Name: サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぼう、Solaris qPCRアッセイを用いた定量リアルタイムPCRの実験手法。マイナーグルーブバインダーとスーパーベース技術により、全スプライスバリアントを高感度・高特異的に検出する遺伝子発現解析の標準プロトコルです。

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1。サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRのアッセイデザインアルゴリズム<ol><li> Solarisの定量PCRプローブ/プライマーペアの設計で使用されるアルゴリズムは、それによって普遍的なサイクリングの条件を可能にする各コンポーネントのTmを調整します。 MGBの定款、または副溝結合、プローブの部分は、Tmを増加させ、より大きなアッセイの柔軟性とパフォーマンスのために設計されるため、より短いプローブすることができます。その名前が示すように、MGBsはDNAのらせんの副溝に収まることができる抗生物質のクラスです。 MGBsは、DNAプローブの3または5の端に添付されます。ソリューションでは、プローブのFAMのレポーターの蛍光は、Eclipseダーククエンチャーによりクエンチされる。プローブが標的配列に結合すると、プローブの3次元立体構造の結果としての変化は、強い蛍光シグナルを可能にします。標的配列のDNAプローブの結合は、PCRのための適切な溶融温度を維持しながら、高度に特異的な、より短いプローブの使用を可能にするMGB、によって安定化される。このように、信号検出は、ターゲットの増幅のアニーリング相の間に発生します。拡張ステップの間、MGBプローブは、関連付けを解除して、蛍光は再び急冷する。プローブがアソシエーションを解除するので、それはPCR効率には影響しません。 </li><li> Solarisのアルゴリズムのもう一つの特徴は、Superbasesの使用です。 Superbasesは、債券ATの安定性を向上させ、GGグアニンに富む配列における自己会合を排除するための結合能力を強化している拠点を変更されます。また、彼らは、5末端に接続された隣接する蛍光物質を消光しない。これらの塩基を選択的に標的配列の可用性を拡張するために、アルゴリズムにしたがって、配置されます。これは、そうでない場合はプライマーとプローブを設計する際に避けられるようなGCリッチな領域として配列が、使用することが可能になります。 </li><li>可能な限り、Solarisのアルゴリズムは、ターゲットサイトのエキソン接合貫通領域を内蔵しています。これは、汚染物質ゲノムDNAの増幅を回避することによって特異性を向上させます。 </li><li>重要なのは、このアルゴリズムは、すべてが単一のプローブ/プライマーセットによってカバーされるような既知のすべてのスプライスバリアントのためのコンセンサス配列を、識別する。そう、唯一のアッセイは、興味のある特定の遺伝子のために必要です。 </li><li>最後に、Solarisの定量PCRアッセイの設計アルゴリズムは、GC含量、長さ、Tm値、および均一なヌクレオチドのストレッチなどの重要な設計上の考慮事項のための非常に厳しいパラメータを利用しています。ゲノム、トランスクリプト、および偽遺伝子：結果のシーケンスは、3つの異なるデータベースを使用して特異性のために分析BLASTです。 </li></ol> 2。 Solarisの試薬の入手方法<ol><li>適切なSolarisの試薬 ​​を入手するには、 <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / Solarisを</a> </li><li>一度Webサイトで"GENEius商品検索"をクリックしてください。 GENEius製品検索へ直接移動するには、を参照してください<a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li>検索照会ボックスをクリックし、適切な標的生物を選択してください。 </li><li> GENEius製品の検索は、多くの異なる遺伝子の識別子を処理することができます。ここでは、文献[シーケンシャルアク、遺伝子ID、遺伝子シンボル、遺伝子情報、サンガーのIDまたはアクセッション番号、またはカタログ番号を含む、対象の遺伝子を見つけるために提案された検索用語、のいずれかを入力します。その後、"検索"をクリックしてください。 </li><li>目的の遺伝子を特定し、左側の"選択"をクリックしてください。これは、目的の遺伝子のために利用可能な異なるサーモサイエンティフィックの製品を表示するウィンドウを開きます。 "製品"の下に"定量PCRの検出"タブを選択します。 </li><li>見出しの"Solarisの遺伝子発現アッセイ"の下に、最適にSolarisのプローブ/プライマーアッセイを設計したものが表示されます。このアッセイは、遺伝子のターゲットのすべての既知のスプライシングバリアントをカバーします。希望する数量を選択してください。彼らは、100、200、400で提供され、 1000 X 25μlの反応（アッセイはオーダーメイドとして識別されている場合、100枚サイズは使用できなくなります）。 "カートに入れる"をクリックしてください。 </li><li>次に、使用するサーマルサイクラーに適したマスターミックスを選択します。マスターミックスが可能なマシンで最適に動作するかを決定するために、クリックして"マスターミックスは、PCRのサーマルサイクラーで最適な動作するこちらをご覧ください。" </li><li>使用するミックスを決定するためにメニューに使用される定量PCRのサーマルサイクラーを見つける。 </li><li> GENEius製品の検索ウィンドウに戻り、適切なマスターミックスを選択します。マスターミックスは、100、200、400、および1000反応のサイズがあります。 "カートに入れる"をクリックします。 </li><li>推奨リファレンス遺伝子と裏面cDNA合成キットは、完全な定量RT - PCR分析のために注文することができます。 </li><li> Solarisの定量PCR試薬が到着すると、使用直前まで-20℃で保管します。以下の試薬を受信する必要があります：色曲、800 nMの各、200 nmで提供されて一つの遺伝子特異的プローブで提供されている2つのプライマーを含む20倍ソリューションをプローブとプライマー、および2Xの濃度でのSolaris定量PCR遺伝子発現のマスターミックスの両方のレンス情報。 Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、12ヶ月以上安定しています。融解凍結を避けてください。 </li></ol> 3。定量PCRセットアップ<ol><li> cDNAを定量PCRのプロトコルを開始します。トータルRNAをスピンカラム法を用いて抽出する必要があります。サーモフィッシャーサイエンティヴァーソcDNA合成キットはcDNAを生成するために逆転写することをお勧めします。 </li><li>プライマー、プローブ、およびマスターミックスを氷上で融解することによって定量PCRの準備。また、リアルタイムPCRの感度を向上させることができる手PCRグレードの水と不透明な白の定量PCRプレート、上持っている。 </li><li> 1）サーモスタートDNAポリメラーゼ、Thermoprime DNAポリメラーゼのホットスタートバージョン：マスターミックスには含めてリアルタイムPCR用のすべてのコンポーネントが含まれています。ポリメラーゼのこのタイプは、最大反応、設定し、95℃で15分で活性化工程を必要とする時の非特異的増幅を防ぐために使用されます。 2）SolarisのマスターミックスでのdNTPは、dTTPのは、Solarisのプライマー/プローブアッセイで動作するように最適化された独自の反応緩衝増幅効率3）を、最大化するためにdUTPを置き換えます。この反応バッファー、試薬とプラスチックの間のコントラストを高めるために青色色素が含まれています。あなたの定量PCR装置がROX必要とする場合4）ROX、。 </li><li>ソリューションが融解した後、チューブを（ボルテックスしない）フリックで混ぜる。試薬の損失を防ぐために、それらをスピンダウン。 </li><li>次に、サンプル数に応じてスケールアップ、反応の目的遺伝子の組み合わせに加え、リファレンス遺伝子の1つを設定するために15 mLの滅菌ファルコンチューブを準備する。十分な三人レプリケートするよう準備を標準曲線法は、分析のために使用される場合は、テンプレートのコントロール（NTC）と標準曲線のサンプルを含むため、個々のサンプルを用意することができます。 </li><li> 96ウェルプレート上で実行される各サンプルについて、以下のミックス：最終反応容積こと2XのSolaris定量PCRマスターミックス、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）、およびそのようなPCRグレードの水の0.5μlの5μLを、一度cDNAを25μLとなる追加されます。 384ウェルプレート上で実行される各サンプルに対して次のように混在させる：2XのSolaris定量PCRマスターミックスの12.5μL、Solarisのプライマー/プローブセット（20X）の1.25μL、およびそのようなPCRグレードの水を最終反応容量、一回のcDNAその10μLとなる追加されます。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用して、プレートの適切なウェルにマスターミックスを転送する。マスターミックスに含まれる青い色素は、白色プレート上にピペットで進捗状況を追跡する際に役立ちます。その後、1-5μLのcDNAテンプレート（96ウェルプレートの場合）またはcDNAテンプレートの1〜2μLを（384ウェルプレート用）を追加。ミックスを上下にピペッティングし。遠心分離機にプレートを置き、これらの蛍光測定値に干渉するので、任意の気泡を除去するためにスピンダウン。 </li><li>プログラムは、サーマルサイクラー：酵素は95℃15分（1サイクル）でアクティブにする必要があります。 95その後40サイクル60℃℃、15秒間の変性、及びアニーリングおよび伸長℃（60秒）。 </li><li>定量PCR機器にプレートを置きます。プログラムを起動します。 </li></ol> Solarisを使用して代表的な定量PCRの結果<img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 PCRの効率とr2の値で判断してSolarisのアッセイは、非常に低い入力濃度で信頼性の高い検出を与える。合成RNAアンプリコン配列またはDNAのアンプリコン配列から合成したcDNAの十10倍希釈液をそれぞれF2RL1またはCDC20、のためのSolaris定量PCRの遺伝子発現アッセイを用いてABI 7900HT楽器で増幅した。対数増幅曲線と標準曲線は、効率性、R2の値は、10 log10の希釈液の外ダイナミックレンジ、および検出の下限値を含む各アッセイの性能と一緒に表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2 Solarisのアッセイは、さらに別の研究者と研究所間の一貫性のある結果を与える。 ALDOAとPPIBだけでなく、非標的コントロール（NTC）をターゲットにしたsiRNAは、100、10、1、0.1 nMの終濃度でHeLa細胞にトランスフェクションした。細胞を採取し、全RNAは、48時間後の治療を単離した。 cDNAは、サーモフィッシャーサイエンティヴァーcDNA合成キットを用いて合成した。 cDNAのアリコートをロシュクラー480（384）プラットフォーム上でALDOA、PPIB、およびGAPDHの検出のためのSolaris定量PCR遺伝子発現アッセイを使用して、2つの地理的に離れた研究室で増幅した。ノックダウンはΔΔCq法（GAPDHリファレンス遺伝子とNTC処理細胞に規格化）を用いて算出した。ノックダウンの同じレベルは、両方のサイトの両方の研究者との間の遺伝子標的の両方で実証された。

この記事の著者は、サーモサイエンティフィックの従業員です。

サーモサイエンティフィックのSolaris qPCRアッセイは、qPCR解析を実行するための簡単​​な、改良された方法を提供する。 MGB技術とSuperbasesを組み込んだ、高ストのアルゴリズムを使用して、これらプライマーおよびプローブセットは、定量PCR実験の忠実性と堅牢性を最大化する。一のプライマーおよびプローブセットは、特定の遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを認識する。ターゲットサイト、可能な限りは、ゲノムDNAが増幅されていないことを保証するために、エクソンにまたがる領域を含む。これらの機能は大幅に複雑な実験を実行するために必要な時間の量を減らすこと、同時に多数のサンプルを実行することが可能に。マスターミックスは青なので、ピペッティングのトラックを失うことなく、定量PCRの感度を向上させる白色不透明プレートを、使用することが可能です。 すべて一緒になって、Solarisの定量PCRアッセイのデザインの特徴は、この小説定量PCRアッセイの特定と、堅牢かつシンプルな、まだ高性能なアッセイを行う。

サーモサイエンティフィックのsolaris定量pcrアッセイを用いて定量的リアルタイムpcr

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの感度および精度を維持しながら、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計されたプライマー/プローブセットの新しいタイプです。これらのプライマー/プローブセットは、以前は利用可能な技術からヒトとマウスのゲノムと機能の大幅な改善の&gt; 98％に予め設計されています。これらの改善は、サーモフィッシャーサイエンティバイオインフォマティクスの専門家によって開発された斬新なデザインのアルゴリズム、のおかげで可能にした。 いくつかの便利な機能が定量的リアルタイムPCRを行うのプロセスを合理化するためのSolaris定量PCRアッセイに組み込まれています。最初に、プロトコルは、一般的に用い選択肢に似ていますが、その定量PCR中に使用される方法は精通している可能性があります。第二に、マスターミックスは、追跡するために、定量PCRの反応は、設定を容易になる、青です。第三に、熱サイクル条件は、すべてのアッセイ（遺伝子）、それは可能な限り一度に多くのサンプルを実行することやエラーの可能性を減少させるための同じです。最後に、プローブとプライマーの配列情報は、公開プロセスを簡素化、提供されています。 ここでは、ご注文のウェブサイト（www.thermo.com / Solaris）上で、どのように標準曲線法を用いてqPCRを行うためのSolarisの試薬を使用するために見つけたGENEius製品検索機能を使用して適切なSolarisの試薬を取得する方法を示します。

Solarisの定量PCR遺伝子発現アッセイは、アッセイの特異性と堅牢性を犠牲にすることなく、定量PCRのプロセスを簡素化するために設計された斬新なデザイン済みの定量PCRプライマー/プローブの組み合わせです。

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

Solaris qPCR Gene Expression Assayは、感度と……を維持しながらqPCRプロセスを簡略化するように設計された、新しいタイプのプライマー/プローブセットです。

このビデオ記事では、Solaris QPCRアッセイを用いたリアルタイムPCRを実演します。Solaris QPCRアッセイは、特定の遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを検出するように設計された、遺伝子特異的なプローブおよびプライマーのセットです。共通のサーマルサイクリング条件下において、Solarisプローブは、5'末端にマイナーグルーブバインダー（MGB）部位とFAMレポーターを、3'末端にエクリプスダーククエンチャーを有しています。リアルタイムPCRの変性ステップでは、プローブは溶液中に留まり、FAMレポーターの蛍光は消光されます。アニーリングおよび伸長相では、プライマーとプローブが標的配列に結合し、クエンチャーがFAMから分離されます。その後、プローブが解離して蛍光が再び消光される際、FAMが強い蛍光信号を発します。この効率的なアッセイの感度、特異性、および再現性を示すリアルタイムPCRの結果が得られます。こんにちは、コロラド州ラファイエットにあるThermo Fisher Scientificの研究開発チームのJames Covinoです。本日は、Lars QPCR遺伝子発現試薬を用いた標準的なQPCR反応のセットアップ手順をご紹介します。当研究室では、RNA干渉技術を用いた標的遺伝子のノックダウンを研究するためにこの手順を使用しています。それでは始めていきましょう。Solaris QPCR assay STEMは、MGBおよびスーパーベース技術を活用した独自のアルゴリズムによって定義されており、ヒトおよびマウスのアノテーション済み遺伝子の98%をカバーする、単一の便利なアッセイを提供します。通常、DNAプローブおよびプライマーの設計は、塩基の数と種類によって決定されるプローブの融解温度によって制限されます。配列が長い場合やGC含量が高い配列では、融解温度が高くなります。Solarisプローブに使用されているマイナーグルーブ結合部位は、DNAらせんのマイナーグルーブに適合し、プローブと標的配列の相互作用を安定化させます。これにより融解温度が上昇し、より短いプローブの使用が可能になります。また、Solarisアルゴリズムは、AT結合の安定性を向上させ、グアニンリッチな配列におけるGG自己会合を排除するために、スーパーベースと呼ばれる修飾ヌクレオチドを選択的に導入します。これにより、通常であれば避けられる標的配列の使用が可能になります。これらの技術の使用によって得られる配列の柔軟性の向上により、単一遺伝子のすべての既知のスプライスバリアントを認識するプライマー・プローブセットの設計が可能になります。特異性を高めるため、可能な限り標的部位にエキソン接合部をまたぐ領域を組み込み、コンタミネーションしたゲノムDNAの増幅を回避している点に注意してください。得られたプライマー・プローブセットは、特異性を確保するために、ゲノム、転写産物、および擬遺伝子の3つの異なるデータベースを用いてBLAST解析が行われています。さらに、Solarisプライマー・プローブセットは完全に最適化されており、すべてのqPCRアッセイでサイクリング条件が同一であるため、1回のPCRランでさまざまな転写産物の発現を評価することが可能です。qPCR実験の計画を開始するには、genius product search（thermo.com/solarisで利用可能）を使用して、標的遺伝子のqPCRに必要となる試薬を特定します。検索入力ボックスをクリックし、適切な標的生物を選択してください。genius product searchでは、多くの異なる遺伝子識別子を処理することが可能です。目的遺伝子に関する推奨検索キーワードのいずれかを入力して検索をクリックし、目的の遺伝子を特定して左側の「select」をクリックします。これにより、目的遺伝子に利用可能なさまざまな試薬が表示されるウィンドウが開きます。「Solaris gene expression assay」の下にある「QPCR detection」タブをクリックしてください。最適に設計されたSolarisプローブプライマーアッセイの例を示します。この1つのアッセイで、目的遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを検出できます。適切なプライマー剤が特定されたら、メニューから使用するqPCRサイクラーを選択し、互換性のあるマスターミックス（ROXパッシブリファレンスダイのバイアルが別添されているマスターミックス、ROXミックス、または低ROXミックスのいずれか）を確認してください。ここではRoche LightCycler 480を使用するため、Master Mix PlusおよびRoche専用バイアルを使用します。また、本研究において適切なリファレンス遺伝子が含まれていることを確認することが重要です。Solaris qPCR試薬がすべて揃い次第、B2Mを使用します。使用するまで-20 °Cで保存してください。試薬は少なくとも12ヶ月間安定です。凍結融解の繰り返しは避けてください。サンプルRNAに対して逆転写反応を行い、qPCR用のcDNAを調製します。cDNAの調製後、Solarisアッセイおよびマスターミックスを氷上で融解します。マスターミックスには、遺伝子特異的アッセイおよびテンプレート成分を除く定量PCRに必要なすべてのコンポーネントが含まれており、これにはサーモスタット、DNAポリメラーゼdn、TPS rocksが含まれます。qPCR装置に、内部に青色染料を含む専用の反応バッファーが必要な場合は、PCRグレードの水とqPCRプレートも用意してください。溶液を融解させた後、指で弾くようにして混合し、試薬の損失を防ぐために軽くスピンダウンします。次に、15 mLチューブを用いて、1× Solaris qPCRアッセイおよびマスターミックスを調製します。384ウェルプレートで分析する希望のサンプル数に合わせて、2xマスターミックス 5 µL、20X Solarisアッセイ 0.5 µL、およびPCRグレード水（各ウェルの最終容量が10 µLになるように）を混合します。cDNAを添加した後、各サンプルにつき3反復分を準備してください。これには、試薬の汚染を確認するためのテンプレートなしコントロール（NTC）および、ゲノムDNAの混入を確認するための逆転写酵素なしコントロール（no RT）を含めます。次に、この混合液を滅菌済みのリザーバーに移します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、1xマスターミックスの適切な量をPCRプレートの該当するウェルに分注します。白プレートを使用する場合、マスターミックスに含まれる内部青色染料が、ピペッティングの進捗確認に役立ちます。すべてのサイクル条件が同一であるため、同一プレート上で複数のcDNAライブラリおよびリファレンス遺伝子の解析が可能です。1xマスターミックスを適切なウェルに分注した後、希釈したCD NAテンプレートを各ウェルに添加し、最終容量を10 µLにします。ピペッティングして混合してください。図に示すように、粘着シールまたはヒートシールでプレートを密封します。プレートを遠心機にセットし、遠心分離して試薬をウェルの底に集め、蛍光読み取りプログラムの妨げとなる気泡を除去します。サーモサイクラーの設定は、まず Solaris QPCR マスターミックス中のホットスタートポリメラーゼを 95 °C で 15 分間（1サイクル）加熱して活性化させ、次に 95 °C で 15 秒間の変性と 60 °C で 60 秒間のアニーリングおよび伸長反応を 40 サイクル繰り返します。このプロトコルは、増幅させる遺伝子に関わらず、すべての Soliris QPCR アッセイで共通です。最後に、プレートをqPCR装置にセットし、プログラムを開始します。この図は、Solarisアッセイの高い性能を示しています。ここでは、合成DNAまたはcDNAの10倍段階希釈液10検体を、CDC 20およびF2RL1用のSolaris qPCR遺伝子発現アッセイを用いて増幅しました。logスケールの増幅曲線および10倍希釈（log10希釈）の標準曲線は、低入力濃度であっても本アッセイが高い性能を発揮することを示しています。各アッセイの性能は、10段階評価の効率の2乗値であるダイナミックレンジ、log 10希釈系列、および検出限界によって測定されます。ここに示すデータは、Solarisアッセイの再現性を実証するものです。ここでは、Solaris QPCR遺伝子発現アッセイおよびマスターミックスを用い、地理的に離れた2つの研究所においてCD NAの分注試料を増幅させました。両方の研究室において、2つのターゲット遺伝子について同様の発現レベルが算出されました。ここでは、Solaris QPCR 遺伝子発現試薬を用いた標準的な QPCR 反応のセットアップ方法について説明しました。この実験を行う際は、試薬の最終濃度を正しく設定してマスターミックスを調製し、適切な生物学的および/または技術的反復を設けることが重要です。加えて、Solarisに適した正確なサーマルサイクリング条件でqPCR装置を設定することが不可欠です。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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