Name: アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-04T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶアダルトゼブラフィッシュの臓器解剖法。生殖腺、心臓、肝臓、腸、脳などの主要臓器を系統的に摘出する技術を習得し、成魚の比較解剖学研究に活用できます。

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この作品は、MCMとTGの米国癌学会特別研究員＃PF - 05 - 041 - 01 - DDCにNIHの助成R01 HD050901によってサポートされていました。

<ol><li>男性のゼブラフィッシュは、メスの魚の順で解剖されます。解剖を始める前に、0.2％Tricaineで魚を麻酔し、15分間氷水中でインキュベーションすることで安楽死させる。 </li><li>軽くペーパータオル上で乾燥した魚を叩くと、解剖用マットの上に置くことによって始めます。外部から、ゼブラフィッシュは、単一の背、尾と鰭と対になった胸と骨盤のフィン（図1）を持ちます。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ラベル付きのフィンを持つ成人男性の魚。 </li><li>尾の肉厚部を介して解剖用マットに魚と眼窩の腹側部分を固定。 </li><li>しりびれのちょうど前の魚の腹の皮膚をスニップ。しりびれから蓋に腹（ギル以上ハードカバー）（図2、ステップ1）に沿って皮膚と基礎となる筋肉をカット。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2皮膚や内臓を公開するために体壁筋を取り除くのステップ。 </li><li>次に、胸帯（フィンの基部の厚さ、骨の多い地域）（図2、ステップ2）を含めて、蓋と胸びれを取り外します。ダウン尻鰭（図2、ステップ3）にして魚の側面に沿って、現在露出鰓後方の上から始まり、皮膚の基礎となる筋肉をカット。 </li><li>慎重に魚の側面から皮膚や基礎となる筋肉を取り除く。内臓の多くは、現在（図3）表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。体壁と筋肉を持つ成人男性の魚は内臓の可視化を可能に削除。 </li><li>精巣は、背側体壁に接続されている長い、白、対になった器官である。精巣を削除し、PBSの皿に入れてください。 spermatagoniaから精子への発展途上の生殖細胞のさまざまな段階（レアルら、2009）で嚢胞を含む精細管（図4）、可視化するために反射光で精巣を調べます。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4精巣の解剖。白い丸みを帯びた構造は精細管です。 </li><li>次に、魚の体腔から胃腸系を削除します。肝臓はその大きさ、ローブ形態、黄褐色がかった色、そして豊富な血管新生によって識別することができます。明るい赤を表示される胆嚢、緑色の半透明の液体で満たされた嚢、および脾臓は、内臓の中にあります。 </li><li>臓器の残りの部分から腸を分離し、それを差し伸べる。腸の前方、中間、および後部領域は上皮ひだの高さ（Wallaceら、2005）によって定義されています。 </li><li> PBSで腸の一部を配置し、透過光を用いて上皮ひだを観察。 </li><li>次に、浮き袋を調べます。浮き袋は、ウェーバーの装置（フィニーら、2006）を介して内耳に接続されている空気圧ダクト、および前房、を経由して食道に接続されている後房、から構成されています。 </li><li>浮き袋を取り外して廃棄。魚の固定を解除し、再度ピンに腹側を上に背側体壁に沿って配置されている腎臓を、分析する。腎臓は背側大動脈と色素細胞に関連付けられている半透明のピンクの構造体です。腎臓は、頭部、ボディ、および尾部の領域（図5）に分かれています。腎臓の一部を摘出し、PBSに入れてください。腎尿細管を明らかにするために腎臓の組織を離れていじめる。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。頭部、ボディ、および背側体壁に沿って尾の腎臓の位置。 </li><li>メスの魚を解剖。前述のように、氷水で魚を安楽死させると解剖マットにそれを固定する前に乾燥したそれをなでる。以前に示したように魚の側面から皮膚を取り除きます。卵巣は、血管形成の卵巣間膜によって体腔に一時停止されているbilobed構造です。 </li><li>卵巣の一葉を除去、PBSに入れ、透過光でそれを調べる。卵母細胞は微細な針を使用して離れてからかったし、（図6、セルマンら、1993）ステージングできます。 I期の卵母細胞は約10です - 大きさと半透明の150ミクロン。大きさは350ミクロンと皮質顆粒の出現によって定義 - II期の卵母細胞は、約150です。 III期の卵母細胞は350です - 大きさで750ミクロンと卵黄の蓄積による不透明です。成熟期IVおよびVの卵母細胞は半透明であり、一般に最近交配した雌の​​卵巣には見られない。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。ライブステージI、II、およびIIIの卵母細胞は下に観察さ透過光で顕微鏡を解剖。 </li><li>次に、魚から心臓を解剖。心臓は後部と鰓に腹側に位置しています。心と周囲の組織のすべてを切断し、PBSに置くことで始める。慎重に繊細なアトリウムを傷つけないように注意しながら、心臓周辺の組織を離れて分析する。 </li><li>ハートビートを監視するためにリンゲル液中に切除した心臓を置きます。 心房、心室、および動脈球（図7、Huら、2001）を特定します。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="図7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図7"> 図7。成人心臓を解剖。 </li><li>魚から脳を削除して解剖を完了します。魚を固定解除し、かみそりの刃で頭を最初に取り外します。鉗子で頭蓋骨の腹側から可能な限り多くの軟組織のように取り外します。小さな春のはさみを使って目を削除します。頭蓋骨を開き、脳の腹側から骨を除去破る。今PBSの皿に頭を置いて、脳の背側から皮膚と頭蓋骨の骨を取り除く。 </li><li>嗅球、終脳、手綱、視蓋、小脳および延髄（。。シリング、2002図8、Wullimannら、1996）を特定します。 <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="図8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図8"> 図8。ディテールに秘められた大人のゼブラフィッシュの脳。トップへ前背ビュー、。 </li></ol>

<ol><li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li>
<li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li>
<li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach+%28The+Practical+Approach+Series%29%22%5BJournal%5D)">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).</li>
</ol>

動物実験は、ペンシルベニア州動物実験の大学および使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

試薬： 0.2パーセントTricaine（3 -アミノ安息香酸エチル） 200mgのtricaine粉 97.9ミリリットルDDの水 〜1mlのMトリス（pH 9） pHを7.0に調整する リン酸緩衝食塩水（PBS） 4.0グラムのNaCl 0.1グラムのKCl 100ミリリットルの0.1 M PO 4緩衝液、pH7.3に 150ミリリットルのdH 2 O リンガーソリューション 6.7グラムのNaCl 0.2グラムのKCl 0.2グラムのCaCl 2 1.2グラムのHepes 1 LH 2 O 7.2にpHを調整する設備： マットと解剖皿 電子顕微鏡学 カタログ＃70540 Vannas春はさみ ファイン科学ツール カタログ＃91500〜09

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

過去20年間で、ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生や疾患を理解するための強力なモデル生物となっています。胚および幼虫の実験的分析は広範であり、形態が十分に文書化されているが、一緒に大人と一緒に作業するためのテクニックを持つ成人のゼブラフィッシュの解剖学と成人の構造や臓器の開発の研究の説明は、不足している。幼虫の臓器は、その全体的な構造、形態、及び成人への移行幼虫の時の解剖学的位置に大きな変化を受ける。内部的に、臓器が巨大な成長とリモデリングを受ける間、外部から、透明な幼虫は、その特徴的な大人のストライプpigmentパターンと対になった骨盤のフィンを開発しています。さらに、両性能の生殖腺の原基が精巣か卵巣のどちらかに開発しています。このプロトコルは、成体の器官の多くを識別し、脳、生殖腺、消化器系、心臓、および成人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖のための方法を示しています。解剖の臓器は、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学、RNAの抽出、タンパク質解析、および他の分子技術のために使用することができます。このプロトコルは、幼虫の臓器のリモデリング、成体の器官系の成人およびその他の調査への特定の器官の形態形成を含むようにゼブラフィッシュでの研究の広がりを支援します。

このプロトコルは、成人のゼブラフィッシュから臓器を特定し、解剖するための手順を説明します。

過去20年間にわたり、ゼブラフィッシュは脊椎動物の発達と疾患を理解するための強力なモデル生物となりました。実験的な...

過去20年間にわたり、ゼブラフィッシュは脊椎動物の発達と疾患を理解するための強力なモデル生物となってきました。胚および稚魚の形態については十分に文書化されていますが、成魚のゼブラフィッシュに関する記述、解剖学、および成魚を扱うための技術については不足しています。ペンシルベニア大学のMary Mullinの研究室では、生殖腺の発達を研究しており、日常的に成魚から卵巣と精巣を摘出しています。本プロトコルでは、生殖腺の摘出、およびその他の主要な器官系の同定と摘出について解説します。まず、魚を麻酔し安楽死させた後、解剖マットに固定します。次に、皮膚と下層の筋肉を除去し、心臓、肝臓、腸、生殖腺、および浮き袋を露出させます。体腔から内臓を取り出します。さらなる検査や実験のため、ペンシルベニア大学細胞・発生生物学部のMary Mullins研究室のTripti Guptaが、成魚の多くの器官を特定し、成体ゼブラフィッシュからそれらを摘出する方法を実演します。分かりやすく解剖しやすくするため、まずオスのゼブラフィッシュから精巣、胃腸系、腎臓を摘出し、次にメスのゼブラフィッシュから卵巣、心臓、脳を摘出します。腸内の餌の量を減らすため、解剖の前日はゼブラフィッシュに餌を与えない。雄のゼブラフィッシュを解剖する。まず、解剖マット、Venice Springのハサミとピンセット、解剖用ピン、PBSを入れたシャーレ、および麻酔後に安楽死させた魚を用意します。ペーパータオルで魚の水分を軽く拭き取り、横向きに置きます。解剖マット上のゼブラフィッシュには、単一の背鰭と臀鰭、および対になった腹鰭と胸鰭があります。解剖ピンを用いて、魚の尾の肉厚部分と眼窩の腹側から解剖マットに固定します。スプリングシザーを使い、臀鰭のすぐ前方にある魚の腹部の皮膚を切断します。臀鰭から鰓を覆う硬い蓋である鰓蓋（operculum）にかけて、腹沿いの皮膚と下層の筋肉を切開します。ハサミとピンセットを使用して、鰓蓋（さいがい）と胸鰭（むねびれ）を切り出します。この際、胸鰭の基部にある胸鰭帯と呼ばれる厚い骨領域も含めて切り出してください。これらを取り除き、鰓（えら）を露出させます。露出した鰓の上方から始まり、魚の側面に沿って後方へ、そして臀鰭（しりびれ）まで、皮膚と下層の筋肉を切開します。魚の側面から皮膚と下層の筋肉を慎重に取り除き、内臓を露出させます。精巣は白く長い対の器官であり、背側の体壁に付着しています。精巣を1つ取り出し、室温のPBSが入ったディッシュに入れます。精巣に付着している脂肪を除去します。実体顕微鏡下で反射光を用いて精巣を観察し、精原細胞から精細胞までのさまざまな発生段階の生殖細胞を含む嚢胞が含まれる精細管を確認します。次に、魚の体腔から消化管を除去します。内臓内には、緑色の半透明な液体で満たされた嚢である胆嚢と、鮮赤色に見える脾臓が存在します。肝臓は、その大きなサイズ、分葉した形態、淡褐色、および広範な血管分布によって識別できます。腸を他の臓器から分離し、伸展させます。腸の前部、中部、後部は上皮ひだの高さによって定義され、前部が最も高くなります。腸の一部をPBSに入れ、透過光を用いて顕微鏡下で上皮ひだを観察します。次に、浮き袋を観察します。浮き袋は、気管を通じて食道に接続している後腔と、アリアン装置を介して内耳に接続している前腔で構成されています。浮き袋を取り除いて廃棄し、魚のピンを抜いて腹側を上にして固定し直し、腎臓を解剖します。腎臓は、背側の体壁に沿って位置する半透明のピンク色の構造物であり、背側大動脈および色素細胞と隣接しています。腎臓は頭部、体部、尾部の領域に分かれています。つまり、頭部、腎体部、そして尾部が存在します。これが大動脈であり、これらが色素細胞です。腎臓の一部を切り出し、顕微鏡下でPBS中に置きます。針を用いて腎組織をほぐし、腎尿細管を露出させます。雌魚の解剖には、これまでと同様の器具に加え、数本の細い針、カミソリの刃、およびリンゲル液を入れたシャーレが必要です。心臓の解剖を行う際は、安楽死させた魚の水分を拭き取り、解剖マットに固定します。これまでと同様の手法を用いて、雌魚の側面の皮膚を除去してください。卵巣は、血管系の発達した腸間膜によって体腔内に吊り下げられた2つの葉からなる構造です。卵巣の片方の葉を取り出し、PBSに入れます。顕微鏡下の落射照明で卵巣を観察します。細い針を用いて細胞を分離し、サイズと外観に基づいてステージを割り当てます。次に、魚から心臓を摘出します。心臓は鰓の後方かつ腹側に位置しています。まず、心臓と周囲の組織をすべて切り出し、顕微鏡下でPBSに浸します。心臓を囲む組織を慎重に切り離し、繊細な心房を損傷させないように注意してください。切り出した心臓をリンガー液に入れ、顕微鏡下に設置します。心拍を観察するために、心房、心室、および動脈球を確認します。脳にアクセスするには、魚のピンを抜き、カミソリで頭部を取り除きます。ピンセットを用いて、頭蓋骨の腹側から可能な限り多くの軟組織を除去します。視交叉を確認し、小型のスプリングシザーを用いて眼球を除去します。ピンセットを使用して頭蓋骨を破砕・開放し、脳の腹側から骨を取り除きます。スプリングシザーで脳神経を切断します。必要に応じて、頭部をPBSのディッシュに移動させます。頭部を反転させ、顕微鏡下で脳の背面から皮膚と頭蓋骨を取り除き、嗅球を確認します。脳幹、視蓋、小脳、および球状体を識別します。ここに、嗅球、青緑色の頭部、側線、視丘、小脳および延髄、心臓、胃腸系、生殖腺、浮き袋、腎臓、そして脳があります。これらは成ゼブラフィッシュから摘出されました。これらの器官は、in situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学、RNA抽出、またはその他の分子生物学的手法に使用することができます。

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Research

JoVE Journal

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