有核細胞を循環の濃縮のための自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコル

血液から循環有核細胞を濃縮します。まず、気泡を除去するためにマイクロ流体デバイスを1回XPBSでプライミングし、血液サンプルのロード前に、脱イオン水および2%パラルデヒド含有XPBSをシリンジポンプを用いてデバイスに流します。その後、血液をマイクロ流体デバイスで処理して回収します。サンプルの後処理には、遠心分離と上清の除去が含まれます。

最後に、フローサイトメトリーを用いてサンプルを分析し、ファックスプロットを作成します。こんにちは。ウール大学バイオエンジニアリング学科のマイクロスケールバイオテクノロジー研究室のWilliam Whiteです。本日は、マイクロフルイディクスを用いた全血溶解による循環核細胞の濃縮手順をご紹介します。

当研究室では、白血球およびその他の循環有核細胞を、損失や活性化させることなく確実に濃縮し、さまざまな疾患過程における炎症を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、入口と出口のチャネルアクセス孔よりもわずかに直径の大きいアクセスチューブを装着します。

次に、マクロからミクロへのインターフェースを提供するため、各入口のチューブに30ゲージの注射針を取り付けます。続いて、1 mLのシリンジに1 XPBSを満たし、気泡が完全に除去されていることを確認します。シリンジを入口1に接続し、1 XPBSが入口2から流出するまで、シリンジを手でゆっくりと押し出します。

その後、すぐにオフィス用バインダークリップで入口2をクランプします。1×PBS溶液がマイクロ流体デバイスの出口ポートに到達するまで、シリンジを押し続けます。溶液が出口から流れ出たら、別のバインダークリップで出口チューブをクランプします。

1 mLシリンジをさらに押し続け、インレット3から1X PBSが流れ出たところで、3つ目のオフィスバインダークリップでインレット3ポートをクランプします。これでマイクロ流体デバイスのプライミングが完了しました。大型のHarvardシリンジポンプを用いてシリンジポンプの校正を開始し、直径設定を22.5 mm、流速を600 µL/minに設定します。

小型のHarvard製シリンジポンプを使用します。直径設定を4.61 millimetersに、流量を20 µL/minに設定してください。次に、50 mLコニカルチューブから直接溶液を吸引し、30 mLシリンジ1本に脱イオン水を満たします。

シリンジにラベルを貼ることを忘れずに、別の30 milliliterシリンジに2%パラホルムアルデヒド含有2 XPBS溶液を満たします。同様に、コニカルチューブから直接吸引し、シリンジにラベルを貼ります。次に、水が入ったシリンジを入口2に、2%パラホルムアルデヒド含有2 XPBSシリンジを入口3に接続します。その際、チューブ内やマイクロ流体デバイス内に気泡が混入していないことを確認してください。

次に、3本のシリンジがすべて接続された状態で、インレット2、インレット3、およびアウトレットチューブからクランプを取り除きます。2本の大型シリンジを大型Harvardシリンジポンプに取り付け、1 mLシリンジを小型Harvardシリンジポンプに取り付けます。アウトレットチューブを50 mLコニカル廃棄物回収チューブの中に配置します。

次に、30 mLシリンジを装着した大型のHarvardシリンジポンプの電源を入れ、1分間作動させます。装置内およびチューブ内に気泡や漏れがないことを確認してください。その後、小型のHarvardシリンジポンプの電源を入れ、こちらもさらに1分間作動させます。

気泡の混入と漏れの確認を行います。2分後にポンプを停止させます。これでマイクロ流体デバイスを血液サンプルに使用する準備が整ったため、付属の書面プロトコルに従って採取した分析用血液サンプルを、採取後1時間以内に使用します。

偽陽性の結果を避けるため、最初に採取した血液チューブは廃棄します。小型のHarvardシリンジポンプから1 mLシリンジを取り外し、1 mLシリンジにXPBSを注入して、シリンジの針内を満たします。気泡の混入を防ぐため、気泡が入らないように注意しながら、1 mLシリンジに50 µLのXPBSを満たしてください。

次に、シリンジに血液を0.5 milliliters充填します。PBSと血液が混ざり合わないよう、充填中はシリンジを垂直に保持してください。その後、血液の入ったシリンジを再びインレット1に接続します。

余分な液体を拭き取り、小型のHarvardシリンジポンプにシリンジを垂直に取り付けます。血液がチューブを通ってデバイス内に押し出されないように注意してください。出口チューブを廃棄チューブから外し、氷バケツに入れた清潔な50 milliliter遠心チューブの中に配置します。

まず、大型のHarvard製シリンジポンプのスイッチを入れて運転を開始し、1分間そのままにします。次に、小型のHarvard製シリンジポンプのスイッチを入れます。これにより、サンプルがアウトレットチューブから50 mL遠心チューブへと回収され始めます。

1 mLシリンジ内の血液サンプルをデバイス全体に完全に通過させます。これには約20分かかります。その後、両方のポンプを停止させます。ランが完了したら、回収したサンプルを室温で350 ×gにて5分間、ブレーキオフで遠心分離します。

ピペットチップを白いペレットの反対側に配置し、上清を除去します。白いペレットを乱さないように注意しながら、特に赤血球の残渣を含め、可能な限り多くの上清を除去してください。1% BSAおよび2%パラホルムアルデヒドを含む1 mLのフローバッファー（1 XPBS）を加え、ピペッティングによってサンプルを再懸濁します。

1.5 mLのマイクロ遠心チューブにサンプルを移し、4×gで5分間遠心分離します。室温にて、前回の遠心分離ステップと同様に、慎重に上清を除去します。最後に、1 mLのフローバッファーを加え、ボルテックスでサンプルを再懸濁させ、フローサイトメトリーによるサンプルの解析に進みます。

次に、マイクロ流体デバイスで濃縮した血液サンプルをフローサイトメトリーで解析し、得られた代表的な結果をファックスプロット形式で示します。溶血による濃縮の重要性は、赤血球がクラウド状に現れるファックスプロットから確認できます。マイクロ流体濃縮プロトコルによって生成されたスキャッタープロットは、血中に存在する有核細胞集団が明確に定義された、クリーンなスキャッタープロットとなっています。

赤色の領域はリンパ球を、緑色は単球を、青色は顆粒球を表し、紫色の領域はまだ特性が解明されていません。プロトコルで赤血球の残渣を除去しなかった場合、シアン色の領域に見られるように、faxプロットにイベントのクラスターが生じます。細胞集団は、個別のfaxプロットで可視化できます。

リンパ球はCD3およびCD4で、単球はCD14で、顆粒球はCD66bで維持されます。以上で、マイクロ流体血液溶解デバイスを用いた血液サンプルのセットアップと操作方法について説明しました。この手順を行う際は、PBSがデバイスに入る前に血液と混ざり合うのを防ぎ、またデバイスのチャネル内に気泡が混入するのを避けるため、血液サンプルを直ちに流すことが重要です。

以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。