速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

このビデオ記事の全体的な目標は、次の 2 つの質問に対する答えを提供することです。1つは、タンパク質相互作用の研究は、実際に別のタンパク質に結合できるタンパク質サンプルの画分を測定することで、より確実に行うことができるかということです。2つ目は、速度論的解析によって、構造や機能の関係性をより深く理解するためにはどうすればよいかということです。

これらの疑問は両方とも、ラベルを使用せずにタンパク質相互作用をリアルタイムで検出する装置であるCorp X 100を使用した実験で解決されます。この実験では、ウシスタチンBとシスチンプロテアーゼパパインとの相互作用、プロテアーゼへの結合に関与するいくつかの残基への複雑な点の2つのタンパク質の結晶構造を調べて、相互作用する各残基がシスタチンBパピン相互作用にどのように影響するかを決定します。いくつかのシスタチンB変異体は、部位特異的突然変異誘発によって産生されます。

このような実験では、組換えタンパク質が正しく折りたたまれず、凝集または劣化して、不正確で再現性のない結果につながる可能性が常にあります。VIACORE X 100は、キャリブレーションフリー濃度分析(略称CFCA)により、結合に利用可能なタンパク質の画分を決定する能力を備えています。このアプローチにより、キャリブレーション標準が利用できない場合でも、結合活性を保持したタンパク質の濃度を決定できます。

ここでは、シスタチンBバリアントの濃度を決定するためにCFCAを使用します。これらのデータは、シスタチン B バリアントの Pepin への結合速度を決定する際の入力として使用されます。これも BOR X 100 を使用して評価されます。こんにちは、スウェーデンのGEヘルスケアのCLAグラムです。

今日、私の同僚であるEva Poolが、BOR X 100を使用して構造機能相関分析を行う方法を示します 組換えタンパク質は、時間の経過とともに不適切なフォールディングまたはルーズビン活性を示す可能性があり、この挙動は、総濃度測定に依存する方法では検出できません。これにより、キャリブレーションフリー濃度分析による濃度測定後に、誤った速度論的データが生じる可能性があります。B.A core X 100は、シスタチンBバリアントとペパンとの相互作用の動態と親和性を解析するために使用されます。

これらのパラメータは、結合メカニズムについての洞察を提供します。まず、実験計画の簡単な説明から始めますので、始めましょう。シスチン、プロテアーゼ、パピン、および阻害剤であるシスタチンBとの間の相互作用は、複合体中の2つのタンパク質の結晶構造によって明らかにされるように、疎水性接触によって支配されます。

インヒビター側から見ると、接触領域はN末端とC末端Ns、および2つのヘアピンループです。この研究では、4つの変異体が調べられ、それぞれが二量体化を防ぐために導入されたシステイン3からシリアへの突然変異を含んでいます シスタチンB.結晶構造で明らかにされた文脈に基づいて、ロイシン73はグリシンに、ヒスタミン75はグリシンに、チロシン97はアラニンに変異しました。2つのグリシン変異は、ピピンへの結合のためのヒスチジン75およびロイシン73側鎖の重要性を調べるために導入され、チロシン残基をアラニンに変異させて、シスタチンBのC末端とピピンとの間の相互作用を調査した。

3つの二重変異体とINEの3つからシリアの単一変異体は、パパインSメチルポピンの触媒不活性変異体との相互作用について試験されています。この触媒的に不活性なプロテウスは、活性な裂け目のCYS 25にメチル基が結合しています。簡単にするために、このバリアントをプロトコル全体でプロパンと呼びます。

CFCAは、分析種分子の表面への拡散によって結合速度が制限される条件下での結合速度の測定に依存しています。これは、リガンドの高い固定化レベルによって支持されます。固定化手順を開始する前に、実験で使用したHEPバッファーを左側のトレイに置き、両方のチューブを挿入します。

また、空の廃棄物ボトルを右側のトレイに置きます。次に、新しいセンサー石膏5をコアX100ソフトウェアを介して機器に初期化し、開始画面でドックチップツールの項目をクリックします。ソフトウェアの[ドキュメントの開始]をクリックします。

次に、固定化ウィザードを使用して、開始画面から検閲CM 5に結合を狙ってパペと固定化を設定し、他のオプションボタンをクリックしてから、ウィザードを選択します。これにより、使用可能なウィザードを含むウィンドウが表示されます。固定化を選択し、新しいボタンをクリックします右下に、固定化ウィザードの最初の画面が表示され、センサー石膏5への結合がデフォルトです。

フローセル2の下のボックスにチェックを入れて、フローセル2に固定します。フローセル 1 は、以下の 3 つの使用可能なオプションから参照サーフェスとして使用するために、変更せずに残します。右側のターゲットレベルで[接触時間の指定]ボックスをオンにすると、接触時間が900秒に変更されます。

次に、capturing molecule slash ligand solutionの下の固定化パラメータを入力します。パパインの登場です。次に、[次へ]をクリックします。

次の画面には、サンプル・ラックのレイアウトが表示されます。位置1は、チップ表面への配位子パパインの照準結合後に残りの活性を非アクティブ化するために使用されるエタノールアミンを保持します。エタノールアミン溶液を位置1、位置2に挿入します。

リガンドパパインを過剰の硫酸メチルで保存し、10ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液に50マイクログラム/ミリリットルに含ませます。pH 4.5 で、アミンカップリングキットのEDCおよびNHSカップリング試薬を、85マイクロリットルのEDCをバイアルに二重蒸留水ピペットで再構成します。キャップをして、3番目の位置に置きます。

NHS の 4 番目の位置で同じボリュームを使用します。このファイル内でED、C、およびNHSを混合するために、ファイル5はキャップを付け、空にする必要があることに注意してください。また、H2Oの位置にあるウォッシュファイルに新鮮な脱イオン水を入れることを忘れないでください。

画面上のアウトラインに従ってラックが埋まったら、[サンプルのロード]をクリックして、ラックを装置にロードします。ラックがロードされたら、[次へ] をクリックします。実行を開始する前に、チェックリストが表示されます。

すべての箇条書きが満たされていることを確認してください。スタートボタンを押すと、実行が開始されます。ランは、固定化手順中に開始されます。

データはリアルタイムで収集されます。まず、カップリング試薬を注入します。次に、パペはチップ表面に結合され、残りの活性エステルが不活性化されて手順が終了します。

実行後、ダイアログウィンドウに実行結果の概要が表示されます。このウィンドウには、固定化レベルが表示されます。カップリング手順全体により、約 3000 RU の固定化パパインが得られるはずです。

パパインがセンサーチップに固定化されたら、シスタチンB変異体サンプルを少なくとも300マイクロリットルで約10ナノモルの総濃度に希釈することにより、CFCA分析を開始する。希釈係数は、アッセイのセットアップの後半で使用するため、記録しておいてください。まず、アッセイフォルダーの濃度セクションで前のセクションで説明したウィザードダイアログを表示します。

キャリブレーションフリーを選択し、新規を選択します。ウィザードの最初の画面には、インジェクション シーケンスが表示されます。ここでは、センサーチップCM 5と直接固定化アッセイアプローチが使用されているため、設定は変更しないでください。

次の画面で「次へ」をクリックします。「run before run」および「run startup cycles」のチェックボックスをプライムのままにします。また、スタートアップ サイクルの既定の数を 3 に変更しないでください。

ソリューション・フィールドの名前にheaps bufferを入力します。次に、[次へ]をクリックします。次の画面で、再生ソリューションの名前(20ミリモル水酸化ナトリウム)を入力します。

他のパラメータは変更しないでください。[次へ] をクリックして、サンプル テーブルを表示します。サンプルテーブルに従ってサンプルを設定します。

サンプル テーブルの各行の結果は 2 サイクルです。1つは毎分10マイクロリットルの流量で、もう1つは毎分100マイクロリットルです。実行をブランクで開始します。

次に、名前の希釈係数、摂氏20度での拡散係数、分子量を入力します。各変異体について、拡散係数は製品ウェブサイトのウェブツールを使用して計算できます。このツールへのリンクは、ソフトウェアのサポートナビゲーターにあります。

各サンプルを実行して複製することを推奨しているため、空白行から最後のサンプルまでテーブル全体をコピーして、テーブルの下部に貼り付けます。[次へ]をクリックして続行します。次の画面には、サンプル・ラックが表示されます。

サンプルと試薬は、ソフトウェアが概説したレイアウトに従ってラックに置きます。Load samplesボタンを押して、ラックを装置にロードします。次に、[次へ]をクリックします。

サンプルをロードすると、チェックリストが記載されたリマインダー画面が表示されます。すべてを確認してから、スタートを押してください。データは実行中にリアルタイムで収集されます。

実行が完了したら、収集されたデータを表示するウィンドウを閉じます。新しい結果アイテムがメイン ウィンドウに表示されていることを確認します。データから濃度を計算するには、新しい結果項目を選択してボタンをクリックします。

core X 100 で評価します。評価ソフトウェアは、ツールバーから収集されたすべてのデータを表示し、濃度分析を選択し、メニューからキャリブレーションフリーを選択します。最初のウィンドウで、分析に含めるデータを選択します。

リストをスクロールし、ビューリストをステップスルーして、すべてのサンプルのデータを表示します。データを除外する場合は、リストからチェックマークを外します。[次へ] をクリックして計算を開始します。

フィッティングが完了すると、CFCA交互作用モデルが実験データに自動的にフィットし、結果ウィンドウに各サンプルの結果が報告されます。各サンプルのフィッティングをステップスルーするには、テーブル内の対応する行を選択します。測定された濃度と呼ばれる列は、分析されたサンプルの濃度を示しています。

元のサンプルの濃度は、前に入力し、計算された濃度の列に表示されている希釈係数を使用して計算されます。完了したら、[完了]をクリックして結果を保存します。CFCA分析からタンパク質の濃度がわかったので、その後の速度論的測定のための優れた基礎ができました。速度論的解析は、結合メカニズムにおける主要なアミノ酸残基の重要性を理解するのに役立ちます。

それでは、速度論解析の設定から始めましょう。動力学解析は、新しいセンサーチップCM 5をスタート画面の装置にドッキングすることから始まります。キネティックの親和性のためのアッセイワークフローの作成を選択します。

左上隅にダイアログウィンドウが表示され、リガンドに関する情報が入力されます。リガンド名ボックスに名前papainを入力し、種の種類のリストから別のタンパク質を選択します。次に、提示された2つの代替リガンド結合アプローチからセンサーチップCM 5を使用してリガンドを共有結合的に固定化することを選択すると、推奨されるアッセイワークフローがウィンドウの右側に概説されます。

これは、固定化ステップから始まり、アッセイステップが続きます。続行するには、続行を押します。必要に応じてアッセイワークフローを保存するには、名前を入力して保存を押します。

ソフトウェアは、すべてのステップに関連付けられたボタンを使用してアッセイワークフローの概要を示します。センサー表面処理の最初のステップは、モビライゼーションpHを見つけることです。この pH は既知であるため、表示されるダイアログボックスで既知の値を入力します。

バッファー名、酢酸、pH 4.5 を入力し、保存を選択します。アッセイワークフローが更新され、このステップが完了したことを示す緑色のチェックマークが表示されます。次に、固定化ステップの実行ボタンを押します。

これにより、プロパンに使用され、CFCA分析のための固定化に使用されたのと同じウィザードが表示されます キネティック分析のためのパピンの固定化は、ここでも同じ方法で設定されますが、より希薄な溶液が短時間で注入されます。これは、シスタチンの結合率が変異体である状況を避けるために、より少ないパピンを固定化するためであり、その結果、速度論的データを単独で測定することができる。リガンドの名前と固定化pHはアッセイワークフローの前のステップで入力されているため、これらは両方ともここでプリセットされています。

必要な更新は、接触時間の 50 秒のみです。その後、固定化は前に示すように進行します。固定化後の予想される結合レベルは50 R ruです。

実行ボタンの横にある緑色のチェックマークは、固定化が完了したことを示します。次に、ステップのワークフローに再生ソリューションを入力します。再生条件を検索するには、表示されるダイアログボックスで「既知の値を入力」をクリックします。

再生ソリューションと接触時間を入力します。次に、[保存]をクリックします。リガンドが固定化され、再生条件が入力されたので、run kinetics Affinityアッセイボックスでkineticsデータを生成するようにすべて設定されました。次に、kineticsの最初のステップでrunボタンを押します。

Affinity Wizardは、シングルサイクルキネティクスのすべてのサイクルの注入シーケンスを概説しており、ここで使用されていますが、何も変更する必要はありません。「次へ」をクリックして続行します。次の手順では、実行前にシステムの準備を示すデフォルト設定をそのまま使用します。

チップ表面を平衡化するために、1つの起動サイクルを実行することを選択します。次に、サンプルの注入パラメーターを定義します。再生ソリューションは以前に指定されており、設定は事前に定義されているため、画面内のパラメーターを変更する必要はありません。

「次へ」をクリックします。最後に、サンプルを指定します。変異バリアントごとに 2 行 (1 つは空白、もう 1 つはサンプル付き) を入力します。

空白のサイクルは、最大濃度パラメータをゼロに設定することで示されます。2。シスタチンBバリアントは、各ランに適合させることができます。各変異体について、分子量、最高濃度、希釈係数を入力し、次へを押してください。

次の画面では、サンプルラックの概要を示しています。タンパク質サンプルの希釈シリーズを調製し、キャップ付きのバイアルをラックに入れる 画面上に概説されているように、緩衝液入りバイアルを位置13に、再生溶液入りバイアルを位置14に置く。ウォーターポジションを真水で満たしてください。

ラックをマシンに置き、サンプルのロードボタンを押してサンプルをロードし、[次へ]をクリックします。前回と同様に、実験を実行する前に、インタラクションデータをリアルタイムで表示開始を押して最終チェックを行います。実行が終了したら、すぐに、示したように、残りのシスタチンBバリアントの実行に進みます。.

残りのシスタチンBバリアントを連続して実行する場合は、ステップの対応するチェックボックスをオフにして、プライムステップとスタートアップサイクルを省略します。各実行が完了すると、リンクからデータにアクセスできます。すべての結果はアッセイワークフローで得られます。

このワークフロー内で生成されたすべての結果を示すダイアログウィンドウが表示されます。運動速度定数を計算するには、評価する結果を選択し、評価を押すと、コアX 100評価ソフトウェアが再度起動し、すべての集合データが表示されます。ツールバーメニューからkineticsアフィニティを選択します。

最初のスクリーニングでは、システイン3からシリア変異体が評価のために選択されます。この変異体からのデータは、この変異体に対して実行されたブランクランとともに、クリックして表示されます。次に。次の画面には、サンプルを使用した実行から空白の実行を差し引いたデータが表示されます。

動力学を評価するには、動力学ボタンをクリックしてください。次に、データを 1 対 1 の対話モデルに適合させることを選択します。fitボタンをクリックすると、計算したまま画面にフィット感が表示されます。

準備が整うと、品質管理が自動的に適用され、下部に強調表示されます。品質管理項目に目を通し、次にセンサーグラムのデータを見て、センサーグラムが十分な曲率を示していることを確認してください。また、収集されたデータと適合モデルとの差を示す残差プロットも見てください。

系統的な偏差とランダムでない偏差に注意してください。このフィット感は許容範囲です。次に、レポートタブのキネティックデータを見てみましょう。

連合率定数、解離率定数、および平衡解離定数。完了したら、Finishを押して、他のすべての変異体に対して同じ手順を繰り返します。以下は、調査したさまざまなシスタチンBバリアントのCFCA分析の代表的な結果です。

比結合濃度データは、毎分10マイクロリットルおよび100マイクロリットルの流量で得られたセンサーグラムから抽出されます。2 80 測定によって決定された濃度と CFCA によって決定された濃度を比較すると、ほとんどの場合、タンパク質はロイシン 73 グリシン変異体に対して完全に活性である一方で、活性タンパク質の割合は非常に低いことが明らかです。ピピンに結合するシスタチンB変異体の動態は、単一サイクル動態を使用して決定されます。.

センサーグラムは、黒でオーバーレイされた1対1の相互作用モデルの動力学を含む空白の参照減算データを示しています。ロイシン73変異体についてCFCAによって測定された特異的結合濃度は、2つの80測定によって決定される全タンパク質濃度の約10%に過ぎない。運動パラメータの計算に正しい濃度を使用すると、Lucien 73の関連率が他のバリアントの関連率と類似していることが明らかになります。

変異体の会合速度は野生型タンパク質の会合速度に匹敵しますが、変異体の解離速度定数は、平衡解離定数が対応する増加することで、2桁近く高くなる可能性があります。減少した親和性は、主に解離率の増加に依存し、シスタチンBの第2結合ループおよびC末端の両方が、複合体が形成されると酵素に阻害剤を付着させ続けることにより結合親和性に寄与することを示し、キャリブレーションフリー濃度分析の使用は、変異体の1つが非常に低い結合活性を有することが判明したため、この結論には不可欠であった。 私の同僚であるPolが、構造化関数研究でbi core X 100を使用する方法を紹介しました。これらの実験を行う際には、濃度解析と速度論解析はどちらも同じ結合手順に基づいていますが、実験条件は大きく異なることを覚えておくことが重要です。