サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

このビデオ記事では、Solaris QPCRアッセイを用いたリアルタイムPCRを実演します。Solaris QPCRアッセイは、特定の遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを検出するように設計された、遺伝子特異的なプローブおよびプライマーのセットです。共通のサーマルサイクリング条件下において、Solarisプローブは、5'末端にマイナーグルーブバインダー（MGB）部位とFAMレポーターを、3'末端にエクリプスダーククエンチャーを有しています。

リアルタイムPCRの変性ステップでは、プローブは溶液中に留まり、FAMレポーターの蛍光は消光されます。アニーリングおよび伸長相では、プライマーとプローブが標的配列に結合し、クエンチャーがFAMから分離されます。その後、プローブが解離して蛍光が再び消光される際、FAMが強い蛍光信号を発します。

この効率的なアッセイの感度、特異性、および再現性を示すリアルタイムPCRの結果が得られます。こんにちは、コロラド州ラファイエットにあるThermo Fisher Scientificの研究開発チームのJames Covinoです。本日は、Lars QPCR遺伝子発現試薬を用いた標準的なQPCR反応のセットアップ手順をご紹介します。

当研究室では、RNA干渉技術を用いた標的遺伝子のノックダウンを研究するためにこの手順を使用しています。それでは始めていきましょう。Solaris QPCR assay STEMは、MGBおよびスーパーベース技術を活用した独自のアルゴリズムによって定義されており、ヒトおよびマウスのアノテーション済み遺伝子の98%をカバーする、単一の便利なアッセイを提供します。

通常、DNAプローブおよびプライマーの設計は、塩基の数と種類によって決定されるプローブの融解温度によって制限されます。配列が長い場合やGC含量が高い配列では、融解温度が高くなります。Solarisプローブに使用されているマイナーグルーブ結合部位は、DNAらせんのマイナーグルーブに適合し、プローブと標的配列の相互作用を安定化させます。

これにより融解温度が上昇し、より短いプローブの使用が可能になります。また、Solarisアルゴリズムは、AT結合の安定性を向上させ、グアニンリッチな配列におけるGG自己会合を排除するために、スーパーベースと呼ばれる修飾ヌクレオチドを選択的に導入します。これにより、通常であれば避けられる標的配列の使用が可能になります。

これらの技術の使用によって得られる配列の柔軟性の向上により、単一遺伝子のすべての既知のスプライスバリアントを認識するプライマー・プローブセットの設計が可能になります。特異性を高めるため、可能な限り標的部位にエキソン接合部をまたぐ領域を組み込み、コンタミネーションしたゲノムDNAの増幅を回避している点に注意してください。得られたプライマー・プローブセットは、特異性を確保するために、ゲノム、転写産物、および擬遺伝子の3つの異なるデータベースを用いてBLAST解析が行われています。さらに、Solarisプライマー・プローブセットは完全に最適化されており、すべてのqPCRアッセイでサイクリング条件が同一であるため、1回のPCRランでさまざまな転写産物の発現を評価することが可能です。

qPCR実験の計画を開始するには、genius product search（thermo.com/solarisで利用可能）を使用して、標的遺伝子のqPCRに必要となる試薬を特定します。検索入力ボックスをクリックし、適切な標的生物を選択してください。genius product searchでは、多くの異なる遺伝子識別子を処理することが可能です。

目的遺伝子に関する推奨検索キーワードのいずれかを入力して検索をクリックし、目的の遺伝子を特定して左側の「select」をクリックします。これにより、目的遺伝子に利用可能なさまざまな試薬が表示されるウィンドウが開きます。「Solaris gene expression assay」の下にある「QPCR detection」タブをクリックしてください。

最適に設計されたSolarisプローブプライマーアッセイの例を示します。この1つのアッセイで、目的遺伝子の既知のすべてのスプライスバリアントを検出できます。適切なプライマー剤が特定されたら、メニューから使用するqPCRサイクラーを選択し、互換性のあるマスターミックス（ROXパッシブリファレンスダイのバイアルが別添されているマスターミックス、ROXミックス、または低ROXミックスのいずれか）を確認してください。

ここではRoche LightCycler 480を使用するため、Master Mix PlusおよびRoche専用バイアルを使用します。また、本研究において適切なリファレンス遺伝子が含まれていることを確認することが重要です。Solaris qPCR試薬がすべて揃い次第、B2Mを使用します。

使用するまで-20 °Cで保存してください。試薬は少なくとも12ヶ月間安定です。凍結融解の繰り返しは避けてください。

サンプルRNAに対して逆転写反応を行い、qPCR用のcDNAを調製します。cDNAの調製後、Solarisアッセイおよびマスターミックスを氷上で融解します。マスターミックスには、遺伝子特異的アッセイおよびテンプレート成分を除く定量PCRに必要なすべてのコンポーネントが含まれており、これにはサーモスタット、DNAポリメラーゼdn、TPS rocksが含まれます。

qPCR装置に、内部に青色染料を含む専用の反応バッファーが必要な場合は、PCRグレードの水とqPCRプレートも用意してください。溶液を融解させた後、指で弾くようにして混合し、試薬の損失を防ぐために軽くスピンダウンします。次に、15 mLチューブを用いて、1× Solaris qPCRアッセイおよびマスターミックスを調製します。

384ウェルプレートで分析する希望のサンプル数に合わせて、2xマスターミックス 5 µL、20X Solarisアッセイ 0.5 µL、およびPCRグレード水（各ウェルの最終容量が10 µLになるように）を混合します。cDNAを添加した後、各サンプルにつき3反復分を準備してください。これには、試薬の汚染を確認するためのテンプレートなしコントロール（NTC）および、ゲノムDNAの混入を確認するための逆転写酵素なしコントロール（no RT）を含めます。次に、この混合液を滅菌済みのリザーバーに移します。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、1xマスターミックスの適切な量をPCRプレートの該当するウェルに分注します。白プレートを使用する場合、マスターミックスに含まれる内部青色染料が、ピペッティングの進捗確認に役立ちます。すべてのサイクル条件が同一であるため、同一プレート上で複数のcDNAライブラリおよびリファレンス遺伝子の解析が可能です。

1xマスターミックスを適切なウェルに分注した後、希釈したCD NAテンプレートを各ウェルに添加し、最終容量を10 µLにします。ピペッティングして混合してください。図に示すように、粘着シールまたはヒートシールでプレートを密封します。

プレートを遠心機にセットし、遠心分離して試薬をウェルの底に集め、蛍光読み取りプログラムの妨げとなる気泡を除去します。サーモサイクラーの設定は、まず Solaris QPCR マスターミックス中のホットスタートポリメラーゼを 95 °C で 15 分間（1サイクル）加熱して活性化させ、次に 95 °C で 15 秒間の変性と 60 °C で 60 秒間のアニーリングおよび伸長反応を 40 サイクル繰り返します。このプロトコルは、増幅させる遺伝子に関わらず、すべての Soliris QPCR アッセイで共通です。

最後に、プレートをqPCR装置にセットし、プログラムを開始します。この図は、Solarisアッセイの高い性能を示しています。ここでは、合成DNAまたはcDNAの10倍段階希釈液10検体を、CDC 20およびF2RL1用のSolaris qPCR遺伝子発現アッセイを用いて増幅しました。logスケールの増幅曲線および10倍希釈（log10希釈）の標準曲線は、低入力濃度であっても本アッセイが高い性能を発揮することを示しています。

各アッセイの性能は、10段階評価の効率の2乗値であるダイナミックレンジ、log 10希釈系列、および検出限界によって測定されます。ここに示すデータは、Solarisアッセイの再現性を実証するものです。ここでは、Solaris QPCR遺伝子発現アッセイおよびマスターミックスを用い、地理的に離れた2つの研究所においてCD NAの分注試料を増幅させました。

両方の研究室において、2つのターゲット遺伝子について同様の発現レベルが算出されました。ここでは、Solaris QPCR 遺伝子発現試薬を用いた標準的な QPCR 反応のセットアップ方法について説明しました。この実験を行う際は、試薬の最終濃度を正しく設定してマスターミックスを調製し、適切な生物学的および/または技術的反復を設けることが重要です。

加えて、Solarisに適した正確なサーマルサイクリング条件でqPCR装置を設定することが不可欠です。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。