多孔質媒体中の微生物トランスポート研究のためのシンプルなマイクロ流体システム：マイクロワールドでのウィンドウ

エコチップデバイスを使用することで、物理構造と圧力ヘッドを一定または変化に保つことができることを実証しています。VIO菌株を発現する非病原性緑色蛍光タンパク質を用いた輸送実験により、表面化学流体特性の影響や粒子・微生物の特性を系統的に調べるとともに、基本的な輸送現象における生息環境構造、流動条件、接種物サイズの重要性を明らかにします。隠された世界の魅力的な視点を持つマイクロ流体ソフトウェア。

こんにちは、ヴァンダービルト大学のヴァンダービルト統合バイオシステム修復教育研究所のディミトリマーカーです。私は、ここViro Laboratoriesの研究開発エンジニアであるDavid Schaferです。こんにちは、私はコネチカット大学の環境科学工学センターの化学材料および生体分子工学科のレスリー・ショ

基本的な環境科学と工学研究のためのモジュール式マイクロ流体ハビタットアレイを作成する手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、マイクロメートルスケールの構造が森林媒体中の微生物輸送相互作用に及ぼす影響を調査しています。それでは始めましょう。

マイクロ流体デバイスを作成する最初のステップは、コンピューター支援図面またはCADプログラムでデバイスの2次元レイアウトを描くことです。私たちはAutoCADを使用しましたが、手がかりやサンゴの描画など、他の描画プログラムも利用できます。このソフトウェアにより、設計者は巨視的なフィールド全体で物理構造を忠実に再現でき、個々の特徴は5ミクロン未満の解像度で定義されます。

CAD図面から、写真マスクが作成されます。マサチューセッツ州の北端にあるAdvanced Reproductions Corporation製のクロムマスクを使用しています。マイクロ流体デバイス製造の次のいくつかのステップは、マスターを作成するためにクリーンルームで行われます。

クリーンなシリコンウェーハをスピンコーダーでフォトレジストでコーティングします。まず、ウェーハをスピンコーダープラットフォームに取り付け、数グラムのSU8 20 25フォトレジストをウェーハの中央に注ぎます。次に、ウェーハを500 RPMで最初の15秒のスプレッドサイクルで回転させ、続いて4、000 RPMの薄いコーティングサイクルを35秒間行います。

紡糸後、ウェーハをホットプレート上に95°Cで10分間置くことで、余分な溶媒を揮発させます。ウェーハを準備する最後のステップは、エッジビーズを取り外すことです。これは、ウェーハをスピンコーダーに戻し、コーティングされたウェーハの外側エッジにSUAエッジスピードリムーバーの安定した流れを適用することによって行われます。

次のステップは、UV光への選択的露光によってフォトレジストをパターニングすることです。まず、コーティングされたウェーハを平らな面に置き、クロームマスクをその上に直接置きます。Rubylithの赤いマスキングフィルムは、目的の領域外のパターンの転写をブロックします。

次に、スポットキャリングシステムを使用して、300 milli JUULパーセントセンチメートル平方のUV光をマスクを介してコーティングされたウェーハに照射します。最後に、ウェーハを摂氏95度で15分間ベーキングして、フォトレジストの光にさらされた領域を架橋し、それらを不溶性にします。マスターを作成する最後のステップは、フォトレジストの非架橋領域を除去し、隆起したレリーフ構造を残すことです。

まず、ウェーハはもう一度スピンコーダーに戻され、現像液で覆われます。現像液をコーティングされたウェーハ上に約5分間放置した後、スピンオフすると、ウェーハ上にはっきりとしたパターンが現れます。残った残渣は、回転するウェーハにイソプロピルアルコールを噴射して洗い流します。

このステップでは、約5〜10秒間、2200RPMのスピン速度を使用します。最後に、完成したマスターを窒素ガス流を使用して乾燥させ、デバイスの鋳造に必要になるまで皿に保管します。シリコーンエラストマーであるポリメチルアランを用いたマイクロ流体デバイスを作製しています。

まず、基材と硬化剤を10対1の重量比でプラスチックカップに送ります。次に、混合物を混合する。アンディはthinky AR 100コンディショニングミキサーを使って泡立ちました。

サイクルが完了すると、液体PDMSがマスターに均等に注がれます。次に、マスターと未硬化のPDMSが入った皿を真空チャンバーに入れて脱気します。ポリマーの泡はほぼすぐに現れます。

すべての気泡が消えるまで脱気が続きます。皿は、ポリマー架橋を完全に可能にするために、摂氏65度の水平オーブンに少なくとも4時間入れられます。次に、硬化したPDMSを再利用可能なマスターから慎重に取り出します。

最初の4つのエッジは、メスを使用してパターン化された領域の十分に外側に切断され、ピンセットを使用してデバイスをパターン化されたウェーハから剥がされます。デバイスのエッジは、必要に応じてせん断を使用してトリミングできます。デバイスのサブセクションは、成形されたPDMSデバイスの残りの部分から分離されてもよい。

次に、PDMSにアクセス穴を開けます。私たちは、小さなアーバーに取り付けられたいくつかの異なるサイズで市販されている生検パンチを使用しています。プレスPDMSコアは、鉗子を使用して取り外します。

最後に、トリミングおよびパンチされたデバイスを、イソプロピルアルコールとフォームチップポリプロピレン綿棒を使用して洗浄します。装置を窒素を使用して乾燥させた後、オーブンに入れて微量の溶媒をすべて除去します。マイクロ流体デバイスを作るための最後のステップは、PDMSをスライドガラス基板に接着し、最初に液体を充填することです。

PDMS装置とスライドガラスは、接着面の間隔を空けてプラズマクリーナーに配置されます。この実験では、PDC 32 G ヘリックプラズマクリーナーを使用します。真空が確立され、青紫色のプラズマが見えたら、タイマーが30秒に設定されます。

プラズマ発生装置が停止します。チャンバーは再加圧され、チャンバーから取り出されたデバイスとスライダーと接着面が接触します。活性化された部品をチャンバーから取り外す際には、表面が活性化されたままになるように素早く動くことが重要です。

穏やかな圧力が良好な接着を確保するのに役立ちます。ボンドの品質は、鉗子で角を引っ張ることによってチェックされます。その後、親水性の内部を緩衝剤などの水溶液で容易に充填したり、脱イオン化することができます。

水流体は、各ソースウェルに、対応する微多孔質フローセルを介して投与されます。すべてのチャンバーがいっぱいになると、硬化したPDMSの薄層がデバイス全体に配置され、蒸発を遅らせ、無菌性を維持します。デバイス内の圧力駆動フローを校正するには、マイクロ構造化フローセルに脱イオン水をプリロードし、流体供給インターフェースとして機能するフローモジュールと滅菌シールをデバイスの上部に配置します。

このフローモジュールは、単独で使用することも、プラスチック製のシリンジなどのリザーバーを含む外部の液体に接続することもできます。プラスチック製シリンジやフローモジュールなどの液体を含むリザーバーを上流の入口に接続します。リザーバー内の流体の高さを下流の高さより上にしっかりと維持します。

さて、上流の貯水池と各下流の出口との間の高さの差は、圧力駆動の流れの駆動力を定義し、デバイスを通過する流量を定量化します。鈍い端の25ゲージの針を使用して、定期的に下流の井戸からサンプルを収集します。例えば、15分から20分ごとにサンプルを採取し、実際のサンプル間の経過時間に注意を払います。

シリンジの重量は、分析天びんにサンプリングの前後に記録されます。骨材の体積と骨材の時間は、平均質量流量に等しい傾きでグラフ化されます。入口リザーバーと出口ウェルの大きな断面積は、流体がデバイス内を移動するときに流量が大幅に変化するのを防ぐのに役立ちます サンプリングされたボリュームを Y 軸にプロットし、X 軸にサンプル時間をプロットします。

Excelなどの単純なグラフ作成プログラムで線の傾きを取得するために、傾きは平均体積流量に使用されます。カルボキシ、YG、およびプレーンなYG表面を持つ3マイクロモルの蛍光ラテックスビーズの希釈溶液を使用して、流れを視覚化し、表面の相互作用を研究します。まず、ビーズの溶液を脱イオン水中に0.01%固形分の濃度で調製します。

溶液は上流のウェルに追加され、フローモジュールはzuに再結合されます。フロービーズの流れは、MITx BCEB 0 1 3 Uモノクロカメラを搭載したZeiss AIOt 25蛍光顕微鏡で1時間にわたって視覚化され、約10分ごとに記録されます。個々のフレームは、蛍光照明と透過光照明を備えたImage Jなどのソフトウェアプログラムを使用して、すばやく連続してキャプチャされ、ムービーに組み立てられます。

ビーズと構造の両方が見えます。透過光が遮られると、明るい蛍光ビーズだけが見えます。底面に沿って堆積した、またはコレクターに取り付けられた固定ビーズは、デバイス全体に明らかです。

生きた細菌を用いた実験には、ビブリオ種などの培養物、細菌を発現する非病原性の緑色蛍光タンパク質が調製されます。まず、ストックカルチャーを深いフリーストレージから取り出します。無菌LB増殖培地を含むフラスコにストック培養液を接種します。

使い捨ての接種ループを使用して、フラスコを振とうしながら一晩インキュベートし、1ミリリットルあたり約10〜9番目の細胞の濃度の固定相培養を行います。アプリケーションによっては、細菌の初期濃度をより正確に定量化できる場合があります。滅菌緩衝液を充填したマイクロ流体デバイスを調製します。

次に、上流のウェル内の滅菌液体を空にし、20マイクロリットルの細菌培養物と交換します。ピペットを使用して、細菌を出力ウェル上の注射器で穏やかに吸引して装置に播種しますインキュベーション後、コロニー形成後の各ウェルの蛍光強度を定量化することにより、ウェル内の細菌の量を決定できます。上流の入口井戸は以前と同様に空にされ、25 ppmの塩で洗い流されたバッファーに置き換えられます。

人工海水の穏やかな圧力が、20〜40マイクロリットルの緩衝液で個々のフローセルを洗い流すシリンジで上流の井戸に加えられます。これは、初期フラッシュ後のフローセルのマイクロ流体土壌部分の貧弱な体積の約100〜200倍です。多孔質媒体を介した細菌の長期灌流は、前に示したのとまったく同じようにフローモジュールを使用することで達成されます。

細菌の増殖と輸送の蛍光画像と白色光画像を経時的に測定できます。この実験では、Qイメージングインクのカラー5冷却CCDカメラを使用して、15時間から20時間ごとに7日間にわたって画像を撮影します。また、本研究のデバイスは、原生動物による捕食から細菌を逃がすための物理的な生息地構造の影響を調査するためにも使用できます。見て。

これは、細菌を放牧しているデバイスで見えるはるかに大きな繊毛原生動物euloを持つ微多孔質フローセル内の細菌です。マイクロ流体デバイス内の流体の流れを解析したところ、40mmの圧力ヘッドでの平均流量は0.71マイクロリットル/分であることがわかりました。圧力ヘッドを60ミリメートルに増やすと、流量は1分あたり1.04マイクロリットルに比例して増加しました。

デバイス内でさまざまな表面ケミストリーのビーズを使用すると、デバイス表面に非カルボキシル化ビーズが大量に蓄積することが観察されます。一方、直径6〜10ミリメートルのビーズは、小さな細孔開口部に巻き込まれる可能性がはるかに高かった。静水圧の上昇による流速の高速化は、eco chippマイクロ流体デバイスでの細菌増殖の分析に予想されるように、ビーズの保持と巻き込みの減少をもたらしました。

デバイスのさまざまなセクターでの画像強度の質的な違いに注目します。蛍光強度は、チャネル内の微生物バイオマスのプロキシとして定量化できます。進行中の実験では、これらの画像で明らかなように、低流量条件の連続的なせん断力が細菌の凝集と群れの形成を引き起こすように見えることを観察しています。粒子スケールを測定したり、多孔質媒体を介した輸送を衝突させたり、微細な構造の生息地での微生物の相互作用を調査したりするための単純なマイクロ流体デバイスを作成して使用する方法を示しました。

フローセルを使用して研究を行う際には、ビーズの浮力とコロイドとコレクターの表面化学を考慮することが重要です。マイクロ流体領域にスケールダウンすると、表面効果が観測された現象を支配する可能性があります。実質的にあらゆる物理構造をマイクロ流体フローセルの設計に組み込むことができます。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。