接着細胞培養用の酸素挿入の作製と動作

低酸素挿入装置には、6本の柱があり、6本の柱が6本の井戸に巣立っています。ウェルプレートガスは、ピラーの基部にあるマイクロ流体ネットワークを横切って流れ、ガス透過性PDMSメンブレンを横切って拡散し、ガスネットワークと培養培地を分離します。このデバイスは、酸素源、柱の基部にあるマイクロ流体ネットワーク、および細胞との間の拡散経路の長さを最小限に抑え、より迅速な酸素濃度を可能にします。平衡。

また、このデバイスは、フォトマスクを使用した標準的なフォトリソグラフィーによって作られたマイクロ流体ガスネットワーク設計によって決定される、細胞に曝露される酸素の空間パターンをはるかに細かく制御することができます。こんにちは、イリノイ大学シカゴ校バイオエンジニアリング学部のデビッド・エディントン博士研究室のショーン・アードです。こんにちは、私もエディントン研究所のエリーです。

本日は、カスタムデバイスを作製、検証、利用して、6枚プレートのin vitro細胞培養をさまざまな酸素濃度にさらす方法をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、創傷治癒、活性酸素種の生成、および移動に対する酸素の影響を研究しています。それでは始めましょう。

酸素化インサートの製造を開始するには、プレポリマーと硬化剤の比率が10対1の比率でポリメチルスローンまたはPDMSを調製します。製造元の指示に従って、PDMS混合物は、標準の6ウェル培養プレートの形状を模倣するようにパターン化された以前に機械加工されたDellランモールドに追加されます。一晩で摂氏75度で硬化すると、結果として生じるレプリカ成形ピラーアレイは、酸素化インサートを製造するために酸素化インサートを構成する3つのコンポーネントの最初のものを形成します。

SU8マスターは、最初にSU8 21 50を紡績することによって準備されます。シリコンウェーハ上では、ウェーハにフォトマスクを塗布し、フォトマスクを介してSUエイトをUVにさらすことで、マイクロチャネルの厚さが300マイクロメートルのマスターモールドを作成します。SU 8 Masterの上にPDMSを注ぎ、摂氏75度で2時間硬化すると、最終的に各柱の下部にマイクロチャネルを形成する正の型が得られます。

このデバイスの3つ目のコンポーネントは、シリコンウェーハ上でPDMSを500RPMで10秒間回転させ、続いて900RPMを30秒間回転させることで、厚さ100マイクロメートルのメンブレインを実現します。PDMは気体透過性であるため、酸素はこの膜を介して直接マイクロチャネルに供給できます。すべての部品が準備できたら、各接着面に1分間酸素プラズマ処理を施します。

ハンドヘルドプラズマデバイスを使用して、最初に6つのマイクロチャネルコンポーネントをピラーアレイに結合し、次に各ピラーに2つの穴を開けてガスの入口と出口として機能します。最後に、メンブレンをマイクロチャネルの底に接着して、接着を促進し、気泡を排出します。プラズマ処理された表面は、一対のピンセットの端であるブレンドを使用して約1分間一緒にプレスされ、各ボンディングの間に1時間待って、デバイスが完全に結合され、キャリブレーションできることを確認します。

完全なデバイスが製造されたら、実際の実験で酸素化インサートを使用するときに細胞が受け取る酸素のレベルを較正する必要があります。キャリブレーションには、酸素によって消光される蛍光ルテニウム染料コーティングを含む蛍光酸素センサーまたはフォクシースライドを使用します。フォクシースライドは、6ウェルプレートの底に収まるように事前にカットされています。

フォクシースライドは、井戸の表面をできるだけ覆うようにカットする必要があります。フォクシースライドの厚さは約1ミリメートルであるため、適切なメンブレンの所望の距離を維持するようにデバイスを変更します。スライド拡散。

この距離は実験によって異なりますが、ほとんどの場合、ハンドヘルドプラズマデバイスボンド1ミリメートルの厚さのガラス顕微鏡を4カット使用して1ミリメートル未満にする必要があります。デバイスの底部に長さ約6ミリメートル、幅4ミリメートルのスライドポスト。デバイスは、スライドカットの上にあるポストの上に置かれます。

ガラスカバースリップは、0.17ミリメートルの拡散ギャップにも使用でき、酸素使用量を検証できます。室温で3ミリリットルの脱イオン水で、酸素が測定される6つのウェルプレートの井戸に入れます。デバイスをプレートに置き、metamorphソフトウェアを使用して、foxyセンサー上の希望の位置の数と位置を選択します。

スライドして酸素濃度をアッセイします。酸素ガスタンクと低酸素インサートデバイスの間にタイガンチューブを接続します。毎分50〜100ミリリットルの流量に設定された精密流量調整器を使用して、供給されるガスを細かく制御します。

精密フローレギュレーターが閉じていることを確認します。最初にタンクトップレギュレーターを開き、次に精密レギュレーターを開きます。15分後に流量を毎分10〜20に減らします。

水中に気泡を作らないようにするには、次の1時間にわたって流量値を注意深く監視し、システムが平衡化している間に圧力降下が変化するため、必要に応じて調整を行い、流量を変更してプレートとフォクシーセンサーの画像をキャプチャします。蛍光搭載のオリンパスIX 71顕微鏡、Q Imaging Tigaの電荷結合デバイスカメラ、SRV、Metamorpho画像取得ソフトウェアを使用しています。顕微鏡には、励起波長475ナノメートル、発光波長600ナノメートルのフォクシー互換蛍光フィルターであるオリンパス3 1 0 2 0が装備されています。

デバイスの平衡化時間と酸素化の程度をテストするには、酸素濃度を測定するフォクシースライド上の3つのポイントを選択します。ガスの流れを開始する直前のスライドの画像を撮影します。ガスがデバイス内を流れる30分間の画像と10秒間隔をキャプチャして、不均一性と酸素供給をテストします。

チャネルの幅にまたがる1ミリメートル間隔で複数のポイントを確立し、メタモルフを使用して井戸表面の酸素濃度を測定します。各位置の平均画像強度をエクスポートし、蛍光強度に依存する酸素化濃度をプロットします。蛍光強度と酸素濃度を関連付ける0〜10%の線と10〜21%の線に線形曲線を合わせて検量線を生成します 測定された各位置について、生の強度データをmetamorphからエクスポートし、Microsoft Excelまたはその他の統計ソフトウェアでさらに分析できます。

デバイスのキャリブレーションが完了すると、創傷治癒アッセイなどの実験で、実験の24時間前に121°Cでキャリブレーションされたインサートを15分間オートクレーブし、その後の汚染を防ぐために層流培養フードで作業することができます。滅菌したPDMSインサートを無血清培地に24時間浸して気泡を抑制し、プレートウェルに挿入すると、培養、MDCK細胞、またはその他の接着細胞が6ウェルプレートで100%の流暢さになり、P 200ピペットチップでモノレイヤーにまっすぐな傷がつきます。引っかき傷は、付着性単層の傷をシミュレートします。

単層を乱さずに細胞培地を吸引し、5ミリリットルの培地ですすいでください。再度吸引し、ウェルに3ミリリットルの無添加の血清を補充します。ミディアムは、気泡を避けながら、デバイスをプレートにそっと挿入します。

挿入中にデバイスを傾けると、片側から気泡を排出するのに役立ちます。デバイスに過度の圧力がかかると、PDMSが変形して下にある細胞が押しつぶされる可能性があるため、注意してください。プレートとデバイスを摂氏37度の加熱顕微鏡ステージに置き、ソースガスタンクからのチューブをデバイスの入口ポートと出口ポートに接続します。

培養インキュベーターは、チューブの侵入を可能にする穴を有するべきであり、チューブは接続されるべきである 装置をインキュベーターに配置した後、前に説明したようにガスの流れを開始するための同じ手順に従って、創傷治癒を評価し、細胞のタイムラプス画像を20分ごとに15〜18時間取得し、前述のように機器およびイメージングソフトウェアを使用し、 創傷測定アルゴリズムであるTスクラッチを使用して、所望の実験期間後に治癒していない表面積を分析できます。ガスの流れを止め、プレートを取り外し、必要に応じてさらなる細胞処理に進みます。ここに示すように、低酸素インサートデバイスは、0.5%酸素に安定するのに2分未満かかります。

デバイスメンブレンのウェル底部のギャップサイズは、平衡化効率を決定する重要な要素であり、ギャップサイズが大きいほど、定常状態の酸素濃度値に到達するのにより多くの時間が必要です。また、この装置は、単一のウェル内の空間的な酸素化を大幅に制御できるため、複数の条件の形成が可能になり、ウェルの表面全体に周期的な酸素プロファイルを生成することさえできます。MDCK細胞単分子膜を10%または21%の酸素に曝露し、創傷の表面積をMATLAB Tsスクラッチ創傷テーリングアルゴリズムを使用して経時的に解析しました。

合計17時間のうち11時間後、10%の酸素にさらされたときに元の創傷の6.87%が残り、創傷の64.4%が21%未満のままであったここに示すように、酸素濃度は両方の酸素濃度の創傷開部と負の相関があります。実験期間中、スクラッチ創傷治癒アッセイのための低酸素インサートデバイスの作製、検証、利用方法をお見せしました。このデバイスは、ラボの設置面積が小さく、細胞表面での空間的および時間的な酸素化をはるかに細かく制御するなど、他の酸素化システムに比べて多くの利点があります。

このデバイスは、酸素や二酸化炭素などの他のガスがin vitro細胞培養に及ぼす影響を研究するほぼすべてのラボで利用できます。この手順を行うときは、滅菌したデバイスと培地を一晩浸し、実験中の気泡の形成を最小限に抑えることが重要です。さらに、実験を開始する前に、システムが同等になるようにします。

これは、システム内の圧力が等しくなると流量が変化するためです。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。