細胞のLenslessオンチップイメージングは​​、ハイスループット細胞生物学および医学診断のための新しいツールを提供します。

このビデオでは、Lucasと呼ばれるレンズリスト・オンチップ・イメージングの概念実証を示します。Lucasとは、シャドウイメージングに基づくレンズリスト超広視野細胞モニタリングアレイプラットフォーム（lens list ultra wide field of view cell monitoring array platform based on shadow imaging）の略称です。従来のイメージングセットアップとは異なり、Lucasプラットフォームは顕微鏡対物レンズやその他の嵩高い光学部品を必要としません。

Lucasの手法では、目的の検体を顕微鏡スライドガラス上に配置し、同一のカバーガラスで軽く挟み込みます。次に、バキュームペンを使用して、サンプルを光電子センサアレイの有効領域にロードします。その後、イメージングプラットフォームを用いて、視野内にある各目的細胞のシャドウグラフまたはレンズレスデジタルホログラムを記録します。

これらの細胞影を自動的にデジタル処理することで、溶液中の細胞の種類、数、および相対的な位置を決定できます。視野は最大 18 centimeter squared に及び、被写界深度は約 5 millimeters です。取得された回折画像は、独自に開発された判定アルゴリズムによってデジタル処理され、標的細胞または粒子の特性評価と識別の両方を可能にします。

Lucasは、イメージングベースの実験におけるコストを削減し、スループットを大幅に向上させる小型化プラットフォームを提供しており、マイクロフルイディクスや生物学的研究における最先端の高度な技術との互換性を備えています。こんにちは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）電気工学部のNano and Biophotonics研究室のROMです。そして、同じくNano and Biophotonics研究室のAnthony Erlingerです。本日は、全血サンプルなどの不均一なSA溶液をイメージングするための、ハイスループットなレンズの手順をご紹介します。

当研究室における本手順では、シャドウイメージングに基づいたレンズリスト超広視野セルアレイモニタリングプラットフォームという新しいイメージング技術を利用しており、これを略してLucasと呼んでいます。それでは始めましょう。まず、3 mLの全血と、5 µm、10 µm、20 µmなどのさまざまな直径のポリスチレンマイクロビーズを用意し、30分間室温に置いてください。

セロロジカルピペットを使用して、希釈剤として2 mLのRPMI 1640 classic液体培地を滅菌済みの5 mLポリプロピレンチューブに加えます。30分間の静置時間を置いた後、全血採取チューブの底部から10 µLの赤血球検体を分注し、RPMI溶液に移します。赤血球のRPMI希釈液に、合計20 µLのポリスチレンマイクロビーズを加え、緩やかにピペッティングして細胞溶液を攪拌します。ピンセットを用いて、この不均一溶液の5〜15 µLをカバーガラス上に移します。

2枚目の同一のカバースリップを溶液の上に被せます。サンプルが2枚のカバースリップの間に均一に挟まれている必要があります。その後、バキュームペンを用いて、イメージングのためにサンプルをセンサーアレイの活性領域にロードします。

次に、0.1% SNY緩衝液と希釈したニューメチレンブルー（NMB）溶液を2:1の体積比で混合し、水性染色試薬を調製します。SNYおよびニューメチレンブルー溶液の調製に関する詳細は、付属の書面プロトコルを参照してください。その後、ポリプロピレン製ビーカー内で、染色試薬と全血検体を1:1の体積比で混合し、マグネティックスターラーで2分間攪拌します。その後、室温でさらに10分間インキュベートし、溶液を1.99 mLのRPMI 1640 classic液体培地とともに5 mLのポリプロピレンチューブに入れます。

次に、染色した血液溶液 10 µL をRPMIに移し、体積比 1:200 にします。その後、溶液を30秒間ボルテックスし、染色した細胞溶液 10 ～ 100 µL をカバーガラス間またはマイクロ流体リザーバー内にピペットで分注します。次に、バキュームペンを用いて、検体をセンサーアレイの活性領域に配置します。

Lucasプラットフォームは、光電子センサアレイを利用して、レンズレス細胞ホログラムをデジタル的に記録します。この目的のために、電荷結合素子（CCD）が利用されています。波長可変の照明を実現するために、キセノンランプを備えたモノクロメーターと、標準グレードの溶融シリカファイバーが使用されます。このファイバーは、ファイバー束と、センサ表面から約5〜10 cm上の位置に配置された直径約100 µmのピンホールで構成されており、波長可変照明を可能にします。波長可変照明により、細胞のホログラフィック・シグネチャーを微調整できる柔軟なプラットフォームが提供され、複数の波長を統合してハイブリッド・デジタル・シグネチャーを合成することで、Lucas画像の信号対雑音比（S/N比）とコントラストを向上させることができます。

より詳細な特性評価を行うため、2枚のカバーガラスで挟まれた精度試料をセンサーアレイの有効領域に載せ、光源によって均一に照射します。不均一溶液中の各細胞または微小物体の回折ホログラムがセンサーアレイ上に到達し、ルーカス像が形成されます。取得されたルーカス回折画像は、独自に開発された判定アルゴリズムによって処理され、統計的な回折画像ライブラリを用いて、標的細胞または微小物体の自動的な特性評価および同定が行われます。

この図は、5 µm、10 µm、20 µmのポリスチレン製マイクロビーズと赤血球を含む不均一溶液を、一般的な40倍対物レンズで撮影した画像です。これらの粒子の3D形態、屈折率、および相互構成の複雑さは、すべて互いに異なります。

これらの特徴の一部は従来の顕微鏡で識別可能ですが、Lucasプラットフォームでは0.5 mm²未満という非常に限られた視野での観察となります。これらのマイクロ粒子はすべて、指紋のようにそれぞれ異なる固有のホログラフィックパターンを示します。したがって、2Dテクスチャに基づいて曖昧さなく特性を評価することが可能です。

Lucasは、10〜20 cm²にまで拡大可能な超広視野のモニタリングが可能です。これは標準的なレンズベースの顕微鏡よりも数桁広い範囲になります。こちらは、Lucasプラットフォームを用いて撮影した、染色済み全血サンプルの40倍対物レンズ画像です。

染色された白血球の内部特徴は、細胞核の屈折率と散乱特性を変化させることで効率的に変化します。個々の細胞の特有な回折パターンがセンサーアレイによって記録されます。これは、ポイントオブケア細胞計測および診断目的のための強力なツールとしてのLucasプラットフォームのもう一つの利点を示しています。

目的の細胞を迅速に特性評価するための完全自動プラットフォームとして、Lucas回折画像は独自に開発された判定ソフトウェアを用いてデジタル処理されます。この図では、赤血球とマイクロビーズの不均一な混合物がインターフェースによって処理されています。このアルゴリズムは、高密度領域だけでなく、3 µmビーズのような信号対雑音比の低い粒子に対しても堅牢な検出能を備えています。

Lucasカスタムインターフェースでの処理済み画像がここに示されています。このソフトウェアでは、センサーの画素サイズや照明波長などのさまざまな仕様を入力することが可能です。さらに、画像内の選択や細胞パターンの定義を行うことができます。

このデータに基づいてサンプルがカウントされ、マークされた画像がユーザーに表示されます。以上で、Lucasの高スループットプラットフォームを用いた細胞のイメージングおよび特性評価の方法について説明しました。この手順において、ここで実演した実験は、多種多様な細胞や微粒子に適用可能であることを覚えておくことが重要です。

また、これにより、不均一な溶液中の細胞に対して、超広視野かつハイスループットな細胞特性解析が可能になります。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。