Name: ハワイのボブテイルイカから血球の入手 Euprymna scolopesと共生と非共生細菌への遵守を観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-11T04:52:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学ぶハワイのボブテイルイカEuprymna scolopesから血球を採取し、蛍光染色とGFP標識細菌を用いて細菌接着を可視化する方法。細胞生物学と微生物学の研究に応用可能です。

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資金源：SVNへコネチカット研究財団と分子細胞生物学専攻の大学、シグマ西費補助金 - の研究とアントニオH.とMajorie R. AJCにロマノ大学院教育フェローシップ

<ol><li> 0.22μmの濾過滅菌人工海水500 MLS（;塩分35 pptのFSW）を準備する。 0.22μmのミクロンフィルターを介してフィルタ人工または天然の海水は、粒子や細菌を除去する。 </li><li> FSWにおけるエタノールの2％溶液に配置することにより、大人一人ハワイの短い尾イカ（Euprymna scolopes）を麻酔。約10分間麻酔で動物を置きます。イカは水泳を中止し、積極的に触れるには応答しません。継続的な呼吸、マントルの動きによって示される、と色素胞の活動はまだ観察する必要があります。 </li><li>標準的なワックスの解剖トレイに上に向けて腹側でイカを置きます。 FSWは、2％エタノールを含むと動物水没。 </li><li>つの標準200μlのピペットチップを使用して、漏斗と両目の間にある主な頭部血管を露出するマントルを引き戻す。 </li><li> 26.5ゲージの針、穿刺頭部血管と血リンパの50〜100μlの間に撤退した滅菌1 mLシリンジを使用する。氷上に滅菌済み1.5 mLチューブに血リンパを置きます。 注：動物は、ドナーが複数回となる場合、唯一の任意の時点で血リンパの10-20μlを撤回。通常の海水タンクに動物を返します。動物は30分以内に復活されます。 </li><li>採取直後の血球を洗浄し、イカリンガーのソリューション（S -リンガー、530 mMのNaCl、10mMの塩化カリウム、25 mMのMgCl 2、10mMのCaCl 2及び10mMのHEPES緩衝液、pH7.5）500μlに再懸濁している。 </li><li>血球濃度を血球計数器によって決定され、約2,000細胞はチャンバーのガラスのカバースリップに添加し、室温で10分間ガラスに付着させています。この密度では、血球には、ガラススライドの表面上に均一な単層を形成する。 </li><li>ホストの血球への細菌の結合を観察するには、血球は、 ビブリオfischeri ES114および/ ​​またはビブリオharveyi B392、緑色の蛍光レポーターを含むそれぞれのように蛍光標識した細菌株にさらされている。V. fischeri ES114とV. harveyi B392は28の海水トリプトンメディア（SWT）における中期対数増殖期°旋回式シェーカーでCに栽培されています。 600nmの光学密度は、細胞密度を決定するために分光光度計によって測定されます。細菌は、遠心分離（5分間5,000 rpmで）によりペレット化している、上清を捨て、そしてペレットをS -リンガーに再懸濁されている。 </li><li> 10万細菌細胞はよくその平均で血球当たり50の細菌が存在することを各チャンバーに追加されます。血球/細菌混合物を25 S -リンガーのソリューション℃で1時間、バインディングの最大レベルを得るために決められた時間のためのCでインキュベートする。 </li><li>血球の細胞質は、蛍光0.005パーセントCell​​Trackerオレンジ（Invitrogen）で染色後、細胞を可視化するS -リンガーで洗浄されています。 </li><li>関連付けられている細菌染色血球のいずれかツァイスディスカバリーV20蛍光ステレオスコープまたはライカSP2スペクトルレーザー共焦点顕微鏡を用いて蛍光して表示、および動物細胞の表面全体に列挙されます。 </li></ol>代表的な結果頭足類血リンパは細胞外ヘモシアニンではなくヘモグロビンが含まれているため、酸素化により、血リンパには濃い青に変わります。血リンパのウェルあたり〜5000血球の平均は、このメソッドを使用して取得されます。チャンバーカバーガラスと蛍光染色に固執した後、血球は形の明るく蛍光赤とアメーバ状に表示されます。細菌付着、V.用fischeriしばらくV.（血液細胞あたり1-2細菌細胞）血球に不完全に従うことになりますharveyiは （血球10-15細菌細胞）に強く付着する。 <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。成人ハワイの不名誉除隊イカEuprymnaは頭部の血管の位置を示すscolopes。 <img src="/files/ftp_upload/1714/1714fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 ビブリオfischeri（）とビブリオharveyi（B）への血球の暴露の結果。赤、セルトラッカーオレンジ、グリーン、GFP標識細菌。

<ol><li>Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+host+hemocytes+during+the+initiation+of+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis.</a> Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unseen+forces%3A+the+influence+of+bacteria+on+animal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unseen forces: the influence of bacteria on animal development.</a> Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).</li>
<li>McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiont+recognition+and+subsequent+morphogenesis+as+early+events+in+an+animal-bacterial+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism.</a> Science. 254, 1491-1494 (1991).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+between+symbiotic+Vibrio+fischeri+and+the+haemocytes+of+Euprymna+scolopes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes.</a> Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).</li>
<li>Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+animal-bacterial+association%3A+recruiting+symbiotic+Vibrios+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+the+light-organ+microenvironment+of+Euprymna+scolopes%3A+description+of+a+population+of+host+cells+in+association+with+the+bacterial+symbiont+Vibrio+fischeri%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri.</a> Biol Bull. 195, 89-97 (1998).</li>
<li>Visick, K. L., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+fischeri+and+its+host%3A+it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango.</a> Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).</li>
</ol>

有益なバクテリアとホストの間の分子のシグナル伝達を媒介する免疫系の役割に関する研究は、近年では、それらの細菌と真核生物の共進化の理解に多大な貢献をいただきました。イカ/ビブリオシステムはこのフィールド2,3,5,6,8での基本的な質問に答えるために扱いやすいモデル系としての地位を証明しています。イカEuprymna scolopesの光器官は発光細菌ビブリオfischeriによって排他的に植民地化を可能にします。組織その家は、バクテリアが海水と接触して残るので、イカは、特定の共生を促進だけでなく、他の細菌を排除するために継続してはなりません。継続的な研究は、マクロファージのような血球はおそらくこの協会1,4,7の確立と維持において重要な役割を果たすことが明らかになっている。イカのホストは適応免疫がないため、この関連で発見驚くべき特異性は、全体または部分的に自然免疫系を介したものである必要があります。これらの血液細胞の最近の調査では、Eから血球が分離されたことを明らかにscolopesは認識し、貪食V. fische...

<table><tbody><tr><td>Lab-Tekチャンバー付き#1.0ホウケイ酸カバーガラスシステム（8チャンバー）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>26.5 G 1ml ラテックスフリーインスリン用注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V20 顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP2 共焦点顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ハワイのボブテイルイカから血球の入手 euprymna scolopesと共生と非共生細菌への遵守を観察

Obtaining Hemocytes from the Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes and Observing their Adherence to Symbiotic and Non-Symbiotic Bacteria

有益なバクテリアとホストの間の分子のシグナル伝達を媒介する免疫系の役割に関する研究は、近年では、それらの細菌と真核生物の共進化の理解に多大な貢献をいただきました。ハワイのボブテイルのイカとの間の共生の関連付け、<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt;と生物発光細菌<em&gt;ビブリオfischeri</em&gt;動物の開発に有益な細菌の効果を理解するためのモデル系として利用されている。最近の研究では、イカの宿主の自然免疫系の唯一の細胞成分、マクロファージのような血球ことが示されているが、おそらくこのアソシエーションの確立と維持を媒介する上で重要な役割を果たします。このプロトコルは、から血球を取得する方法を紹介します<em&gt; E. scolopes</em&gt;として細菌の結合アッセイにおいて、これらの細胞を使用してください。血リンパがメイン頭部血管から注射器で収集される前に大人のイカは、最初に麻酔です。抽出された血リンパに含まれているホストの血球は、、チャンバーカバーガラスに付着し、緑色蛍光タンパク質で標識された共生にさらされている<em&gt;ビブリオfischeri</em&gt;と非共生<em&gt;ビブリオharveyi</em&gt;。血球は、蛍光色素（細胞トラッカーオレンジ、Invitrogen社）で対比染色し、蛍光顕微鏡を用いて可視化されています。

このビデオでは、ハワイの不名誉除隊イカから血球（血液細胞）を取得する方法を紹介します<em&gt; Euprymna scolopes</em&gt;細胞生物学と細菌付着アッセイで使用するため。血球は、蛍光色素で染色し、GFPで標識した細菌にさらされる。

ハワイのボブテイルイカから血球の入手 Euprymna scolopesと共生と非共生細菌への遵守を観察

近年の、有益な細菌とその宿主との間の分子シグナル伝達を媒介する免疫系の役割に関する研究により、...

成体のコブシメイカをタンクから取り出し、2%エタノール濾過海水溶液で麻酔をかけます。その後、頭部血管から採血を行います。26.5ゲージの注射針を用いて抽出された血リンパは、青色を呈しています。ヘモシアニンが存在するため、血球細胞を目的の濃度まで希釈し、8室のカバーガラスに分注します。血球細胞がカバーガラスに接着した後、蛍光染料であるCellTracker Orangeで染色し、GFP標識した細菌を添加して刺激を与えます。これらは蛍光顕微鏡で視覚化することが可能です。こんにちは、コネティカット大学分子細胞生物学部のSpencer Olmです。NY Home LabのAndrew Collinsです。今日は、ハワイアンボブテイルイカから血リンパまたは血液を抽出する手順をご紹介します。このopisをプライミングします。ボブテイルイカは、ハワイ近海やサンゴ礁に生息する夜行性の動物であり、共生細菌によって産生される光を利用して、好物であるエビを狩りにに出る夜間に自らをカモフラージュします。私たちは研究室においてこの共生関係を利用し、有益な細菌がどのように動物組織に定着するかを研究しています。本手順を用いて、ホストの自然免疫系の構成要素と、生物発光細菌であるVibrio fischeriとの間の相互作用を研究します。それでは始めていきましょう。血リンパを抽出する前に、500 mLのフィルター滅菌済み人工海水に2%のエタノールを調製して入れた1 Lのビーカーで、成体イカ1匹を麻酔します。10分後、イカは泳ぎが緩やかになり、触刺激に対して能動的に反応しなくなります。ただし、外套膜の動きによる呼吸の継続と、色素細胞の活性を示す色素胞の活動が依然として観察されるはずです。ビーカーから滅菌海水エタノール溶液を標準的なワックス製解剖トレイに注ぎ、イカを腹側が上になるようにトレイに沈めます。標準的な200 µLピペットチップ1本を使用して、漏斗と外套膜を後ろに引き、両目の間に位置する主頭血管を露出させます。26.5ゲージの針を装着した滅菌シリンジを用いて、頭部の血管を穿刺し、50〜100 µLまたは10〜20 µLの血リンパを採取します。個体を複数回ドナーとして使用する場合は、血リンパを滅菌済みの1.5 mLチューブに入れ、氷上に置きます。この手順が正しく行われれば、イカの血液は濃い青色に見えることに注意してください。動物を通常の海水タンクに戻して回復させ、マイクロ遠心機を用いて室温で血リンパを遠心分離し、血球をペレット化して上清をピペットで除去します。血球を500 µLのイカ用リンガー液に再懸濁して洗浄します。その後、再び遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。最後に、血液細胞をイカリンガー液で再懸濁します。血球計数器を用いて細胞濃度を測定します。その後、ガラスカバースリップの各チャンバーに約2000個の細胞を添加します。細胞を約10分間、ガラスに接着させます。この密度であれば、hemosはガラス表面に均一な単層を形成するはずです。オービタルシェーカーを用いて28 °Cで細菌を調製している間、hemosは氷上で保持してください。緑色蛍光リポーター遺伝子を持つVireo細菌を1株または数株、海水トリトン培地を用いて対数増殖期中期まで培養します。分光光度計を用いて、600 nmでの培養液の光学密度を測定して細胞密度を決定し、遠心分離で細菌をペレット化します。上清を捨て、ペレットを再懸濁します。1 mLのイカリンガー液に細菌を加え、血球に添加します。各チャンバーに100,000個の細菌を入れたチャンバー付きガラススライドを用意します。スライドを室温で1時間インキュベートします。結合を最大化させるため、細胞質を染色するように、最終濃度0.005%のcell tracker orangeを添加します。30分間インキュベートした後、150 µLの新鮮なイカリンガー液で洗浄します。共焦点顕微鏡を用い、染色されたヘモサイト（血球）とそれに付随する細菌を観察し、ヘモサイトの表面全体にわたって細菌数を計測します。ここで、GFP標識した非共生細菌Vibrio harveyiおよび天然のイカ共生細菌Vibrio fischeriを投与したヘモサイトの代表的な画像を示します。こちらは、細菌による刺激を与えていない血球部位の画像です。細胞は赤く見え、活性化しています。そのため、偽足のような突起が確認できます。細胞を共生細菌である *Vibrio fischeri* で刺激すると、少数の細菌が細胞表面に結合しているのが観察されます。しかし、非共生細菌である *Vibrio harveyi* を血球に曝露させると、著しく多くの細菌が結合します。ここまで、ボブテイルイカから血リンパを抽出し、血球を分離して、これらのイカ細胞への細菌接着を特性評価するための実験に使用する方法について説明しました。このプロトコルは、血球細胞をカバーガラス表面に接着させた後に固定することで、免疫化学法に応用することが可能です。また、動物から血球細胞を回収した後、RNA、DNA、およびタンパク質を抽出することもできます。以上で手順を終了します。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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