Name: 有核細胞を循環の濃縮のための自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた末梢血からの循環有核細胞の自動濃縮法。赤血球溶解により細胞損失を最小限に抑え、高品質なサンプルを分離し、フローサイトメトリーで解析可能です。

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研究は、トランスレーショナルリサーチのウォレス時間コールター財団早いキャリア賞によってサポートされています。血液サンプルの収集とヘルプのためのティムアンドリュース、小児血液/腫瘍学、のおかげ。また博士はサムヴェルハウゼン、フローサイトメトリーコア、フローサイトメトリーのサンプルを実行するとヘルプのためのジェームズグラハムブラウンがんセンター、おかげで。

パート1。マイクロ流体デバイスの製作マイクロ流体の溶解装置のシリコンのマスターの金型はルイビルクリーンルームの大学での機器で標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して作成された[1]。 AutoCADは（オートデスク株式会社、サンラファエル、カリフォルニア州）チャネルの負のレプリカを作成する（輝いているイメージング、コロラドスプリングズ、コロラド州）透明度のマスクを生成するために使用されていました。マイクロ流体の溶解装置は、エラストマー、ポリ（ジメチルシロキサン）（ダウコーニング、ミッドランド、MI PDMS）とソフトリソグラフィ技術を用いてシリコンマスター金型から製造された。複製されたチャネルを持つエラストマーがリリースされ、チャネルのアクセスホールは、20ゲージの針（スモールパーツ、ミラマー、フロリダ州。）でパンチされた。 PDMSのウェハは、不可逆的に酸素プラズマを介してスライドガラスに接着し、実験のためにテストされています。 パート2。溶解装置を実行するためのプロトコルマイクロ流体デバイスを作製し、テストされた後、赤血球溶解の実験では、開始する準備が整います。次のセクションでは、マイクロ流体デバイスのためのプロトコル。 2.1サンプル集<ol><li> two 2ミリリットル緑トップvaccutainersの抗凝固剤としてヘパリンを持つ患者の前腕の静脈に、肘正中皮静脈から血液サンプルの4ミリリットルを収集する。 </li><li>それが外れ成熟した内皮細胞を（偽陽性）が含まれているとして、最初の2 mlチューブを捨てる。 </li><li>上下に回すことで血液とヘパリンを混合する第2のチューブを再懸濁し、氷上に即座に保存。 </li><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブへの血液の1 mlを入れる。 （コレクションの一時間以内）に血液サンプルを処理します。 </li></ol> PBS 2.2総理マイクロ流体デバイス<ol><li>ガラスに結合マイクロ流体デバイスを取得します。入口と出口で少し大きめの直径（図1）の圧入アクセスチューブ（スモールパーツ、ミラマー、フロリダ州）。 </li><li>ミクロマクロをインターフェイスに提供し、入口の各チューブに30ゲージの注射針を（小さな部品、ミラマー、フロリダ州）に取り付けます。 </li><li> 1X PBSで1 mlのシリンジを記入し、シリンジの針をフリックで気泡を取り除くために確認してください。マイクロ流体デバイスの入口1にPBS -ロードされた1 mlのシリンジを接続してください。解決策は、入口2から流れ出すまで、手で軽く1X PBSを含む注射器を押し込み、すぐに標準的なオフィスバインダークリップで口2をクランプ</li><li>流体がマイクロ流体デバイスの出口ポートに到達するまで、1X PBSを押し続けます。解決策は、コンセントから流れ出すと、別のバインダークリップでアウトレットチューブをクランプする。 </li><li> 1X PBSが口3から流出するまで、1 mlのシリンジを押し続けると、別のOfficeバインダークリップで口3ポートをクランプする。マイクロ流体デバイスは、今や完全に準備されている。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1の各ソリューションとコンセントのための入口を示す装置の概略図。 シリンジポンプとソリューション2.3準備<ol><li>ポンプのキャリブレーションを行うには、次の手順を実行します。 <ol class="lalpha"><li>大規模なハーバードのシリンジポンプ（ハーバード大学、PHD 2000分の22の部品番号702000）の場合：22.5ミリメートル、流量600μL/ minのためにDiameterコンフィグレーションを設定します。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプ（ハーバード大学、ピコプラス部品番号702213）の場合：4.61ミリメートル、流速20μL/ minにDiameterコンフィグレーションを設定します。 </li></ol></li><li>滅菌脱イオン水を使用すると、ワン30mlのシリンジを埋める。これは、50 mlコニカルチューブから直接解決策を引き出すことによって達成することができます。 （注射器にラベルを付ける） </li><li>手順9で説明した手順を使用して、2Xリン酸緩衝-生理食塩水（PBS）、2％パラホルムアルデヒド（PFA）で2 30mlのシリンジを埋める。 （注射器にラベルを付ける） </li><li>手順9で説明した手順を使用して、15 mlコニカルチューブに格納されたアリコートから1X PBSで1 mlの注射器を埋める。 </li><li>入口2と入口3〜30ミリリットル2X PBSのシリンジに30 mLの脱イオン水のシリンジを接続し（チューブまたはマイクロ流体デバイスで使用するドンtのトラップの気泡を確認してください）​​。入口2と3とアウトレットチューブからクランプを外します。入口1に1X PBSを1mlのシリンジを接続してください。 、液体を注射器の針を充填シリンジを接続し、気泡を除去するために注射針をフリックで気泡を導入することは避けてください。 </li></ol> 2.4赤血球溶解<ol><li>以下に概説されるよう適切なハーバードポンプのシリンジのすべてを設定します。 <ol class="lalpha"><li>大規模なハーバードのシリンジポンプに一緒に2つの30 mLシリンジ（1つ滅菌、脱イオン水と2X PBS、2％PFAで他を含む）を設定します。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプに1 mlの注射器を（1X PBSを含む）を設定します。 </li><li>廃棄物のコレクターでアウトレットチューブを置きます（Wラベル付けされている50 mlコニカルチューブASTE）。 </li></ol></li><li>大規模なハーバードのシリンジポンプ（30 mLシリンジ付き）をオンにして、それを1分間実行してみましょう。 （は泡とデバイスまたはチューブのない漏れがないことを確認してください）​​。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプの電源を入れ、追加分のために実行してみましょう。 （は泡とデバイスまたはチューブのない漏れがないことを確認してください）​​。ポンプを停止します。マイクロ流体デバイスは使用可能な状態になります。 </li><li>小さなハーバードのシリンジポンプから1X PBSを含む1 mlのシリンジを取り外します。 </li><li>血液サンプルを取得した後、気泡をトラップすることなく、滅菌1X PBSの0.05 mlを1 mlの注射器を埋める。次に、エッペンドルフチュー​​ブから得られた血液0.5mlをシリンジを埋める。 （1 mlの注射器は血液と1 × PBS緩衝液の0.55 mlの最終容量が含まれます。） 注 ：血液、0.05 mlのPBSの混合を避けるために充填しながら注射器を垂直に保つ。 </li><li>入口1に血液を含有する注射器を接続し、小さなハーバードのシリンジポンプ（シリンジをポンプに垂直マウントされている）上（装置にチューブを介して血液を押し避ける）慎重にシリンジをマウントします。 </li><li>廃液チューブからアウトレットチューブを取り外し、その場所に新しい50 ml遠心チューブに入れ、氷のバケツの上に置いてください。 </li><li>最初の大ハーバードのシリンジポンプのスイッチを入れ、それが1分間実行してみましょう。 50 ml遠心チューブにコンセントからのサンプルの収集を開始します。 </li><li>小さなハーバードシリンジポンプのスイッチを入れる。 </li><li> 1mlの注射器で血液サンプルが完全にデバイスを通過するとしたら、両方のポンプを停止する。これは約20分かかります。 </li><li>ブレーキオフ、室温で350 xgで5分間採取した試料を遠心分離します。 </li><li>白色ペレットの反対側にピペットチップを配置することによって、上清を取り除きます。ホワイトペレットを乱すことなく、可能な限り、特に赤血球の破片上清をできるだけ取り除く。 </li><li>上下にピペッティングして流れの緩衝液1ml（1X PBS、1％BSA [ウシ血清アルブミン]、2％PFA）でサンプルを再懸濁します。 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにサンプルを移す。 </li><li>室温で4 × gで5分間遠採取されたサンプルを。上清を除去する前と同じ精度を使用してください。 </li><li>ボルテックスで流れの緩衝液1mlでサンプルを再懸濁します。 </li></ol>フローサイトメトリー分析用2.5準備<ol><li>フローサイトメトリーを用いたサンプルの分析のために、フローサイトメトリーチューブにサンプルの100μlを加える。 </li><li>試料100μlに指定された抗体を（正しい濃度を確保する）を追加。 </li><li>サンプルは40℃で30分間インキュベートすることができます</li><li>フローサイトメトリーの前に流れの緩衝液で2回洗浄する。洗浄工程は、フローバッファを250μlを加えるボルテックス、350 xgで5分間遠心分離し、フローサイトメトリーチューブの一つの流体の回転と上清除去を含みます。 </li><li>フローバッファ250μlのでペレットを再懸濁します。サンプルは、フローサイトメトリーによって分析の準備ができています。 </li></ol>代表的な結果全血は、赤血球と豊か循環有核細胞（のCNC）からなくし、マイクロ流体の溶解装置と後処理のプロトコルを介して実行されています。理想的な結果は、独立したCNCの人口を持つクリーンなフローサイトメトリーの散布図が得られます。図2と図3の下に表示さ溶血することなく、前方散乱光（FSC）対側方散乱（SSC）の光のような軸を持つマイクロ流体プロトコルによる溶血による全血サンプルの散布図の比較です。それは、マイクロ流体濃縮プロトコルがクリーンフローサイトメトリーの散布図を得るために必要であることが分かる。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。FSCとSSCの軸を持つ赤血球溶解せずに全血サンプルのフローサイトメトリーの散布図。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。FSCとSSCの軸を持つ集団で標識されたマイクロ流体溶血と核細胞を循環のフローサイトメトリーの散布図。リージョン1（赤）は顆粒球を表すリージョン3（青）、領域2（緑）が単球を表し、リンパ球を表しており、リージョン4（紫）が特徴とされていない。 ときに必要なプロトコルのピペットによる赤血球の破片の除去も重要である。下の図4には、赤血球の破片の余剰を示す散布図である。図2のような散布図を曇らせるではありませんが、一つにはデータ分析の赤血球破片のために追加されたイベントを考慮する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> クラスタとして見られる赤血球の破片を描いた図4。フローサイトメトリー散布図、地域5（シアン）のイベントの。 特定の抗体の表現型マーカーの染色細胞はまた、特徴的な結果を生成します。リンパ球、単球、顆粒球：以下の図では3つの異なる白血球集団のための抗体の表現型の汚れです。図5は、軸CD3とCD4にプロットされたリンパ球集団を表しています。単球および顆粒球は、それぞれ、FSCに対するCD14とCD66bのような軸を持つ6〜7図に示されています。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。フローサイトメトリーの散布図は、CD3とCD4の軸を持つリンパ球を描いた。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。フローサイトメトリーの散布図は、FSCとCD14の軸と単球を描いた。 <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。フローサイトメトリーの散布図は、FSCとCD66b軸を持つ顆粒球を描いた。

<ol><li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+%28SCD%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li>
<li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li>
</ol>

自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコルが報告されている。プロトコルの中で注目に値する重要な手順は次のとおりです。セクションP.2.1で、それはサンプルが外れ成熟した内皮細胞が含まれている偽陽性として機能するように収集された最初の血液バイアルを廃棄することが重要です。また、コレクションの1時間以内に血液サンプルを実行することを確認してください。プライミングセクションP.2.2のマイクロ流体デバイスを、それは最初に泡を取り除くことが重要です。さらに、一つのプロトコルを通して針に新しい注射器を取り付ける際に気泡を導入することは避けてください。セクションP.2.4の血1 mlシリンジに充填する際、一つは2つの溶液の混合を避けるために注射器を垂直に保ちながら、すべての、最初の1X PBSと血を忘れずに追加する必要があります。血液サンプルを押すシリンジポンプを開始する前に、システムがフルスピードになるように大規模なシリンジポンプが稼動していることを確認してください。サンプルは、デバイスを介して実行が完了し、遠心分離された後、慎重に白いペレットが剥がれないように、赤血球の破片を含めて、上清をできるだけ取り除く。最後に、セクションP.2.5で抗体の...

有核細胞を循環の濃縮のための自動化されたマイクロ流体血液溶解プロトコル

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

この報告書では自動化されたマイクロ流体血液溶解装置用プロトコルが詳しく説明されています。白血球と内皮細胞を含む有核細胞（のCNC）、循環、個々の免疫状態に関する更新状況のための理想的なプラットフォームを提供します。マイクロ流体のプロトコルは、選択的な細胞の損失と、ユーザーが介在するステップによる試料調製の変動なしでCNCの濃縮が可能になります。簡単に言えば、プロトコルは、デバイス作製、サンプルの収集、デバイスのセットアップ、およびマイクロ流体チャンバーを介して血液を実行しているが含まれています。デバイス内で全血は急速に50ミクロン× 150ミクロンマイクロ流体チャネル内の約10秒間、脱イオン水と混合される。この時点ではスパンの赤血球は低張条件により可溶化されています。チャネルの底部のヘリンボーン構造が完全に混合し、一定の環境への細胞の露出を確認してください。残りの細胞は、装置の出口で等張条件に戻さ2％のパラホルムアルデヒドを用いて固定し、CNCのから赤血球残骸を分離する遠心分離し、フローサイトメトリーによる染色と分析のために流れの緩衝液に懸濁している。結果は保存されているCNC人口クリーンフローサイトメトリーの散布図を示す。このデバイスとプロトコルの重要性は、CNCの個体群の解析による疾患の病因の研究と理解に来る。したがって、自動化、有効性、およびマイクロ流体プロトコルのシンプルさが実証されています。

自動化されたマイクロ流体デバイスは、セルの損失なしで高品質のサンプルの分離を確実に溶血を経由して末梢血からの有核細胞の濃縮を循環させるために開発されました。

本レポートでは、自動化マイクロ流体血液溶血装置のプロトコルについて詳細に解説します。白血球などの循環有核細胞（CNC）を含む...

血液から循環有核細胞を濃縮します。まず、気泡を除去するためにマイクロ流体デバイスを1回XPBSでプライミングし、血液サンプルのロード前に、脱イオン水および2%パラルデヒド含有XPBSをシリンジポンプを用いてデバイスに流します。その後、血液をマイクロ流体デバイスで処理して回収します。サンプルの後処理には、遠心分離と上清の除去が含まれます。最後に、フローサイトメトリーを用いてサンプルを分析し、ファックスプロットを作成します。こんにちは。ウール大学バイオエンジニアリング学科のマイクロスケールバイオテクノロジー研究室のWilliam Whiteです。本日は、マイクロフルイディクスを用いた全血溶解による循環核細胞の濃縮手順をご紹介します。当研究室では、白血球およびその他の循環有核細胞を、損失や活性化させることなく確実に濃縮し、さまざまな疾患過程における炎症を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、入口と出口のチャネルアクセス孔よりもわずかに直径の大きいアクセスチューブを装着します。次に、マクロからミクロへのインターフェースを提供するため、各入口のチューブに30ゲージの注射針を取り付けます。続いて、1 mLのシリンジに1 XPBSを満たし、気泡が完全に除去されていることを確認します。シリンジを入口1に接続し、1 XPBSが入口2から流出するまで、シリンジを手でゆっくりと押し出します。その後、すぐにオフィス用バインダークリップで入口2をクランプします。1×PBS溶液がマイクロ流体デバイスの出口ポートに到達するまで、シリンジを押し続けます。溶液が出口から流れ出たら、別のバインダークリップで出口チューブをクランプします。1 mLシリンジをさらに押し続け、インレット3から1X PBSが流れ出たところで、3つ目のオフィスバインダークリップでインレット3ポートをクランプします。これでマイクロ流体デバイスのプライミングが完了しました。大型のHarvardシリンジポンプを用いてシリンジポンプの校正を開始し、直径設定を22.5 mm、流速を600 µL/minに設定します。小型のHarvard製シリンジポンプを使用します。直径設定を4.61 millimetersに、流量を20 µL/minに設定してください。次に、50 mLコニカルチューブから直接溶液を吸引し、30 mLシリンジ1本に脱イオン水を満たします。シリンジにラベルを貼ることを忘れずに、別の30 milliliterシリンジに2%パラホルムアルデヒド含有2 XPBS溶液を満たします。同様に、コニカルチューブから直接吸引し、シリンジにラベルを貼ります。次に、水が入ったシリンジを入口2に、2%パラホルムアルデヒド含有2 XPBSシリンジを入口3に接続します。その際、チューブ内やマイクロ流体デバイス内に気泡が混入していないことを確認してください。次に、3本のシリンジがすべて接続された状態で、インレット2、インレット3、およびアウトレットチューブからクランプを取り除きます。2本の大型シリンジを大型Harvardシリンジポンプに取り付け、1 mLシリンジを小型Harvardシリンジポンプに取り付けます。アウトレットチューブを50 mLコニカル廃棄物回収チューブの中に配置します。次に、30 mLシリンジを装着した大型のHarvardシリンジポンプの電源を入れ、1分間作動させます。装置内およびチューブ内に気泡や漏れがないことを確認してください。その後、小型のHarvardシリンジポンプの電源を入れ、こちらもさらに1分間作動させます。気泡の混入と漏れの確認を行います。2分後にポンプを停止させます。これでマイクロ流体デバイスを血液サンプルに使用する準備が整ったため、付属の書面プロトコルに従って採取した分析用血液サンプルを、採取後1時間以内に使用します。偽陽性の結果を避けるため、最初に採取した血液チューブは廃棄します。小型のHarvardシリンジポンプから1 mLシリンジを取り外し、1 mLシリンジにXPBSを注入して、シリンジの針内を満たします。気泡の混入を防ぐため、気泡が入らないように注意しながら、1 mLシリンジに50 µLのXPBSを満たしてください。次に、シリンジに血液を0.5 milliliters充填します。PBSと血液が混ざり合わないよう、充填中はシリンジを垂直に保持してください。その後、血液の入ったシリンジを再びインレット1に接続します。余分な液体を拭き取り、小型のHarvardシリンジポンプにシリンジを垂直に取り付けます。血液がチューブを通ってデバイス内に押し出されないように注意してください。出口チューブを廃棄チューブから外し、氷バケツに入れた清潔な50 milliliter遠心チューブの中に配置します。まず、大型のHarvard製シリンジポンプのスイッチを入れて運転を開始し、1分間そのままにします。次に、小型のHarvard製シリンジポンプのスイッチを入れます。これにより、サンプルがアウトレットチューブから50 mL遠心チューブへと回収され始めます。1 mLシリンジ内の血液サンプルをデバイス全体に完全に通過させます。これには約20分かかります。その後、両方のポンプを停止させます。ランが完了したら、回収したサンプルを室温で350 ×gにて5分間、ブレーキオフで遠心分離します。ピペットチップを白いペレットの反対側に配置し、上清を除去します。白いペレットを乱さないように注意しながら、特に赤血球の残渣を含め、可能な限り多くの上清を除去してください。1% BSAおよび2%パラホルムアルデヒドを含む1 mLのフローバッファー（1 XPBS）を加え、ピペッティングによってサンプルを再懸濁します。1.5 mLのマイクロ遠心チューブにサンプルを移し、4×gで5分間遠心分離します。室温にて、前回の遠心分離ステップと同様に、慎重に上清を除去します。最後に、1 mLのフローバッファーを加え、ボルテックスでサンプルを再懸濁させ、フローサイトメトリーによるサンプルの解析に進みます。次に、マイクロ流体デバイスで濃縮した血液サンプルをフローサイトメトリーで解析し、得られた代表的な結果をファックスプロット形式で示します。溶血による濃縮の重要性は、赤血球がクラウド状に現れるファックスプロットから確認できます。マイクロ流体濃縮プロトコルによって生成されたスキャッタープロットは、血中に存在する有核細胞集団が明確に定義された、クリーンなスキャッタープロットとなっています。赤色の領域はリンパ球を、緑色は単球を、青色は顆粒球を表し、紫色の領域はまだ特性が解明されていません。プロトコルで赤血球の残渣を除去しなかった場合、シアン色の領域に見られるように、faxプロットにイベントのクラスターが生じます。細胞集団は、個別のfaxプロットで可視化できます。リンパ球はCD3およびCD4で、単球はCD14で、顆粒球はCD66bで維持されます。以上で、マイクロ流体血液溶解デバイスを用いた血液サンプルのセットアップと操作方法について説明しました。この手順を行う際は、PBSがデバイスに入る前に血液と混ざり合うのを防ぎ、またデバイスのチャネル内に気泡が混入するのを避けるため、血液サンプルを直ちに流すことが重要です。以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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