ハワイのボブテイルイカから血球の入手 Euprymna scolopesと共生と非共生細菌への遵守を観察

成体のコブシメイカをタンクから取り出し、2%エタノール濾過海水溶液で麻酔をかけます。その後、頭部血管から採血を行います。26.5ゲージの注射針を用いて抽出された血リンパは、青色を呈しています。

ヘモシアニンが存在するため、血球細胞を目的の濃度まで希釈し、8室のカバーガラスに分注します。血球細胞がカバーガラスに接着した後、蛍光染料であるCellTracker Orangeで染色し、GFP標識した細菌を添加して刺激を与えます。これらは蛍光顕微鏡で視覚化することが可能です。こんにちは、コネティカット大学分子細胞生物学部のSpencer Olmです。

NY Home LabのAndrew Collinsです。今日は、ハワイアンボブテイルイカから血リンパまたは血液を抽出する手順をご紹介します。このopisをプライミングします。

ボブテイルイカは、ハワイ近海やサンゴ礁に生息する夜行性の動物であり、共生細菌によって産生される光を利用して、好物であるエビを狩りにに出る夜間に自らをカモフラージュします。私たちは研究室においてこの共生関係を利用し、有益な細菌がどのように動物組織に定着するかを研究しています。本手順を用いて、ホストの自然免疫系の構成要素と、生物発光細菌であるVibrio fischeriとの間の相互作用を研究します。

それでは始めていきましょう。血リンパを抽出する前に、500 mLのフィルター滅菌済み人工海水に2%のエタノールを調製して入れた1 Lのビーカーで、成体イカ1匹を麻酔します。10分後、イカは泳ぎが緩やかになり、触刺激に対して能動的に反応しなくなります。

ただし、外套膜の動きによる呼吸の継続と、色素細胞の活性を示す色素胞の活動が依然として観察されるはずです。ビーカーから滅菌海水エタノール溶液を標準的なワックス製解剖トレイに注ぎ、イカを腹側が上になるようにトレイに沈めます。標準的な200 µLピペットチップ1本を使用して、漏斗と外套膜を後ろに引き、両目の間に位置する主頭血管を露出させます。

26.5ゲージの針を装着した滅菌シリンジを用いて、頭部の血管を穿刺し、50〜100 µLまたは10〜20 µLの血リンパを採取します。個体を複数回ドナーとして使用する場合は、血リンパを滅菌済みの1.5 mLチューブに入れ、氷上に置きます。この手順が正しく行われれば、イカの血液は濃い青色に見えることに注意してください。

動物を通常の海水タンクに戻して回復させ、マイクロ遠心機を用いて室温で血リンパを遠心分離し、血球をペレット化して上清をピペットで除去します。血球を500 µLのイカ用リンガー液に再懸濁して洗浄します。その後、再び遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去します。

最後に、血液細胞をイカリンガー液で再懸濁します。血球計数器を用いて細胞濃度を測定します。その後、ガラスカバースリップの各チャンバーに約2000個の細胞を添加します。

細胞を約10分間、ガラスに接着させます。この密度であれば、hemosはガラス表面に均一な単層を形成するはずです。オービタルシェーカーを用いて28 °Cで細菌を調製している間、hemosは氷上で保持してください。

緑色蛍光リポーター遺伝子を持つVireo細菌を1株または数株、海水トリトン培地を用いて対数増殖期中期まで培養します。分光光度計を用いて、600 nmでの培養液の光学密度を測定して細胞密度を決定し、遠心分離で細菌をペレット化します。上清を捨て、ペレットを再懸濁します。1 mLのイカリンガー液に細菌を加え、血球に添加します。

各チャンバーに100,000個の細菌を入れたチャンバー付きガラススライドを用意します。スライドを室温で1時間インキュベートします。結合を最大化させるため、細胞質を染色するように、最終濃度0.005%のcell tracker orangeを添加します。

30分間インキュベートした後、150 µLの新鮮なイカリンガー液で洗浄します。共焦点顕微鏡を用い、染色されたヘモサイト（血球）とそれに付随する細菌を観察し、ヘモサイトの表面全体にわたって細菌数を計測します。ここで、GFP標識した非共生細菌Vibrio harveyiおよび天然のイカ共生細菌Vibrio fischeriを投与したヘモサイトの代表的な画像を示します。

こちらは、細菌による刺激を与えていない血球部位の画像です。細胞は赤く見え、活性化しています。そのため、偽足のような突起が確認できます。

細胞を共生細菌である *Vibrio fischeri* で刺激すると、少数の細菌が細胞表面に結合しているのが観察されます。しかし、非共生細菌である *Vibrio harveyi* を血球に曝露させると、著しく多くの細菌が結合します。ここまで、ボブテイルイカから血リンパを抽出し、血球を分離して、これらのイカ細胞への細菌接着を特性評価するための実験に使用する方法について説明しました。

このプロトコルは、血球細胞をカバーガラス表面に接着させた後に固定することで、免疫化学法に応用することが可能です。また、動物から血球細胞を回収した後、RNA、DNA、およびタンパク質を抽出することもできます。以上で手順を終了します。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。