Name: マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた上皮細胞と細菌の共培養法。EHECの定着を蛍光顕微鏡で可視化し、腸内細菌叢と病原体の相互作用を解析する手法です。

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この作品は、国立科学財団（CBET 0846453）と国立衛生研究所（1R01GM089999）によって部分的にサポートされていました。

1。標準のSU - 8フォトリソグラフィー1（ このビデオでは図示せず ）を用いてシリコンのマスターの作製。 <ol><li>標準のSU - 8クリーンルーム内の異なるコンポーネント（異なる厚さのPDMS膜、共培養チャンバー）製造のためにSU - 8"マスター"（SU - 8 2050、マイクロケム、ニュートン、MA）を作成するためにフォトリソグラフィ法を使用してください。このようなマスターの金型は、任意の微細加工施設（;例えば、スタンフォードマイクロフルイディクス鋳造で作製することができる<a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ）。 </li><li>前のPDMSの複製に、マスタからPDMSの簡単なリリースを容易にするために真空源に接続されたデシケーター中でフルオロシラン蒸気にSU - 8のマスターを公開。ペーパータオルにフルオロシランのドロップを追加し、1分間のために真空を適用する。真空を削除し、フルオロシランの堆積のための30分を許可する。 SU - 8今後の使用のために密閉容器に入れてマスターしてください。 </li></ol> 2。マスタ2 SU - 8からPDMSのレプリカ成形<ol><li>流体層と制御層は、SU - 8マスターからPDMSのレプリカ成形によって作られています。 </li><li>午前10時01分重量でPDMSプレポリマーと架橋剤を混ぜる。 1時間（または気泡がPDMSの混合物から除去されるまで）のデシケーター中で比率とドガ。 </li><li>ペトリ皿のSU - 8マスターを置き、慎重にSU - 8のマスターの上にPDMSの混合物を注ぐ。再びドガPDMS。 </li><li>金型で約100μmの均一なPDMSの厚さを得るために1分間1200rpmで金型を回転させる。 </li><li> PDMSを硬化するのに一時間PDMSと80 SU - 8のマスターモールド° Cを含むペトリ皿を加熱する。 </li><li>ホットプレートから硬化PDMS -覆われたSU - 8マスターを削除します。 </li><li> SU - 8マスターからPDMSモールドピール。 </li><li> two細菌の入口、一つの出口一空気圧ポートのために20ゲージの平滑末端針を用いてPDMSモールドの4つの穴を開けます。 </li></ol> 3。多層PDMSデバイスのボンディング：このデバイスが3層、メインチャンネル、中央空気層、および細菌のためのチャネルが含まれている底の細菌層を含む最上位層で組み立てています。下記のように3つの層が組み立てられています。 <ol><li>清潔なピンセットを使用してSU - 8マスター金型からメタノールとし、慎重にはがしPDMS膜を濡らす。テフロンシート上に膜を置きます。 </li><li>酸素プラズマチャンバで空気膜および流体層を配置。 40秒（酸素圧10 SCCM、RFパワー100W）のためにプラズマをオンにします。 </li><li>プラズマへの暴露後、（10分以内）鉗子を用いて底部PDMSチャネル上の膜の位置を合わせます。膜とPDMS層にメタノールを追加すると、レイヤーの自由な移動を支援し、アライメントが容易になります。この場合、デバイスはメタノール蒸気を逃がすためにガーゼに配置されます。 </li><li> 8時間80℃でホットプレート上に整列PDMS層を治す</li><li>結合するために集められた複合PDMSデバイス上に一番上のチャネルを3.4 - 底層に空気の膜を接着した後、手順3.2を繰り返します。 </li></ol> 4。 PDMSデバイス3,4の組み立て<ol><li>真核細胞と細菌を播種するために使用される入口側と出口側の穴を開けます。 </li><li>ポートにタイゴンチューブ（0.01インチOD）を接続し、20mlの注射器で引いて、空気の層を操作する。 </li><li> PDMSモデルと酸素プラズマチャンバ内に事前に洗浄したガラススライドを置きます。ためにプラズマをオンに真空を適用せずに20秒（酸素圧20 SCCM、RFパワー300W）。 </li><li>スライドガラスに島壁（PDMS）ボンディングとの間の接触を防ぐために、すぐにデバイスにシリンジを接続し、シリンジを引いて所定の位置に保持することにより真空を適用する。 </li><li>ゆっくりと（2分以内）ガラス上にPDMSモデルを押してください。 </li><li> 80℃PDMSデバイスを治す℃で10分間を。 </li></ol> 5。フィブロネクチンでガラス表面を処理<ol><li>すべてのポートにタイゴンチューブを接続した後、15分間UVの下でデバイスを滅菌する。 </li><li>チャネル内のいずれかの破片を除去するためにチャネルに滅菌PBSを記入して流れます。気泡を除去するために10分間フローを適用します。空気の泡が簡単にするため、ガス透過性のPDMSをエスケープすることができます。 </li><li>チャンネル内の気泡の形成を防ぐために空気圧のチャンネルに色の色素溶液を埋める。 </li><li>ガラス上に真核細胞の播種を容易にするために、デバイスへのフィブロネクチンの1μg/ mLのソリューションを導入し、37℃で40分間インキュベート℃を</li><li>増殖培地1mLで過剰なフィブロネクチンを洗ってください。 </li></ol> 6。共生E.の形成と測定大腸菌のバイオフィルムの島<ol><li>クローズドチャンバー/島の共生バイオフィルムを形成するためのOD 600までM9最少培地での共生細菌（例えば大腸菌 BW25113/pCM18）〜1に希釈する。 </li><li>正の液圧を印加することにより、島の壁を閉じます。自家製対空液体圧力変換器は、チャネル内の気泡の形成を防ぐために使用されます。 </li><li>共生E.を導入バルブを閉じた状態で島に大腸菌 、および細菌は32℃で1時間のために添付することができます℃に</li><li>アタッチされていない細菌を洗い、12時間0.25mL/hrで希釈細菌懸濁液（OD 600〜0.05）を灌流。 </li><li>緩やかに接続されている細菌を除去し、真核細胞の付着のために準備する新鮮なDMEM培養培地でバイオフィルムを洗浄します。 </li><li>画像ライカTCS SP5共焦点レーザー走査顕微鏡（バノックバーン、イリノイ州）、およびIMARISソフトウェア5を使用してバイオフィルムのアーキテクチャを視覚化を使用してバイオフィルム。 </li></ol> 7。細菌列島6月8日前後真核細胞を播種<ol><li> 5 × 10 5細胞/ mLの播種密度のためにDMEM培地で組織培養フラスコを再懸濁しますからHeLa細胞をトリプシン処理。 </li><li> Picoplusシリンジポンプ（ハーバードApparattus、MA）を用いて2 mL / minの流速で装置にHeLa細胞を導入する。島壁が細菌バイオフィルムは、HeLa細胞領域から独立しているように低下​​していることを確認してください。播種の均一性を決定することができるように、このステップは、光学顕微鏡のステージで実行する必要があります。 </li><li> 5％CO 2インキュベーターで37℃で6時間のためのチャネルとインキュベート° Cで細胞懸濁液の動きを減らすために、セルのコンセントをクランプする。 </li><li>アタッチされていないセルを削除するには、0.5mLの/ hrで増殖培地を使用してデバイスを灌流。 </li><li>リフレッシュHeLa細胞と共生E.ためのDMEM培地大腸菌 6時間ごと。 </li></ol> 8。島と真核細胞への曝露への病原性細菌の導入<ol><li> E.を準備大腸菌 O157：H7（EHEC）は100:1 200:1（HeLa細胞あたりのEHECの数）の感染多重度（MOI）でHeLa細胞に感染する。 </li><li>リンスと緩く接続された共生細菌を洗い流す。 </li><li>島々に希薄EHEC懸濁液（OD 600〜0.1）を導入する。 </li><li> ·フローなしで6時間、5％CO 2インキュベーター内でCが共生バイオフィルム内に存在する信号に公開されるEHECできるようにする37デバイスをインキュベートする。 </li><li> 6時間HeLa細胞に共生の島にEHECを公開するPDMSの壁を持ち上げて。 </li><li> PBSでチャンネルをすすぎ、ライブ/デッドキット（L3224、Invitrogen社、CA）を用いて生細胞と死細胞のために染色。 </li><li>ツァイスAxiovert 200M蛍光顕微鏡での画像の複数の場所をし、生細胞と死細胞の数を見積もります。 </li></ol> 9。代表的な結果9 消化管感染症のイベントのシーケンスは、HeLa細胞の単層と共生E.を開発することによって、模倣された大腸菌のバイオフィルムと前のHeLa細胞の感染に共生バイオフィルムにEHECを公開。マイクロ流体共培養モデルの製造に必要な手順を図1に示します。 図2Aは、共培養装置の3次元レンダリングを示しています。共培養装置真核細胞培養チャンバーと細菌の島の2つの領域が異なる色の染料（細菌の島のための真核生物の領域と緑に紫）と図2Bに示されています。周囲の真核領域から細菌培養領域を単離する可能性は、色の染料を使用して、図2Cに示されています。 図3は、上皮細胞や細菌の共培養から代表的な結果を示す。 図3Aはによって共生バイオフィルム（緑）の島の植民地化を示していますEHEC（赤）。 図3Bは、上皮細胞と共生E.の並置を示しています。細菌の島のEHECと大腸菌 。 EHECとGFP発現共生細菌を表現するRFPは、上皮細胞から細菌の島を単離する可能性を示す、PDMS壁が低下して島にローカライズされています。 <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：共培養モデルにおける細胞播種方式 。 （1）PDMS壁が島を形成するために低下して、共生細菌は、島に導入され、そしてフィブロネクチンは、島の周りに流される。 （2）HeLa細胞は、島を囲む領域に播種されています。 （3）HeLa細胞がコンフルエントに達すると共生バイオフィルムが開発した後は、EHECが島に導入される。 （4）PDMS壁はリフトされていますEHECに島を取り巻くHeLa細胞を公開するまで。バルブ操作の挿入の詳細を示している。 <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="図2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="図2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2bc"> 図2：上皮細胞や細菌の共培養のためのマイクロ流体モデル 。上皮細胞間の細菌の島々を形成するための空気圧で作動トラッピング領域を示す共培養装置の（）三次元演出。各細菌の島（1200μmの径と間隔1000μmのは）増殖培地を提供し、島からの廃棄物を除去するための別の入口と出口を持っています。別の地域を（上皮細胞のゾーン、細菌の島々）を示す色の色素と共培養装置の（B）顕微鏡写真。 （C）空気トラッピングシステムの忠実度は、空気圧で活性化チャネル（青）を用いてPDMS壁を（左パネル）下げ閉島の島々に紫色の色素を導入し、48時間、その周囲に黄色の染料を流すことにより示されていますPDMS壁が（右のパネル）が発生したときに、島の地域は、周囲の黄色の染料にさらされている。スケールバーは500μmを表しています。 <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：HeLa細胞と細菌の共培養 。 RFPを発現しているEHECとGFP発現E.の（A）蛍光画像島の大腸菌 BW25113。 （B）送信のオーバーレイ、緑、およびデバイスの赤色蛍光画像。スケールバーは200μmを表しています。

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
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</ol>

病原体付着と植民地化のための従来のアッセイは、病原体が追加されるに組織培養プレート中の真核細胞の単層を利用する。これらのモデルは、真核細胞で開発された共生細菌バイオフィルムが内蔵されていないとして、生理学的に適切ではありません。真核細胞への事前成長細菌培養の単純な加算では、細菌の存在下での培養真核細胞に、バイオフィルムは時間をかけて開発する高度に組織化された構造体である、そしてそれは事実上不可能非常に困難であり、そうでない場合、このコンフォメーションにつながる可能性は低い生存率の有意な損失なしで長時間。病原体が上皮細胞に付着するためにこれらのモデルの共生バイオフィルムをナビゲートしていないため、これらのモデルは正確に消化管の上皮細胞と共生細菌の組織を模倣しない。ここで、我々は、真核細胞や細菌の共培養のために空気圧制御のトラップを使用するマイクロ流体デバイスの開発を概説する。モデルの病原体としてのモデル真核細胞株とEHECとしてHeLa細胞を用いて、我々は、共培養装置は、島の地域が分離のほか、HeLa細胞の単層と共生E.の育成と発展をサポートできることを示している大腸菌のバイオフィルム。マイクロ流体共培...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高解像度（16,256 dpi）フォトリソグラフィーマスク</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>プログラマブル・スピンコーター</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>マスクアライナー</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>酸素プラズマエッチャー</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead 生死判定・細胞毒性キット</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体可溶性シグナルを介した相互作用を調査するために上皮細胞や細菌の共培養

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

人間の胃腸（GI）管は、腸上皮細胞と非病原性（共生）細菌が共存するユニークな環境です。それは、病原体が共生層に遭遇する微小環境は、植民地化の程度を決定する上で重要であることが提案されている。病原体のコロニー形成を調べるための、現在の培養方法は、よく彼らは消化管の微小環境を模倣する方法で、細菌や上皮細胞の共培養を有効にしていないとしてこの仮説を調べるには適していません。ここでは、真核細胞や細菌の独立した文化を可能にするマイクロ流体共培養モデルを説明し、そして病原体の植民地で共生微環境の効果をテスト。共培養モデルは、共生を開発することにより実証される<em&gt;大腸菌</em腸管出血性の導入に続いて、HeLa細胞の間で&gt;バイオフィルム、<em&gt; E.大腸菌</em&gt;（EHEC）共生の島に、消化管の感染症の一連のイベントを模倣する順序が用いられる。

このプロトコルは、上皮細胞や細菌の同時およびローカライズされた文化のためのマイクロ流体の共培養モデルを説明します。このモデルは、推定されるプロバイオティクス菌株の有効性を病因の異なる水溶性分子シグナルの役割を調べるだけでなく、画面に使用することができます。

ヒトの胃腸（GI）管は、腸上皮細胞と非病原性（共生）細菌が共存する特異な環境である。そこには...

本プロトコルでは、共生微生物環境が病原体の定着に及ぼす影響を検証するため、真核細胞と細菌の独立した培養を可能にする新しいマイクロフルイディクス共培養モデルの使用方法を示します。この共培養モデルの実証として、HeLa細胞の間に共生E. coliバイオフィルムを形成させ、次いで腸管出血性大腸菌（EHEC）をその共生アイランドに導入することで、胃腸管感染における一連の出来事を模倣した手順を提示します。EHECによる上皮細胞のコロニー形成の程度を、蛍光顕微鏡を用いて可視化します。こんにちは。テキサスA&amp;M大学化学工学科の分子システムバイオテクノロジー研究室です。本日は、ヒト胃腸管内の組織構成を模倣した方法で、マイクロデバイス内で細菌と腸管オルガノイド（eCard）細胞を共培養する手順をご紹介します。当研究室では、病原性細菌が上皮細胞に定着する際、定着前に消化管内で遭遇するシグナルによってどのような影響を受けるかを研究するために、この手順を用いています。それでは始めましょう。実験に先立ち、意図する実験用途に従って設計および作製されたシリコンマスターを準備します。例えば、Stanford Microfluidics Foundryで設計済みのマスターを製作し、そこから実験用のレプリカモールドを作成します。本プロトコルで述べる3層デバイスには、真核細胞培養層用とニューマティック層用の2つのメンブレン、および1つの細菌チャネル用のモールドが必要です。細菌層、ニューマティック層、および真核細胞培養層のチャネル高さは、それぞれ5、200、100 µmです。レプリカモールドを準備する前に、真空源に接続したデシケーター内で、SU-8マスターをフルオロシクロシラン蒸気にさらします。マスターからPDMSモールドを容易に剥離させるため、真空チャンバー内のペーパータオルにフルロランを1滴垂らし、1分間真空をかけます。真空を解除し、フルオロの蒸着に30分間時間を置きます。レプリカムールド作成に後で使用するため、SU-8マスターはペトリ皿に保存してください。PDMS前白ポリマーと架橋剤を10:1の重量比で調製し、十分に混合した後、真空チャンバー内で1時間脱気します。気泡を除去するため、SU-8マスターをペトリ皿に置き、マスター上にPDMSを慎重に注ぎます。この際、PDMSは上層用に5 g、細菌層用に30 g使用します。気泡を取り除くため、PDMSを再度10分間脱気します。次に、1分間スピンコートし、PDMSを均一な膜状に広げます。本プロトコルでは、真核細胞培養膜は1200 RPMでスピンコートして厚さ150 µmにし、空気圧膜は800 RPMでスピンコートして厚さ250 µmにします。スピンコート後、スピン後のPDMSとSU-8マスターモールドを含むペトリ皿を室温で15分間静置し、その後ホットプレートを用いて80 °Cで1時間加熱します。PDMSを硬化させた後、PDMSをメタノールで濡らし、清潔なピンセットを用いてSU-8マスターモールドから慎重に剥離させます。細菌層をステレオ顕微鏡下に置き、20ゲージの鈍端針を用いて、細菌の入口2箇所と出口1箇所の計3つの穴を開けます。3層デバイスは、まず空気圧層を細菌層に接合し、次に真核細胞培養層を細菌層および空気圧層に接合するという順序で組み立てます。空気圧膜と細菌層をガラススライド上に配置し、酸素圧力 10 standard cubic centimeters per minute (SCCM)、高周波 (RF) 出力 100 watts の条件下で、酸素プラズマチャンバー内にて 40 秒間プラズマにさらします。膜にメタノールを加えることで、層の自由な移動が促進され、アライメントが容易になります。酸素プラズマへの曝露から 10 分以内に、ピンセットと実体顕微鏡を用いて細菌層をペトリ皿に移します。細菌の入口および出口の穴に基づき、中央の空気圧膜を細菌層に合わせて配置します。位置合わせ後、PDMS構造を配置したペトリ皿を80 °Cのホットプレートに8時間置き、接合させます。完了後、空気圧チャネルを制御するための穴を空気圧層に開けます。次に、組み立てからアライメントまでの手順を繰り返し、真核細胞培養チャネルを組み立て済みの複合PDMSデバイスに接合します。真核細胞の播種に使用する入口および出口ポートに穴を開けます。ポートにタイゴンチューブを接続し、20 milliliter シリンジで牽引して空気圧層を作動させます。複合PDMS構造体とあらかじめ洗浄したガラススライドを酸素プラズマチャンバーに入れます。真空をかけずに、20秒間プラズマを作動させます。複合PDMS構造体を酸素プラズマチャンバーから取り出し、20 mLのシリンジを接続します。バルブとガラスの接触を防ぐため、直ちに引き上げて真空状態にします。1分以内にスライドさせてください。プラズマ処理後、複合PDMS構造体をガラス上にそっと押し付けます。ホットプレートを用いて、PDMSデバイスを80 °Cで10分間キュアします。その後、各ポートにTygonチューブを接続し、UV照射下で15分間デバイスを滅菌します。次に、1 mLシリンジに500 µLの滅菌PBSを満たし、チャネル内に注入して不純物を除去します。気泡が観察された場合は、出口チューブをエピノールマイクロ遠心チューブでクランプし、わずかに圧力をかけて、ガス透過性PDMS層から気泡を強制的に排出させます。チャネル内での気泡の形成を防ぐため、空気圧チャネルに滅菌水を満たしてください。空気泡がニューマチックチャネル内に形成されるのを防ぐため、自作の空気-液体圧力変換器を使用します。ガラス上に真核細胞を播種する準備として、500 µLのフィブロネクチンを真核細胞培養入口から細胞培養領域に導入します。シリンジを用いてバルブを閉じたままにし、37 °Cで40分間インキュベートします。最後に、シリンジポンプを用いて1 mLの増殖培地で過剰なフィブロネクチンを洗浄します。これで、共生バイオフィルム形成実験に使用するためのデバイスの準備が完了しました。細菌をM9最小培地で希釈し、OD 600を約1に調整します。この例では大腸菌のラボ株を使用していますが、非病原性の細菌株であればどのような株でも使用可能です。正圧をかけて、細菌細胞培養領域と真核細胞培養領域を隔てるバルブを閉じます。シリンジポンプを用いて、OD 600が約1.0のE. coli 0.2 millilitersをアイランド内に導入し、32 °Cで1時間静置して細菌を接着させます。インキュベーション後。OD 600が約0.05の希釈細菌懸濁液および新鮮なM9最小培地を、0.25 mL/hの速度で12時間灌流します。シリンジポンプを用いて、新鮮な無血清・無抗生物質DMEM培地0.5 mLを0.5 mL/hの速度で流し、緩く付着した細菌を除去して真核細胞の接着に向けた準備をします。Leica TC SP5共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてバイオフィルムを撮影し、MSソフトウェアを用いてバイオフィルムの構造を可視化します。組織培養フラスコからHeLa細胞をトリプシン処理して回収し、再懸濁します。DMEA培地を用いて、最終容量0.1 mL、細胞密度5×10⁵ cells/mLになるように懸濁します。Pico Plusシリンジポンプを使用し、流速2 mL/minでHeLa細胞をデバイスの真核生物領域に導入します。次に、光学顕微鏡を用いて、共生細菌領域と真核細胞領域を隔てるバルブが完全に閉じており、細菌バイオフィルムが細胞領域から分離されていることを確認します。Eppendorfマイクロ遠心チューブを用いて細胞出口をクランプし、チャネル内の細胞懸濁液の移動を抑制した後、5%二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで6時間培養します。培養後、シリンジポンプを用いて、50 µLのDMEM増殖培地を0.5 mL/hの速度でデバイスに灌流させます。未接着細胞を除去するため、HeLa細胞および共生E. coli領域のDMEM培地を6時間ごとに更新します。HeLa細胞に感染させるため、E. coli OH157H7またはEHECをM9培地で調製し、感染多重度（MOI）をEHEC細胞100〜200個に対してHeLa細胞1個となるように設定します。前節に記載の方法で、緩く接着している共生細菌を洗い流します。シリンジポンプを用いて、OD 600が約0.1に希釈したEHEC懸濁液100 µLを、0.25 mL/hの流速でアイランド内に導入します。その後、EHECを共生細菌バイオフィルム内に存在するシグナルにさらすため、デバイスを37 °C、5% carbon dioxideインキュベーター内で、フローなしの状態で6時間インキュベートします。インキュベート後、真空ポンプを用いて真空を作り、共生細菌領域と真核細胞領域を隔てているバルブを開き、6時間そのままにします。これにより、共生細菌バイオフィルム内のHECがheela細胞にさらされます。その後、再び37 °C、5% carbon dioxideインキュベーター内で6時間インキュベートします。メーカーの指示に従って準備したデバイスに、生細胞・死細胞染色液を導入します。Helo細胞の生存率を染色し、Helo細胞死を推定するためのコントロールとするために、1 mLシリンジを用いて0.1 mLの染色液をデバイスの真核生物領域に注入します。EHECが存在しない場合は、前の3つのステップを繰り返し、滅菌済みで血清および抗生物質を含まないDMEM培地をデバイスに導入します。EHECの代わりに、Zeiss AIOt 200 M蛍光顕微鏡を用いて複数の箇所を撮影し、少なくとも7箇所の画像から緑色の細胞数をカウントすることで、赤色の死細胞の中にある緑色の生存上皮細胞の数を推定します。ここで、試作したレイヤーマイクロ流体デバイスの代表的な画像を示します。この画像では、異なる培養領域を示すために不活性な食用色素を使用しています。紫色の染色は真核細胞培養領域を、緑色の染色は共生細菌バイオフィルムを表しています。この画像では、細菌領域内の紫色の染色は周囲の黄色の染色とは明確に分かれており、真核細胞領域と細菌領域を互いに分離して保持できることが示されています。ここでは、緑色蛍光タンパク質を発現する共生細菌バイオフィルムに、赤色蛍光タンパク質を発現する病原性細菌が定着している様子が示されています。この画像に示されているように、EHECと共生細菌は、細菌バイオフィルムを囲むHeLa細胞とは区別されます。ここでは、細菌と上皮細胞の共培養のためのドライレイヤーマイクロデバイスの組み立て方法と、通常、シグナルが病原体の定着に及ぼす影響を調査する方法について説明しました。この手順を行う際は、デバイス内の気泡を完全に取り除き、適切な多細胞感染（MOI）でこの病原体を使用することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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