Name: マウスの錐体光受容体からの単一細胞サクション録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: 学ぶマウス網膜錐体光受容体の単一細胞サクション録音法。暗所適応したマウスの眼球を摘出し、背側網膜を薄切して電極で細胞応答を記録する。視覚神経科学における光受容体機能解析に有用である。

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失明とEY 02687（ワシントン大学眼科視覚科学の部）防止のための研究から失明、NIHの助成金EY 019312、および無制限の助成金を防止するための研究からキャリア開発賞でサポートされています。

電極を作る<ol><li>マイクロピペットプラーを使用して、記録電極を作成し、顕微鏡下で加熱フィラメントと電極を磨く。マウスの錐体単一細胞吸引録音の場合、電極先端の内径は6-7μm程度である。 </li><li>参照電極を準備する。蒸留水で1％の寒天を量る。湯浴の寒天液を溶かす。シリンジを用いて1％の寒天をガラスピペットを（L = 100 mmの外径/ ID = 1/0.75 mm）を記入します。 10分間室温で寒天を固める。 </li><li>ダイヤモンドナイフを使用して半分にピペットをカット。 </li><li> 4℃で少なくとも24時間は、基準溶液中での参照電極を浸し℃に</li></ol>実験のセットアップ<ol start="5"><li>暗い晩黒ケージでマウスを適応させる。 </li><li> 100 mLの標準液と1リットルの灌流液を（下記参照）を準備し、ソリューションをフィルタリングする。 </li><li> 0.1％BSA、20 mLの標準液中の10mMグルコースを溶解する。 </li><li>光度計を用いた光刺激装置の光強度を校正します。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上で録音室をマウントします。 </li><li> 95％O 2 / 5％CO 2のバブル灌流液は、CO 2の溶解度を高めるために40 ° Cの水浴中でインキュベートする。解決策は、ボトル36から38に加温し、セラミック抵抗を通過する記録チャンバー℃に流れるヒーターは、理想的に顕微鏡の段階で、可能な限りの記録室の近くに配置する必要があります。 </li><li> 1〜1.5程度mL /分の流量のフローレギュレータを調整します。 </li><li>参照溶液と記録電極を埋める。電極ホルダに電極を挿入します。電極内に気泡がないことを確認します。アンプのヘッドステージ上にホルダーをマウントします。部分的に電極ホルダーのサイドポートにミネラルオイルを充填したチューブを接続することによって構築されている吸引装置、にホルダーを接続してください。チューブのもう一方の端は口の中でどの圧力を適用することができるため、鉱物油の小さなタンクに接続されている。 </li><li>ヘッドステージの他の極に参照電極を接続してください。参照電極に熱カップル（TC）をバインドします。電極とTCのヒントが接近して温度の読み取りが可能な限り細胞に近いとみなされるようになっていることを確認します。 </li><li>電極を視覚化する赤外線照明の電源を入れます。電極は、モニターに接続されている赤外線カメラによって表示されます。視野上で、マイクロマニピュレータを用いてモニターの中心電極画像。 </li><li>記録電極の先端への参照電極の先端に近い（2-4 mm）の位置を調整します。 </li><li>溶液の温度が36から38℃程度になるようにヒータのDC電圧を調整する</li><li>通常、900kΩの約、記録電極の抵抗をチェックするためにシールのテストを実行します。 </li></ol>マウスの網膜を分離<ol start="18"><li>暗赤色灯の下で、CO 2と頚椎脱臼で暗順応マウスを安楽死させる。やや強膜の最も背点を焼灼による溶銑のトーチの先端を使って眼球をマーク。はさみを使って眼球を摘出。後続のすべての手順は、赤外光の下で実行されます。 </li><li>赤外線照明と画像コンバータと顕微鏡下での眼球を二等分する。 </li><li>角膜とレンズを取り外します。できるだけ硝子体をできるだけ多く削除します。 </li><li> M -錐体の応答を記録するには、焼灼マークから判断してかみそりの刃でアイカップ4の腹側部分を削除してください。 </li><li>色素上皮層から網膜ピール。 </li><li>網膜を平らに1〜2 mLの標準液で満たされたペトリ皿の底の上に置きます。 </li><li>カミソリの刃を使用して、小さな薄い部分に網膜をスライスし、純酸素で飽和遮光ボックスの準備をインキュベートする。 </li></ol>レコーディング<ol start="25"><li>一時的にヒーターの電源を切ります。乾燥室を防ぐためにバイパス管に血流の流れを切り替える。 </li><li>キムワイプ組織片を用いてチャンバー内の溶液のほとんどを排出します。ガラスピペットを使用して録音室に網膜の懸濁液を移す。 </li><li>網膜のスライスが落ち着くまで、約2分間待ちます。背面の血流を切り替えます。ヒーターの電源を入れます。 </li><li>準備を視覚化する赤外線照明の電源を入れます。突き出光受容体の外側のセグメントでチャンバーの上に横たわっ網膜の部分のための検索（例の図を参照）。吸引によって電極に軽く内側のセグメントを描画します。この構成では、いくつかの核と内側のセグメントは、電極に描画する必要があります。円錐内部セグメントが電極内にあるかどうかと、セルが治癒されているかどうかをテストするために明るいフラッシュに光応答を記録汝、応答速度と振幅によって判断する。 </li><li>電極の内側のセグメントを保持するための電極の先端にわずかな負圧を適用するには、ミネラルの貯水池を下ろします。 </li><li>薄暗いから明るい強度への記録テストフラッシュ応答良好な細胞が発見されれば。テストの点滅は、校正済み光刺激装置5から提供されています。フラッシュの強度と波長はそれぞれ、NDフィルターと狭帯域の干渉フィルターのセットによって制御されています。テスト発光持続時間（20ミリ）は、コンピュータ主導のシャッターで制御されます。 </li></ol>ソリューション<ol><li>マウスの灌流液：112.5 mMのNaCl、3.6 mMの塩化カリウム、2.4 mMのMgCl 2、1.2 mMのCaCl 2を 、10mMのHEPES（pH7.4）を、20mMのNaHCO 3を 、3 mMのコハク酸ナトリウム、0.5mMのナトリウムグルタミン酸、0.02mMのEDTA、および10mMのグルコース。 </li><li>マウスの記録電極液：140 mMのNaCl、3.6 mMの塩化カリウム、2.4 mMのMgCl 2、1.2 mMのCaCl 2を 、3 mMのHEPES（pH7.4）に、0.02mMのEDTA。 </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

視細胞から単一細胞吸引の記録は3年前に開発されました。それは細胞膜を貫通することなく、光刺激により誘発される膜貫通電流変化を記録することを可能にします。が高いために細胞間接着のために、それは両生類の網膜のようなマウスの網膜から健康なシングルロッドとコーンを分離することは困難であり、それは低い割合（3％）と小さいサイズのため、個々の錐体を見つけるのは難しいです。内側のセグメントイン（IS -で）記録方式は、コーンが含まれている場合がありますそのうち、いくつかの光受容体の内側のセグメントから現在記録することによって、この困難を克服しています。野生型マウスでは、応答がロッドとコーンの組み合わせでなければなりません。安定した背景光はロッドの応答を抑制するために使用することができます。網膜、彼らはGタンパク質トランスデューシン6のα-サブユニットを欠くようにロッドは、光刺激に反応できないような-このビデオでは、我々はTα- /を使用する。そのため、光応答は円錐からです。

マウスの錐体光受容体からの単一細胞サクション録音

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

網膜の桿体と錐体光受容体は、光検出のための責任があります。暗闇の中で、外側のセグメントにおける環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネルが開いていて、陽イオンが細胞を脱分極、膜を横切って内側に着実に流れるようになります。光露光では、CNGチャネル、ブロック内向きの陽イオン電流の流れ、および従って細胞過分極の結果の閉鎖をトリガします。光受容体の極性に基づいて、吸引の記録方式は、古典的パッチクランプ法とは異なり、原形質膜を貫通する必要がない、1970年代に開発された<sup&gt; 1</sup&gt;。細胞外液を満たしたしっかりフィットガラスピペットに外側のセグメントを描画するテスト - ストロボ調光時に個々の細胞の電流変化を記録することができます。しかし、この十分に確立された&quot;外側のセグメントイン（OS - IN）&quot;吸引録音ため、マウスの網膜の錐体の割合が低い（3％）とコーンの同定に関する問題点から、マウスのコーンの録音には適していません外側のセグメント。最近、内側セグメントの（IS -の）記録の設定は、録音のピペットに内側のセグメント/光受容体の核領域を描画するために開発された<sup&gt; 2,3</sup&gt;。このビデオでは、我々は単一細胞吸引電極を用いて個々のマウスのコーンphotoresponsesから録音する方法を示します。

我々は、吸引電極を用いてマウスのシングルコーンからフラッシュの応答を記録する方法を説明します。

網膜の桿体および錐体光受容細胞は、光検出を担っています。暗所では、外節にある環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネルが...

このビデオでは、マウス網膜の摘出と、それに続く円錐細胞の単一細胞吸引記録の取得について実演します。安楽死させ、暗順応させたマウスの眼球を、暗い赤色光の下で背側を焼灼し、核を除去します。その後、眼球を半球状に切断します。赤道線に沿って、角膜と眼球の腹側部分を取り除きます。その後、背側網膜を色素上皮層から分離し、カミソリを用いて小さく薄い断片に切り分けます。切り分けた網膜の断片を、顕微鏡ステージに適合する記録チャンバー内に配置します。いくつかの光受容細胞体が記録電極内に吸い込まれます。錐体光受容細胞が電極内に吸い込まれると、強力なテストフラッシュによって4 pA以上の振幅を持つ光応答が誘発されます。こんにちは。私はセントルイスのワシントン大学眼科学および視覚科学部のMir Kops博士の研究室のJinです。本日は、単一のM錐体光受容細胞から光応答を記録する手順をご紹介します。当研究室では、日中の視覚を司る光受容細胞である哺乳類の錐体の適応特性を研究するために、この手法を用いています。それでは、始めていきましょう。記録の1日前、実験環境を暗室にします。マウスを遮光ケージに一晩入れて暗順応させます。複合顕微鏡下で、マイクロピペットプラーを用いてボロウシリケートガラス管から記録電極を作製します。加熱フィラメントを用いて火成（ファイアリング）します。各電極の先端を研磨して滑らかにし、開口部を目的の直径まで細くします。マウスの円錐形シングルセル吸引電極の場合、電極先端の内径は約6〜7 µmにする必要があります。蒸留水を用いて1%アガロース溶液を調製します。この溶液を沸騰水に入れ、アガロースを溶解させます。アガロースが溶解したら、溶液をシリンジに移し、ガラスピペットに充填します。参照電極を調製するために、室温で10分間静置して凝固させます。アガロースが凝固した後、ダイヤモンドナイフを用いて各ピペットを半分に切り、2本の参照電極を作成します。参照電極を参照溶液を満たしたシンチレーションバイアルに入れ、溶液がアガロースゲルに浸透するように、4°Cで少なくとも24時間浸漬させます。参照電極は、作製日から最大3ヶ月間使用可能です。使用済みの電極は、実験後に廃棄します。記録システムは、振動ノイズを最小限に抑えるためのエアサスペンションテーブル上に設置された倒立顕微鏡と、電磁ノイズを最小限に抑えるためのベリティケージによる遮蔽で構成されています。記録用電極の配置には、電動マイクロマニピュレーターを使用します。光刺激装置は、タングステンフィラメント、コンピュータ制御のシャッター、および波長と光強度を制御するための光学フィルターで構成されています。個々の光受容細胞からの膜電流の検出には、パッチクランプアンプを使用します。記録の間、組織を常に灌流させます。調製した灌流バッファー1リットルを、記録システムの近くにある40°Cのウォーターバスに入れます。次に、チューブを用いて灌流バッファーを95%酸素および5%二酸化炭素に接続し、継続的にバブリングさせます。フォトメーターを用いて、光学刺激装置からの減衰していない光出力を測定します。フォトメーターの検出器は、顕微鏡ステージ上の試料を配置する平面に設置してください。次に、マイクロワットで表示された読み取り値を、1回のフラッシュあたりの光子数を推定するために、1平方マイクロメートルあたり1秒あたりの光子数に変換します。この際、ニュートラルデンシティフィルターによる光の減衰を考慮してください。非減衰光の出力測定が完了したら、フォトメーターをステージから取り外し、実験に使用する記録チャンバーを倒立顕微鏡のステージに設置します。チューブを用いて、灌流液ボトルをレギュレーターバルブ経由で記録チャンバーに接続します。この際、チューブを加熱抵抗器に通してください。加熱抵抗器が記録室の直前に配置されていることを確認します。次に、レギュレーターバルブから記録室までバイパスチューブを接続します。流量調節バルブを開き、流速を1〜1.5 mL/minに調整して灌流を開始します。灌流液は重力により記録チャンバーから回収フラスコへと排出されます。鈍針付きシリンジを使用して、電極ホルダーに参照液を満たします。マイクロフィルシリンジの針を用いて、記録電極に参照液を満たしてフラッシュし、電極内に気泡がないことを確認してください。参照電極を電極ホルダーに挿入し、アンプヘッドステージの参照極に接続します。ゴムリングを使用して、熱電対を参照電極に固定してください。電極と熱電対の先端を互いに近づけて配置し、細胞の可能な限り近くで温度測定が行われるようにします。次に、記録電極を電極ホルダーに挿入し、ホルダーをアンプのヘッドステージに取り付けます。チューブを用いて、ミネラルオイルを入れた小さなリザーバーを電極ホルダーのサイドポートに接続します。リザーバーに接続されたチューブを口で軽く吸引することで、細胞を電極内に引き込みます。コンピュータソフトウェアを使用して、光刺激装置のシャッターを1つ開きます。顕微鏡ステージ上のテストフラッシュのビーム領域を可視化するため、顕微鏡の焦点を記録チャンバーの底部に合わせます。マイクロマニピュレーターを用いて、電極をテストフラッシュビーム領域の中心に移動させます。参照電極を記録電極の先端に近づけて配置します。ヒーターの電圧を調整し、記録室内の溶液温度が約 36 to 38 °C になるようにします。シールテスト（プリセットされた電流振幅に対する電圧を測定し、抵抗値を算出するもの）を行い、記録電極の抵抗値を確認します。通常、抵抗値は約 900 kΩ となります。シールテストにより、記録電極または参照電極内の気泡の有無、あるいは記録電極のチップサイズの不適切さを検出できます。シールテストは、データ収集プログラムのclamp Xによって制御されます。抵抗値はコンピュータの画面に表示されます。抵抗値が低すぎる（500 kilo ohms未満）場合は、電極のチップが大きすぎる可能性が高いため、新しい電極を装着する必要があります。抵抗値が1 mΩより高い場合は、電極内に気泡が存在しているか、あるいは先端が細すぎることが考えられるため、電極の洗浄または交換が必要です。記録装置の準備が整ったら、暗い赤色灯の下で実験用の網膜スライスを調製します。安楽死させた暗順応マウスの各眼球の最背点において、加熱した解剖針の先端を用いて強膜を焼灼します。その後、ハサミを用いて眼球を摘出します。鈍端ピンセットを使用して、赤外線照明と赤外線イメージコンバーターを備えた解剖顕微鏡に眼球を移します。以降のすべての解剖操作は赤外線光の下で行います。次にマイクロシザーを用い、焼灼点を除いた赤道線に沿って眼球を切開します。鋭いピンセットを用いて水晶体を取り除きます。次に、焼灼点を基準として、可能な限り多くの硝子体を除去します。カミソリを用いて、眼杯の腹側部分を取り除きます。次に角膜を取り除きます。続いて、ピンセットを用いて色素上皮層から背側網膜を剥離します。その後、10 mMのグルコース標準溶液（0.1%BSA含有）を1〜2 mL満たした新しいペトリ皿の底に、受容体側を上にして網膜を配置し、カミソリで網膜を軽く押さえて平坦にします。網膜を小さく薄い破片にスライスします。次に、記録室に網膜スライスを投入する前に、純酸素で常に飽和させたライトタイプボックス内で試料をインキュベートします。ヒーターは一時的にオフにします。灌流フローをバイパスチューブに切り替えます。次に、キムワイプを使用して、チャンバーから溶液の大部分を排出します。赤外線照明を点灯させます。インキュベーターから網膜懸濁液を取り出し、スライスを記録チャンバーに転送します。口径の広い転送ピペットを使用し、スライスを2分間静置させます。網膜スライスが静置された後、直接灌流とヒーターを再びオンに切り替えます。光受容体の外節が突出している網膜の一部を特定します。マウスサクションを用いて、記録電極の先端を網膜の外顆粒層の上に配置します。細胞が電極内に引き込まれるようにして、数個の光受容体細胞体を電極内にゆっくりと吸引します。500 nmのテストフラッシュを20 ms間照射します。この光によって誘発された光受容体を流れる電流の変化が、テストフラッシュ応答となります。健全な錐体細胞では、最大応答振幅として4～7 pA（またはpico MPIs）が検出されます。減衰させていないテストフラッシュで刺激します。良好な細胞が見つかったら、ミネラルオイルリザーバーを手でゆっくりと下げ、電極の先端にわずかな陰圧をかけることで、細胞の内節が電極内に保持されるようにします。細胞が反応を示した場合は、閾値から飽和に至る強度のテストフラッシュに対する一連の反応を記録してください。この手法を用いることで、吸引電極を用いてマウス網膜切片から錐体細胞の光応答を得ることができます。ここでは、同一細胞から得られた複数の記録を重ね合わせて示しています。単一の錐体細胞の光応答は、閾値応答である約1 pAを生成する弱い光から、飽和応答である約5.5 pAを生成する強い光まで、強度を増させたテストフラッシュによって誘導されました。フラッシュ強度が強くなるにつれて、光応答の振幅は飽和に達するまで増大します。フラッシュは時刻0に与えられます。ここでは、吸引電極を用いて単一のmoscon光受容体から光応答を記録する方法を示します。この手順を行う際は、網膜の適切な部位を採取すること、網膜を薄いスライスに切り出すこと、電極を気泡がないよう清潔に保つこと、そして機械的ノイズと電磁ノイズの両方を最小限に抑えることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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