジェクトの特性LUCAS署名は、この図に示されていると40倍対物レンズで得られた従来の顕微鏡画像と比較されます。してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1650/1650Fig1.jpg">ここをクリックして</a>図1の拡大バージョンを参照すること。 <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：赤血球、10um、5um、3 UM粒子を含む不均一な混合物の（左）RAW画像。ビューの同じフィールド（右）全自動LUCASの特性評価の結果が示されている。意思決定のアルゴリズムは3umビーズのような雑音比が低い信号で高密度領域だけでなく、粒子の特性に堅牢であることに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1650/1650Fig3tmb.jpg" alt="図3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：LUCASカスタムのインターフェースが示されている。 JavaベースのLUCASソフトウェアは、センサの画素サイズや光の波長など、さまざまな実験条件の入力が可能になります。 image上のビューの特定のフィールドの選択を行うこともできるし、標的細胞のパターンは統計的な細胞の影のライブラリを構築するためにユーザが定義することができます。取得したルーカスのイメージは、この訓練データに基づいて特徴づけることができる（すなわち、セルの影のライブラリ）とマーク（カウント）のイメージがユーザーに表示されます。カウント結果の統計情報も、さらなる分析のためのXMLファイルとして保存されます。

<ol><li>Seo, S., Su, T., Tseng, D. K., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Lensfree+Holographic+Imaging+for+On-Chip+Cytometry+and+Diagnostics%22%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">"Lensfree Holographic Imaging for On-Chip Cytometry and Diagnostics".</a> Lab Chip. , (2009).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22High-throughput+Imaging+and+Characterization+of+a+Heterogeneous+Cell+Solution+on+a+Chip%22+%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"High-throughput Imaging and Characterization of a Heterogeneous Cell Solution on a Chip" .</a> Biotechnology and Bioengineering. , (2008).</li>
<li>Su, T., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Multi-color+LUCAS%3A+Lensfree+on-chip+cytometry+using+tunable+monochromatic+illumination+and+digital+noise+reduction%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">"Multi-color LUCAS: Lensfree on-chip cytometry using tunable monochromatic illumination and digital noise reduction".</a> Cellular and Molecular Bioengineering. , (2008).</li>
</ol>

我々は、LUCASプラットフォームが正確にカウントし、そのホログラフィック署名に基づくチップ上に様々なmicro-objects/cellsを識別できるよう図示、およびポイントオブケア医療診断およびハイスループット細胞生物学のための有望なツールを提供している。正確に記録されたホログラムパターンを処理するために、我々は独自に開発したLUCASの意思決定のソフトウェアを実装。ルーカスの画像の訓練によって作成された統計的回折像のデータベースを使用してこのアルゴリズムは、不均一溶液内の細胞の様々な機能を識別し、タイプや個々の細胞の相対的な位置を分類し、不要な粒子を破棄するように閾値処理を適用した後、所望の細胞タイプをカウント/セルのパターン[1-3]。 要約すると、LUCASのプラットフォームでは、ポイントオブケアサイトメトリーや医療診断のためのコスト効率が高くコンパクトなソリューションを提供する必要があります。この最後の場合は、LUCASは、特にリソースが限られた環境でだけでなく、マラリアや結核などの他の地球規模の健康関連の問題のためのHIV患者のモニタリングに有効となります。

<table><tbody><tr><td>電荷結合素子 (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAI-11002</td><td></td></tr><tr><td>電荷結合素子 (CCD)</td><td>KODAK</td><td>KAF-39000</td><td></td></tr><tr><td>相補的金属酸化膜半導体 (CMOS)</td><td>Micron</td><td>MT9P031</td><td></td></tr><tr><td>キセノンランプ</td><td>Newport Corp.</td><td>Cornerstone T260</td><td></td></tr><tr><td>バキュームペン</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT57-636</td><td></td></tr><tr><td>5, 10, および 20 &amp;mu;m マイクロビーズ</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4000 Series</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>1640</td><td></td></tr><tr><td>純粋エオシンY</td><td>Acros Organics</td><td>MW=691.85</td><td></td></tr><tr><td>ニューメチレンブルー(NMB)色素</td><td>Acros Organics</td><td>MW=347.90</td><td></td></tr><tr><td>シュウ酸カリウム一水和物</td><td>Acros Organics</td><td>99.0% Reagent ACS</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞のlenslessオンチップイメージングは​​、ハイスループット細胞生物学および医学診断のための新しいツールを提供します。

Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical Diagnostics

他のレンズと光学部品と一緒に動作する対物レンズの使用により、従来の光学顕微鏡画像の細胞。非常に効果的ですが、この古典的なアプローチは、マイクロフルイディクスの技術の高度な状態と互換性を持たせるためにイメージングプラットフォームの小型化に一定の制限があります。このレポートでは、我々はLUCASと呼ばlenslessオンチップイメージングコンセプトの実験の詳細を紹介する（<strong<em&gt; L</em</strong&gt; ensless<strong<em&gt; U</em</strong&gt; LTRAワイド視野<strong<em&gt; C</em</strong&gt;エルのモニタリング<strong<em&gt;</em</strongに基づいて&gt; rrayプラットフォーム<strong<em&gt; S</em</strong同じ大きさにまたがることができるビューの超広視野上の画像不均一な細胞のソリューションを、任意の顕微鏡対物レンズや他の大型の光学部品を必要としない&gt;ハドウイメージング）〜18センチメートル<sup&gt; 2</sup&gt;。また、従来の顕微鏡とは違って、LUCAS〜9 mLのサンプル容量を最大に対応するリフォーカスすることなく画像〜5 mmの被写界深度の上の関心の異種細胞溶液をすることができます。このイメージングプラットフォームレコードその視野内で関心の各セルの影（すなわち、lenslessデジタルホログラム）、およびこれらの細胞の影の自動化されたデジタル処理は、タイプ、カウントおよびソリューション内のセルの相対位置を決定することができます。それはどんなかさばる光学部品または機械的なスキャニング段階が必要としないため、同時にcare診断ツールの特にポイントのために非常に重要であるコストを、削減さを大幅に小型化されたプラットフォームを提供しています。さらに、このプラットフォームのイメージングのスループットは、ハイスループット細胞生物学実験のために極めて貴重であることが、従来の光学顕微鏡よりも優れて桁違いです。

細胞のLensfreeオンチップのイメージングと特性が示されている。このオンチップ細胞イメージングのアプローチは、リソースの乏しい環境のために特に適し、医療診断およびハイスループット細胞生物学のアプリケーション向けのコンパクトで費用効果の高いツールを提供します。

細胞のLenslessオンチップイメージングは​​、ハイスループット細胞生物学および医学診断のための新しいツールを提供します。

従来の光学顕微鏡は、対物レンズおよびその他のレンズや光学部品を組み合わせて細胞を画像化します。非常に……

このビデオでは、Lucasと呼ばれるレンズリスト・オンチップ・イメージングの概念実証を示します。Lucasとは、シャドウイメージングに基づくレンズリスト超広視野細胞モニタリングアレイプラットフォーム（lens list ultra wide field of view cell monitoring array platform based on shadow imaging）の略称です。従来のイメージングセットアップとは異なり、Lucasプラットフォームは顕微鏡対物レンズやその他の嵩高い光学部品を必要としません。Lucasの手法では、目的の検体を顕微鏡スライドガラス上に配置し、同一のカバーガラスで軽く挟み込みます。次に、バキュームペンを使用して、サンプルを光電子センサアレイの有効領域にロードします。その後、イメージングプラットフォームを用いて、視野内にある各目的細胞のシャドウグラフまたはレンズレスデジタルホログラムを記録します。これらの細胞影を自動的にデジタル処理することで、溶液中の細胞の種類、数、および相対的な位置を決定できます。視野は最大 18 centimeter squared に及び、被写界深度は約 5 millimeters です。取得された回折画像は、独自に開発された判定アルゴリズムによってデジタル処理され、標的細胞または粒子の特性評価と識別の両方を可能にします。Lucasは、イメージングベースの実験におけるコストを削減し、スループットを大幅に向上させる小型化プラットフォームを提供しており、マイクロフルイディクスや生物学的研究における最先端の高度な技術との互換性を備えています。こんにちは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）電気工学部のNano and Biophotonics研究室のROMです。そして、同じくNano and Biophotonics研究室のAnthony Erlingerです。本日は、全血サンプルなどの不均一なSA溶液をイメージングするための、ハイスループットなレンズの手順をご紹介します。当研究室における本手順では、シャドウイメージングに基づいたレンズリスト超広視野セルアレイモニタリングプラットフォームという新しいイメージング技術を利用しており、これを略してLucasと呼んでいます。それでは始めましょう。まず、3 mLの全血と、5 µm、10 µm、20 µmなどのさまざまな直径のポリスチレンマイクロビーズを用意し、30分間室温に置いてください。セロロジカルピペットを使用して、希釈剤として2 mLのRPMI 1640 classic液体培地を滅菌済みの5 mLポリプロピレンチューブに加えます。30分間の静置時間を置いた後、全血採取チューブの底部から10 µLの赤血球検体を分注し、RPMI溶液に移します。赤血球のRPMI希釈液に、合計20 µLのポリスチレンマイクロビーズを加え、緩やかにピペッティングして細胞溶液を攪拌します。ピンセットを用いて、この不均一溶液の5〜15 µLをカバーガラス上に移します。2枚目の同一のカバースリップを溶液の上に被せます。サンプルが2枚のカバースリップの間に均一に挟まれている必要があります。その後、バキュームペンを用いて、イメージングのためにサンプルをセンサーアレイの活性領域にロードします。次に、0.1% SNY緩衝液と希釈したニューメチレンブルー（NMB）溶液を2:1の体積比で混合し、水性染色試薬を調製します。SNYおよびニューメチレンブルー溶液の調製に関する詳細は、付属の書面プロトコルを参照してください。その後、ポリプロピレン製ビーカー内で、染色試薬と全血検体を1:1の体積比で混合し、マグネティックスターラーで2分間攪拌します。その後、室温でさらに10分間インキュベートし、溶液を1.99 mLのRPMI 1640 classic液体培地とともに5 mLのポリプロピレンチューブに入れます。次に、染色した血液溶液 10 µL をRPMIに移し、体積比 1:200 にします。その後、溶液を30秒間ボルテックスし、染色した細胞溶液 10 ～ 100 µL をカバーガラス間またはマイクロ流体リザーバー内にピペットで分注します。次に、バキュームペンを用いて、検体をセンサーアレイの活性領域に配置します。Lucasプラットフォームは、光電子センサアレイを利用して、レンズレス細胞ホログラムをデジタル的に記録します。この目的のために、電荷結合素子（CCD）が利用されています。波長可変の照明を実現するために、キセノンランプを備えたモノクロメーターと、標準グレードの溶融シリカファイバーが使用されます。このファイバーは、ファイバー束と、センサ表面から約5〜10 cm上の位置に配置された直径約100 µmのピンホールで構成されており、波長可変照明を可能にします。波長可変照明により、細胞のホログラフィック・シグネチャーを微調整できる柔軟なプラットフォームが提供され、複数の波長を統合してハイブリッド・デジタル・シグネチャーを合成することで、Lucas画像の信号対雑音比（S/N比）とコントラストを向上させることができます。より詳細な特性評価を行うため、2枚のカバーガラスで挟まれた精度試料をセンサーアレイの有効領域に載せ、光源によって均一に照射します。不均一溶液中の各細胞または微小物体の回折ホログラムがセンサーアレイ上に到達し、ルーカス像が形成されます。取得されたルーカス回折画像は、独自に開発された判定アルゴリズムによって処理され、統計的な回折画像ライブラリを用いて、標的細胞または微小物体の自動的な特性評価および同定が行われます。この図は、5 µm、10 µm、20 µmのポリスチレン製マイクロビーズと赤血球を含む不均一溶液を、一般的な40倍対物レンズで撮影した画像です。これらの粒子の3D形態、屈折率、および相互構成の複雑さは、すべて互いに異なります。これらの特徴の一部は従来の顕微鏡で識別可能ですが、Lucasプラットフォームでは0.5 mm²未満という非常に限られた視野での観察となります。これらのマイクロ粒子はすべて、指紋のようにそれぞれ異なる固有のホログラフィックパターンを示します。したがって、2Dテクスチャに基づいて曖昧さなく特性を評価することが可能です。Lucasは、10〜20 cm²にまで拡大可能な超広視野のモニタリングが可能です。これは標準的なレンズベースの顕微鏡よりも数桁広い範囲になります。こちらは、Lucasプラットフォームを用いて撮影した、染色済み全血サンプルの40倍対物レンズ画像です。染色された白血球の内部特徴は、細胞核の屈折率と散乱特性を変化させることで効率的に変化します。個々の細胞の特有な回折パターンがセンサーアレイによって記録されます。これは、ポイントオブケア細胞計測および診断目的のための強力なツールとしてのLucasプラットフォームのもう一つの利点を示しています。目的の細胞を迅速に特性評価するための完全自動プラットフォームとして、Lucas回折画像は独自に開発された判定ソフトウェアを用いてデジタル処理されます。この図では、赤血球とマイクロビーズの不均一な混合物がインターフェースによって処理されています。このアルゴリズムは、高密度領域だけでなく、3 µmビーズのような信号対雑音比の低い粒子に対しても堅牢な検出能を備えています。Lucasカスタムインターフェースでの処理済み画像がここに示されています。このソフトウェアでは、センサーの画素サイズや照明波長などのさまざまな仕様を入力することが可能です。さらに、画像内の選択や細胞パターンの定義を行うことができます。このデータに基づいてサンプルがカウントされ、マークされた画像がユーザーに表示されます。以上で、Lucasの高スループットプラットフォームを用いた細胞のイメージングおよび特性評価の方法について説明しました。この手順において、ここで実演した実験は、多種多様な細胞や微粒子に適用可能であることを覚えておくことが重要です。また、これにより、不均一な溶液中の細胞に対して、超広視野かつハイスループットな細胞特性解析が可能になります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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