多孔質媒体中の微生物トランスポート研究のためのシンプルなマイクロ流体システム：マイクロワールドでのウィンドウ

エコチップデバイスを用いることで、物理的構造および圧力水頭を一定に保持、あるいは変化させられることを実証します。非病原性の緑色蛍光タンパク質発現VIO細菌株を用いた輸送実験を通じて、表面化学、流体特性、あるいは粒子や微生物の特性による影響を系統的に調査する一方で、基本的な輸送現象における生息地構造、流動条件、および接種量の重要性を明らかにします。マイクロ流体ソフトウェアにより、隠れた世界の説得力ある視覚化を実現します。

こんにちは。ヴァンダービルト大学、ヴァンダービルト統合バイオシステム復元教育研究所のディミトリ・マーカーです。そして、Viro Laboratoriesの研究開発エンジニアのデビッド・シェイファーです。こんにちは。コネチカット大学、環境科学・工学センター、化学材料・バイオ分子工学科のレスリー・ショウです。そして、Zebraのアディド・ディコットです。

本日は、基礎的な環境科学および工学研究のためのモジュール式マイクロ流体ハビタットアレイを作製する手順をご紹介します。当研究室ではこの手法を用いて、森林媒体における微生物の輸送相互作用にマイクロメートルスケールの構造が及ぼす影響を調査しています。それでは始めていきましょう。

マイクロ流体デバイス作製の最初のステップは、コンピュータ支援設計（CAD）プログラムを用いて、デバイスの二次元レイアウトを作成することです。本手順ではAutoCADを使用しましたが、Clue-inやCorelDRAWなどの他の作図プログラムも利用可能です。このソフトウェアを使用することで、個々の機能部位を5 µm未満の解像度で定義しながら、マクロスケールの領域全体にわたって物理構造を忠実に再現することができます。

CAD図面からフォトマスクを作成します。ここでは、マサチューセッツ州北端のAdvanced Reproductions Corporation社製のクロムマスクを使用します。マイクロ流体デバイス製作の次の数ステップは、マスターを作成するためにクリーンルーム内で行います。

クリーンなシリコンウェハーに、スピンコーターを用いてフォトレジストを塗布します。まず、ウェハーをスピンコーターのプラットフォームに固定し、数グラムのSU 8 20 25フォトレジストをウェハーの中央に滴下します。次に、ウェハーを500 RPMで15秒間の初期展開サイクルで回転させ、続いて4, 000 RPMで35秒間の薄膜コーティングサイクルを行います。

スピンコート後、ウェハーを95 °Cのホットプレートに10分間置き、過剰な溶媒を揮発させます。ウェハー準備の最終ステップは、エッジビードの除去です。これは、ウェハーを再びスピンコーターに戻し、コーティングされたウェハーの外縁にSUAエッジビード除去剤を絶えず塗布することで行います。

次のステップは、UV光への選択的な露光によりフォトレジストにパターンを形成することです。まず、コーティングしたウェハーを平らな面に置き、その上にクロムマスクを直接重ねます。ルビリス赤色マスキングフィルムにより、目的の領域外へのパターンの転写が遮断されます。

次に、スポット照射システムを用いて、マスクを通してコーティングされたウェハーに300 mJ/cm²のUV光を照射します。最後に、ウェハーを95 °Cで15分間ベークし、光照射されたフォトレジスト領域を架橋させて不溶化させます。マスター作成の最終ステップは、架橋されていないフォトレジスト領域を除去し、隆起したリリーフ構造を残すことです。

まず、ウェハーを再度スピンコーターに戻し、現像液を塗布します。現像液をコーティングしたウェハー上に約5分間放置した後、スピンオフさせることで、ウェハー上に明確なパターンを形成させます。残っている残渣は、回転しているウェハーにイソプロピルアルコールを噴射して洗浄し、取り除きます。

この工程では、2200 RPMの回転速度で約5～10秒間スピンさせます。最後に、完成したマスターを窒素ガス流で乾燥させ、デバイスの成形に使用するまでディッシュに保存します。マイクロ流体デバイスの作製には、シリコーンエラストマーのポリジメチルシロキサンを使用します。

まず、ベース材料と硬化剤を重量比10:1でプラスチックカップに入れます。次に、混合物を混合します。アンディはThinky AR 100コンディショニングミキサーを使用して脱泡を行いました。

サイクルが完了したら、液状のPDMSをマスターの上に均一に注ぎます。次に、マスターと未硬化のPDMSが入ったディッシュを真空チャンバーに入れ、脱気させます。ポリマー内の気泡がほぼすぐに現れます。

気泡がすべて消失するまで脱気させます。ポリマーの架橋を完全に進めるため、ディッシュを65 °Cに設定した水平なオーブンに少なくとも4時間入れます。その後、硬化したPDMSを再利用可能なマスターから慎重に取り出します。

まず、メスを用いてパターン領域の十分外側で4つの辺を切り、ピンセットでパターンウェハからデバイスを剥がします。必要に応じて、ハサミでデバイスの端をトリミングしてください。また、成形されたPDMSデバイスの一部を、残りの部分から切り離すことも可能です。

次に、PDMSにアクセスホールを穿孔します。ここでは、小さなアーバーに装着された、市販のさまざまなサイズのバイオプシーパンチを使用します。切り出されたPDMSコアは、ピンセットを用いて除去します。

最後に、トリミングおよびパンチ加工を施したデバイスを、イソプロピルアルコールとフォームチップ付きポリプロピレン綿棒を用いて洗浄します。デバイスを窒素で乾燥させた後、オーブンに入れ、溶媒の残留物をすべて除去します。マイクロ流体デバイス作製の最終ステップは、PDMSをガラススライド基板に接合し、最初に液体を充填することです。

PDMSデバイスとガラススライドを、接合面を上に向けてプラズマクリーナー内に配置します。本実験では、Herrick社製PDC 32 Gプラズマクリーナーを使用しています。真空状態になり、青紫色のプラズマが確認できたら、タイマーを30秒に設定します。

プラズマ発生装置の電源を切ります。チャンバーを再加圧し、デバイスとスライダーをチャンバーから取り出して、接合面同士を接触させます。活性化されたコンポーネントをチャンバーから取り出す際は、表面の活性状態を維持するために、迅速に作業することが重要です。

軽く圧力をかけることで、良好な接着を確保します。ピンセットで角を引っ張り、接着の質を確認します。その後、親水性の内部にバッファーなどの水溶液や脱イオン水を容易に充填できます。

各ソースウェルおよび対応する微多孔流路セルに水を注入します。すべてのチャンバーが満たされたら、蒸発を抑制し無菌状態を維持するために、硬化させたPDMSの薄い層をデバイス全体に被せます。デバイス内の圧力駆動流を校正するには、微細構造流路セルに脱イオン水をプリロードし、流体供給インターフェースおよび無菌シールとして機能するフローモジュールをデバイスの上部に配置します。

このフローモジュールは、単独で使用するか、プラスチック製シリンジなどの外部液体貯蔵容器に接続して使用できます。プラスチック製シリンジなどの液体貯蔵容器、またはフローモジュールを上流側の入口に接続してください。貯蔵容器内の液位が下流側の高さよりも常に高くなるように維持してください。

上流のリザーバーと各下流の出口ウェルとの高さの差が、デバイスを通過する流量を定量化するための圧力駆動流の駆動力となります。下流のウェルから一定の間隔でサンプルを回収するために、鈍端の25ゲージ針を使用します。例えば、サンプル回収の間隔を15〜20分とし、サンプル回収時の実際の経過時間を正確に記録します。

サンプリング前後のシリンジの重量を分析天秤で測定します。累積体積を累積時間に対してプロットし、その傾きを平均質量流量とします。入口リザーバーの断面積を出口ウェルよりも大きくすることで、流体がデバイス内を移動する際の流量の著しい変化を防いでいます。Y軸にサンプリング量を、X軸にサンプリング時間をプロットしてください。

Excelのようなシンプルなグラフ作成プログラムを用いて直線の傾きを求め、その傾きを平均体積流量として使用します。流れの可視化および表面相互作用の研究には、カルボキシ基、YG、およびプレーンYG表面を持つ3 µMの蛍光ラテックスビーズの希釈溶液を使用します。まず、脱イオン水を用いて、固形分濃度0.01%のビーズ溶液を調製します。

溶液を上流のウェルに注入し、フローモジュールを再び接続します。ビーズの流れを1時間にわたって観察し、MITx BCEB 0 1 3 Uモノクロカメラを搭載したZeiss AIOt 25蛍光顕微鏡を用いて、約10分ごとに記録します。蛍光照明および透過光照明を用いて、個々のフレームを連続的に素早くキャプチャし、Image Jなどのソフトウェアプログラムを使用して動画にまとめます。

ビーズと構造体の両方が確認できます。透過光を遮断すると、明るい蛍光ビーズのみが見えます。底面に堆積した、またはコレクターに付着した静止ビーズがデバイス全体にわたって認められます。

生菌を用いた実験では、Vibrio属などの非病原性緑色蛍光タンパク質発現菌などの培養物を準備します。まず、深冷凍保存していたストック培養物を解凍します。滅菌済みLB培地を入れたフラスコに、このストック培養物を接種します。

使い捨ての接種ループを用いて、フラスコを振とうしながら一晩培養し、細胞濃度が約10⁹ cells/mLの定常期培養液を得ます。用途に応じて、細菌の初期濃度をより正確に定量する場合もあります。滅菌バッファーを満たしたマイクロ流体デバイスを準備します。

次に、上流側のウェル内の滅菌液体を排出し、20 µLの細菌培養液に置き換えます。ピペットを用い、出力側のウェルをシリンジで緩やかに吸引しながら、細菌をデバイス内に播種します。インキュベーション後、コロニー形成後の各ウェルの蛍光強度を定量することで、ウェル内の細菌量を決定できます。上流の入口ウェルを前述と同様に排出し、25 pptの塩濃度でフラッシュしたバッファーに置き換えます。

シリンジを用いて上流のウェルに人工海水を緩やかに加圧し、各フローセルを20から40 µLの緩衝液で洗浄します。これは、初回洗浄後のフローセルの微小流体土壌部分の空隙容量の約100から200倍に相当します。多孔質媒体への細菌の長期灌流は、前述と同様にフローモジュールを使用して行います。

細菌の増殖と輸送の蛍光画像および白色光画像を、経時的に測定することができます。本実験では、Q imaging ink社製のカラー5冷却CCDカメラを用い、7日間にわたり15〜20時間ごとに画像を撮影しました。当装置は、物理的な生息域構造が、原生動物による捕食から細菌を保護する避難所としてどのように機能するかという影響を調べるためにも利用可能です。

こちらは、微多孔流路セル内の細菌と、その細菌を捕食している、より大型の繊毛原生動物であるeuloがデバイス内で確認できる様子です。マイクロ流体デバイス内の流体フローを解析した結果、40 millimeterの圧力水頭における平均流速は0.71 microliters per minuteであることがわかりました。圧力水頭を60 millimetersに増加させると、流速は比例して1.04 microliters per minuteまで増加しました。

さまざまな表面化学特性を持つビーズをデバイスに使用した際、カルボキシ化されていないビーズがデバイス表面に多く蓄積することが観察されました。一方で、直径6〜10 mmのビーズは、より小さなポア開口部に捕捉されやすくなる傾向がありました。より高い静水圧によって流速が速くなると、ビーズの保持率と捕捉率が低下しました。これは、eco chippマイクロ流体デバイスを用いて細菌の増殖を解析する場合に予想される結果と一致しています。

デバイスの異なるセクターにおいて、画像強度の定性的な差が認められます。蛍光強度は、チャネル内の微生物バイオマスの指標として定量化することが可能です。現在進行中の実験では、低流量条件下での連続的なせん断力が、これらの画像で明らかなように、細菌の凝集およびフロック形成を引き起こしていると考えられます。ここまで、シンプルなマイクロ流体デバイスを作製し、粒子サイズの測定、多孔質媒体中の衝突輸送の解析、あるいは微細構造生息地における微生物相互作用の調査に活用する方法について説明しました。

フローセルを用いた研究を行う際は、ビーズの浮力ならびにコロイドおよびコレクターの表面化学を考慮することが重要です。マイクロ流体領域にスケールダウンすると、表面効果が観察される現象を支配することがあります。実質的に、あらゆる物理的構造をマイクロ流体フローセルの設計に組み込むことが可能です。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。