アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

このビデオでは、末梢血単核細胞またはpbmcを刺激し、染色する手順を説明しています。マルチカラーフローサイトメトリー解析では、全血から単離したpbmcのAlec Wtsを組織培養プレートに入れます。細胞は化学的または生物学的に刺激されて免疫応答を引き起こします。

刺激後、発現した表面マーカーに基づいて細胞タイプを同定するために、抗体のカクテルを添加します。次に、細胞に浸透させ、細胞内サイトカインの発現を検出するために異なる抗体カクテルを添加し、次に細胞を事実によって分析して、pbmcの特定のサブセットのサイトカインプロファイルを決定します。こんにちは、テキサス大学MBアンダーソンがんセンターの免疫学部にあるジェイガンSAS博士の研究室のエイミー・コートニーです。

こんにちは、私も研究室のホンです。本日は、T細胞応答のマルチサイトメトリー解析をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、Reus Macaの細胞性免疫応答を研究しています。

それでは始めましょう。ヘモサイトメーターを使用してこのプロトコルを開始し、Trian Blue Dye exclusion 法により Reuss Maca 由来の pbmc の生存細胞数を決定します。層流フードreusでの作業。

を1ミリリットルあたり1000万細胞の濃度で完全な培地に懸濁し、100マイクロリットルの細胞懸濁液で非特異的刺激を96ウェル組織培養プレートの各ウェルに注入します。次に、PMAとCINを含む100マイクロリットルの培地を追加して、総体積を0.2ミリリットルにし、最終濃度は50ナノグラム/ミリリットルPMAで、ネガティブコントロールウェルの場合は500ナノグラム/ミリリットルCINで、それぞれに100マイクロリットルの完全な培地を単独で追加します。1.5時間後、加湿した5%二酸化炭素雰囲気中で細胞を摂氏37度で十分にインキュベー

フェルデンAを最終濃度10マイクログラム/ミリリットルで培養し、さらに4.5時間インキュベートします。フェルデンAは、免疫染色による視認性を高めるために金G装置のトラップサイトカインに添加され、刺激遠心分離機で培地を除去した後、200マイクロリットルのコールドフロー洗浄、緩衝液、遠心分離機を低速で追加して洗浄します。この洗浄を繰り返してから、50マイクロリットルのフローウォッシュバッファーを再送信します。

これで、細胞を染色して、再懸濁した細胞の各ウェルに表面マーカーを発現させる準備が整いました。メーカーとSの指示に従って調製した1マイクロリットルの生死固定可能な水色蛍光反応性染料を追加します。.細胞がインキュベートしている間、暗所で摂氏4度で30分間インキュベー

マイクロチューブ内のファクトに使用する染色液を調製します。まず、以下を適切に含めるためにスタンディングカクテルを準備します。滴定蛍光標識モノクローナル抗体、抗CD 3 PE SCI 7、抗CD 8、Alexa 700、抗CD 28、CCP SCI 5.5、抗CD 95 A PCおよび抗CD 4 Pacific Blue Inflow Wash Buffer。

次に、各蛍光標識抗体のチューブを単色染色として個別に調製することにより、個々の染色が他の検出器に漏れ込む係数を決定するために使用されるコンペンセーションコントロールを準備します。最後に、目的の試薬を除くすべての試薬を組み合わせて、蛍光から1を差し引いたものまたはFMO染色を調製します。これは、自家蛍光レベルと完全に染色されたサンプルに存在するデータを複製することにより、陽性集団と陰性集団の間の境界を決定するために使用されます。

細胞が生死染色物でインキュベートされた後、コールドフロー洗浄バッファーで一度洗浄して余分な色素を除去し、洗浄バッファーを吸引します。次に、調製した染色液を加えます。細胞を摂氏4度で暗所で30分間インキュベートします。

染色した細胞をコールドフロー洗浄バッファーで洗浄し、余分な抗体を除去します。次に、100マイクロリットルのBD固定浸透液を少なくとも10分間加えます。細胞を摂氏4度で暗所で最大24時間保存するか、細胞内サイトカインを標識して細胞内サイトカインを標識します。

まず、100マイクロリットルの1×パーマで細胞をパーマします。洗浄バッファーを、細胞がインキュベートしている間に、暗所で摂氏4度で10分間インキュベートします。染色抗体、コンペンセーションコントロール、FMOコントロールを、前回と同様に1×パーマ洗浄バッファーで調製します。

細胞を10分間インキュベートした後、スピンダウンしてone x perm洗浄バッファーを取り出します。適切な染色抗体を添加します。その後、インキュベーション後、暗所で細胞と抗体を摂氏4度で60分間インキュベートします。

細胞を浸透液で2回洗浄します。最終洗浄後、細胞をDPBS中の1%パラフォームアルデヒドに懸濁して細胞を固定します。細胞は、最大24時間使用するまで、摂氏4度で暗所で保管します。

細胞を染色したら、LSR 2フローサイトメーターまたはシアンDPフローサイトメーターを使用してファクトを実行します。次に、FlowJoまたは同様のソフトウェアを使用してデータを分析します。ロイスマカのPBMC組成は、ファックス分析を使用して決定されました。

この図は、代表的な動物から得られるさまざまなT細胞サブセットの解析に利用されるゲーティングスキームを示しています。リンパ球は、最初に前方散乱FSCと側方散乱SSCを介してゲートされ、次にSSCおよびAQUA陰性集団に基づいて生きたリンパ球が同定されました。次いで、CD3発現によりT細胞を同定した:CD4陽性、CD8陰性、およびCD4陰性、およびCD4陰性、CD8陽性集団、CD3陽性T細胞集団内も決定した。

CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞は、ナイーブ中枢記憶細胞およびエフェクター記憶細胞としてのCD28およびCD95の発現に基づいて、さらに異なるサブセットに区別された。この図は、非刺激およびpmaのインターフェロンγおよびILの2つの生産を示す。CINは、CDの4つの陽性T細胞とサブセットを刺激しました。

刺激によって誘発される明確なサイトカインプロファイルに注意してください。各サブセットで。pbmcのマルチフローサイトメトリー解析を行う方法をお見せします。

この手順を実行するときは、単色補正コントロールと蛍光マイナス 1 コントロールの両方を設定することを忘れないでください。これらのコントロールは両方とも、フローサイトメトリーデータを適切に解析するために必要です。報酬管理の選択の詳細については、書面によるプロトコルを参照してください。

また、蛍光標識抗体を使用する際には、光を浴びないようにサンプルを覆うことが重要であることを覚えておいてください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。