Name: 安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた細菌走化性の定量化手法。E. coli RP 4 37を用いて安定した濃度勾配における細菌の移動を解析し、化学刺激応答メカニズムの理解を深める。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、国立科学財団（CBET 0846453）によって部分的にサポートされていました。

1。標準のSU - 8フォトリソグラフィー1（ このビデオでは図示せず）を用いてシリコンのマスターの作製。 <ol><li>マイクロ流体ネットワークと走化性チャンバーを含むPDMSモールドを製造するためのSU - 8"マスター"（SU - 8 2025、マイクロケム、ニュートン、MA）を作成するための標準的なSU - 8フォトリソグラフィーの手法を使用してください。このようなマスターの金型は、任意の微細加工施設（;例えば、スタンフォードマイクロフルイディクス鋳造で作製することができる<a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ）。 </li><li> PDMSの複製の前に、マスタからPDMSの簡単なリリースを容易にするために真空源に接続されたデシケーター内フルオロシラン蒸気にSU - 8マスターを公開。ペーパータオルにフルオロシランの滴を加え、1分間のために真空を適用する。真空を削除し、フルオロシランの堆積のための30分を許可する。 SU - 8今後の使用のために密閉容器に入れてマスターしてください。 </li></ol> 2。 PDMSのレプリカ成形SU - 8からマスター：流体層と制御層は、SU - 8マスターからPDMSのレプリカ成形によって作られています。 <ol><li>午前10時01分重量でPDMSプレポリマーと架橋剤を混ぜる。 1時間（または気泡がPDMSの混合物から除去されるまで）のデシケーター中での比率とドガ。 </li><li>ペトリ皿にSU - 8マスターを置き、慎重に所望の厚さにSU - 8マスターの上にPDMSの混合物を注ぐ。 </li><li> PDMSと℃で2時間、Cは、PDMSを治すために80 SU - 8マスターモールドを含むペトリ皿を加熱する。 </li><li>ホットプレートからとSU - 8のマスターからPDMSモールドピール硬化PDMS -覆われたSU - 8マスターを削除します。所望の構造は、PDMSモールドに埋め込まれます。 </li><li> 20ゲージの平滑末端針を使用してグラデーションのジェネレーターとセルの入口に配管するためのPDMSモールドのパンチ穴。 </li></ol> 3。 PDMSデバイスのボンディング： <ol><li>イソプロパノール及び窒素または空気の流れと乾燥によるガラスの顕微鏡スライドを清掃してください。 </li><li>プラズマアッシングにおける酸素プラズマにPDMS、ガラススライドを公開します。 </li><li>スライドガラスに接触PDMSモールドをもたらす。 65に接触するスライドとPDMSモールドを加熱℃で15分間。 </li></ol> 4。 PDMSデバイスの組み立て<ol><li>カミソリの刃を使用して、45でチューブをカット·デバイスに必要な正しい長さの角度。 </li><li>鉗子を使用してデバイス（例えば、コンセント）にパンチ穴にチューブの一端を挿入します。 </li><li>鉗子を使用して、チューブのもう一方の端に鈍30ゲージの針を挿入する。 </li><li>すべての残りの穴に対して、手順4.2を繰り返します。 </li><li>シリンジから気泡を取り除くように注意しながら、3mlの注射器で走化性バッファ（CB）の1mlを収集する。 </li><li>アウトレットチューブの一端に針ハブを固定する。 </li><li>針ハブにCBを追加し、気泡を除去するために針ハブをタップします。 </li><li>注射器の先端の少しCBアウトを押し込み、空気をトラップすることなく、針ハブに3MLシリンジを接続してください。 </li><li>残りのすべての針のハブがCBとで満たされるまでデバイスを介してCBを押してください。これは、気泡の大部分を削除する必要があります。 </li><li> chemoeffectorテスト中の適切な濃度で含有するCB二つ500μLシリンジを埋める。注射器の内容の小滴を押し出すと針ハブの液体へのドロップをタッチして接続することによって気泡の形成を排除する。 </li><li>同様に、細菌の入口にCBを含むシリンジを接続してください。細菌がデバイスに導入されるときに削除されます。 </li></ol> 5。非常に運動性のE.の成長大腸菌 <ol><li> E.の一晩培養して成長する大腸菌振盪しながら32℃でトリプトンブイヨン（TB）20 mLのプラスミドGFPの発現とRP437。プラスミドを維持するために抗生物質の適切な濃度を追加。我々のプロトコルでは、我々はデバイスの蛍光に基づいて、細菌を検出するための低コピープラスミドpCM182を使用してください。 E.用大腸菌 、32で成長している文化℃の場合は運動性がより高い温度で低いので、高い運動性をお勧めします。 </li><li> 〜0.05の600nmの光学密度に250mLの三角フラスコにTB 20 mlの培養液を接種するために一晩培養を使用してください。 32で振とう培養を育て℃を</li><li> 5分で400 × gで低速遠心で〜0.35 0.45のOD 600で細胞を回収する。 </li><li>チャネルの途中で予想される濃度でchemoeffectorを含むCBで〜0.35のOD 600に細胞を再懸濁します。 </li><li> GFP発現生きている細胞に〜0.35のOD 600でRFPで標識された死細胞を追加。死んだ（赤色）のセルには、任意の移行が流れの影響によるものではないことを保証するために内部コントロールとして使用されています。 </li></ol> 6。モニタリングの走化性<ol><li>セル入口の針からCBの一部を取り除くハブ。細胞懸濁液を補充。 </li><li>静かに再懸濁した細胞を50μLシリンジを埋める。鞭毛がせん断することができ、運動性を低下させるため、この手順では、徐々に行う必要があります。 </li><li>手順のステップ4.10に説明したように口針のハブに50μLシリンジを取り付けます。 </li><li>画像取得のための高速度カメラを装備した蛍光顕微鏡のステージ上にデバイスを配置します。シリンジポンプ入口側のシリンジを（両方500μL勾配のシリンジと50μLの細胞シリンジ）を配置し、勾配が形成され、細胞はチューブを流れているように、フローを開始します。 </li><li>一度細胞が走化性チャンバーを入力し、イメージングの前に安定させるためのシステムのために〜20分待ちます。 </li><li>チャンバーの長さに沿って異なる位置（異なる露光時間に相当）で緑（ライヴ）と赤（死んだ）蛍光画像を収集する。一般的に、我々は3秒間隔で各場所で100枚の画像を収集する。 </li></ol> 7。データ解析：以下の手順は、任意の市販の画像解析のプログラム（例えば、ImageJを、Metamorph）を使用するか、MATLABで書かれたシンプルなコードを使用して実行できます。 <ol><li>画像の背景のピクセルを削除する（すなわち、しきい値のピクセルの強度を設定し、以下のしきい値よりも強度を持つすべてのピクセルを削除）。分析のこのノイズを最小化。 </li><li>画像の中心を決定するために、死細胞（赤色蛍光）の位置を使用してください。死んだ細胞が走化性を示していないので、これは細胞が走化性チャンバーを入力し、任意の移行がない場合に検出される位置を表します。 </li><li>画像に生きた細胞を（緑色蛍光）を探します。 </li><li>チャンネルに画像を分割し、各チャンネルで生細胞の数を決定します。私たちの前の仕事3では、1050μm幅走化性チャンバーは、それぞれ〜16μmの幅で64チャンネルに分割されました。 </li><li>すべての画像に対して、手順7.1の7.3を繰り返し、すべての画像間で各チャンネルの総細胞数を合計します。これは、実験期間中での各チャンネルで検出された総細胞数を与えます。 </li><li>高濃度（右）と低濃度（左）死細胞の両側にある各セルは、+1と-1の乗数が割り当てられている：次のように、移行の方向を表す走化性の分配係数（CPC）を、計算する、それぞれ。これは、勾配を下って、細胞が-1で乗算されている間1を乗算した勾配を移行するセルです。すべての乗算値を加算し、検出されたセルの合計数に正規化されています。例えば、0.40のCPCの値は合計細菌の40％以上が低濃度側（すなわち、より多くの細菌が勾配を上に移動検出されたとしてchemoeffectorが誘引である）よりも高濃度側に移動したことを示します。 </li><li>重量を各チャネルの細胞数細胞が移動した距離に比例する係数で次のように距離によって細胞の遊走を重走化性の移行係数（CMC）を、計算では、旅。途中で高濃度側に移動する一つが0.5の重み係数、および最も遠いため、移動セルを与えているのに対し、最も遠い高濃度の位置（チャネル64）に移動するセルは、1の重み係数が与えられます低濃度の位置は-1で重みが付けられます。すべての重み付けセルの数を総括し、CMCを生成する細胞の数に正規化する。 </li></ol>代表的な結果3,4： 我々は、マイクロ流体デバイス（ 図1A）は Eの走化性を調査するためにここで説明に使用されている誘引（アスパラギン酸、オートインデューサー-2）と防虫剤の勾配で大腸菌 （NISO 4、インドール）3,4。典型的走化性菌株5 E.大腸菌 RP437を発現するGFPは、カナマイシン殺さE.とともに、使用されたフローの影響を監視するために赤色蛍光タンパク質を発現する大腸菌 TG1細胞。 μFlow装置で形成された濃度勾配は、 図1Bに示されています。セルの入口は、それを介して、フローとfluoressceinのng / mLのがデバイスに設立された0〜100の安定勾配がないように蓋をした。デバイス間のピクセル強度はフルオレセインの濃度プロファイルを決定するために使用されていました。データは、走化性チャンバーを入力したときに細菌が線状グラデーションが発生したことを示している。 図2A及びBは E.の蛍光画像を示していますアスパラギン酸（0〜100μM）とNISO 4（0 225μM）の勾配に応じて、 大腸菌 RP437移行。観測されたこれらの標準的な誘引への対応と撥は、予測されている。 図3Aは Eの定量分布を示す大腸菌 RP437 濃度勾配が存在しない場合（すなわち、アスパラギン酸のヌル勾配）で、一方、図3BおよびCは、アスパラギン酸とNISO 4の勾配で分布を示す。これらの応答の特異性（すなわち、移行のバイアスは）E.として明らかである大腸菌 RP437Δ タールひずみ（すなわち、アスパラギン酸とニッケルを検知するために、大腸菌で使用されているタールの化学受容器を欠いた株は）アスパラギン酸またはNISO 4の濃度勾配の存在下での移行のバイアスを示すものではありません。空間分布のプロファイルで明らかな傾向は、また計算されたCPCとCMC値と一致している。 E.の移行のためのCPCの値アスパラギン酸またはNISO 4の勾配で大腸菌 RP437は、それぞれ0.33と-0.33です。対応するCMC値はそれぞれ0.13と-0.14です。 E.とは対照的に、CPCとCMCは、値アスパラギン酸またはNISO 4の勾配で大腸菌 RP437Δ タール菌株はごくわずかです。さらに、アスパラギン酸のヌル勾配でCPCとCMCは、それぞれ0.03と0.02、であり、勾配がない場合の移行におけるバイアスの欠如を示している。 <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="図1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="図1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1b"> 図1。デバイスの回路図と濃度勾配 。 （A）マイクロ流体走化装置の模式図を。このデバイスは、勾配混合モジュール（20 × 100 × 18750程度）と走化性の観察モジュール（20 × 1050 X 11500程度）で構成されています。デバイスに入る2つの勾配のチャネルの幅は500μmであり、細菌の入口の幅は50μmである。挿入図は、シグナル伝達分子（灰色）とそれに反応して移行する細菌の勾配を示しています。死菌がオープン楕円形として示されているのに対し、生菌は、固体楕円形として描かれている。 （B）0から100 ng / mLのフルオレセインの間に濃度勾配は、デバイスで生成され、蛍光顕微鏡を用いて画像化した。蛍光画像は、30分後に取得し、画像解析によって定量した。 <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 E.の走化性マイクロ流体デバイスにおける大腸菌 RP437。 大腸菌は、RP437は、（）0から100μML -アスパラギン酸または（B）0から225までのデバイスでμMNISO 4とL -アスパラギン酸または離れてニッケルから向かって生菌のマイグレーション（緑）の勾配にさらされていた30分間ごとに2.5秒をイメージ。死菌（赤）は、デバイスのフロー効果のためのコントロールとして役立った。画像は、分析PROGRAM3を開発した社内で使用して定量した。示されたデータは、3つの独立した実験から代表的な擬似カラー画像です。 <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="図3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="図3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="図3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3c"> 図3：標準的な誘引と忌避剤への移行プロファイルの定量化。 （）一様100μMのL -アスパラギン酸（すなわち、無勾配）、アスパラギン酸の（B）0 100μMの勾配、およびNISO 4の（C）0 225μMの勾配に応じて、マイクロ流体デバイスにおけるRP437の空間分布。死んだ細胞の分布は実線として表示され、RP437細胞の分布は、破線で示されている、とRP437 EDA +Δ タール細胞の分布は点線として表示されます。ここに示すデータは、3つの独立した実験のために平均化されています。

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

真央ら 5で説明される走化性の分配係数（CPC）と走化性の移行係数（CMC）を計算することができます。細胞が高濃度側で検出された場合は低濃度側で検出されたセルは、-1の値を与えているのに対し、それは、+1の値を与えられます。値は合計し、単価を生成するセルの合計数によって分けられています。 CPC（正または負）の符号は、移行の方向（信号から向かってまたは離れて）になります。 CPCは、細胞が誘引や忌避剤などの化学物質に応答するかどうかを示すものの、それは走化性の程度を定量化していません。このため、我々は64のセクション（セル入口の両側では32）にデバイスの幅を横切って細菌の空間分布のプロファイルを分割し、との距離に基づいて、各セクションのセルに重み係数を割り当てることによって、CMCを計算する移行。彼らは最大距離を移行した細胞が含まれているので、中央（セクション1〜64）から最も遠い部分は+1（= 31.5/31.5）または-1で乗算されます。次の2つのセクションは（2、63）0.968（= 30.5/31.5）または-0.968が乗算される。最後の2つのセクション（すなわち、セルの入口に最も近い...

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

走化性は、細菌が誘引物質の源にアプローチするか、撥化学物質の発生源を避けることができます。細菌は、常に数秒前の検出濃度に現在の濃度を比較することによって、特定のchemoeffectorsの濃度を監視する。この比較では、運動の正味の方向を決定します。複数の、競合する勾配がしばしば自然の中で共存していますが、細菌の走化性を調査するための従来のアプローチは、誘引と忌避剤の濃度勾配に反応して移行を定量化するための次善のです。ここで、我々は、細菌にchemoeffectorsの正確で安定した濃度勾配を提示し、定量的に適用される勾配への応答を調べるためのマイクロ流体走化性モデルの開発について説明します。デバイスは、任意の所望の絶対濃度と勾配の強さのその濃度勾配で汎用性が容易に拡散混合によって生成することができます。デバイスは、応答のを使用して示されている<em&gt;大腸菌</emアミノ酸とニッケルイオンの勾配へ&gt; RP437。

このプロトコルは、chemoeffectorsの安定した濃度勾配で細菌の走化性を調べるためのマイクロ流体デバイスの開発を説明します。

走化性は、細菌が誘引物質の供給源に接近したり、忌避物質の供給源を回避したりすることを可能にします。細菌は常に...

E Coli RP 4 37を化学走性装置に導入し、定義された空間的な濃度勾配にさらします。チャンバーに進入した細胞は、濃度勾配の中間点に到達します。シグナルが誘引物質として認識されるか、あるいは忌避物質として認識されるかに応じて、細菌は濃度勾配を上昇または下降するように迅速に移動します。こんにちは、テキサスA&amp;M大学の分子システムバイオテクノロジー研究室および化学工学科のデレク・エングラーです。本日は、マイクロ流体デバイスを用いて細菌の走化性を調査する手順について説明します。私たちの研究室では、この手順を用いて、硫酸ニッケルの濃度勾配におけるE. coli RP437の移動について研究しています。それでは始めていきましょう。流路層と制御層は、SU-8マスターからポリメチルSUBOXANEまたはPDMSをレプリカ成形して作製します。この手順を開始するには、PDMS前ポリマーと架橋剤を10対1の重量比で混合します。気泡がなくなるまで、デシケーター内で混合物を1時間脱気します。PDMS混合物の準備ができたら、SU-8マスターをシャーレに入れ、目的の厚さになるように混合物をSU-8マスターの上に注意深く注ぎます。PDMSとSU-8マスターモールドが入ったシャーレを80 °Cで2時間加熱し、PDMSを硬化させます。2時間後、ホットプレートから硬化したPDMSで覆われたSU-8マスターを取り出し、SU-8マスターからPDMSモールドを剥がします。目的の構造がPDMSモールド内に埋め込まれています。20ゲージの鈍端針を用い、グラジエントジェネレーター、細胞入口、および細胞出口へのチューブを接続するための穴を、PDMSモールドに4箇所開けます。これで、PDMSデバイスを組み立てて接合させる準備が整いました。まず、ガラス顕微鏡スライドをイソプロパノールで洗浄し、Airstreamで処理します。次に、プラズマエッチャーを用いて、PDMSモールドとガラススライドを約30秒間酸素プラズマにさらします。PDMSモールドをガラススライドに密着させ、密着させたスライドとPDMSモールドをホットプレート上で65 °Cで15分間加熱します。PDMSデバイスを組み立てるには、カミソリを使用して、顕微鏡のセットアップに応じて必要な長さにチューブを45度の角度で切断します。次に、ピンセットを用いて、チューブの一端をデバイスに開けられた4つの穴のいずれかに挿入します。チューブのもう一方の端に、30ゲージの鈍端針のハブを挿入します。残りのすべての穴に対しても、チューブと針のハブの挿入を繰り返します。3 mLのシリンジに、1 mLのchemo taxes、バッファー、またはCBを充填します。シリンジ内から空気を除去するように注意してください。ピペットを用いてアウトレットニードルハブにCBを加え、ニードルハブを軽く叩いて気泡を除去します。3 mLシリンジの先端からCBを少量押し出し、空気が入らないようにシリンジをニードルハブに接続します。残りのニードルハブがすべてCBで満たされるまで、デバイスにCBを押し込みます。これにより、気泡の大部分が除去されます。次に、テスト対象のケモエフェクターを適切な濃度で含むCBを、500 µLシリンジ2本に充填します。シリンジの内容物を少量押し出し、針のハブ部分に液滴があることを確認してシリンジを取り付けることで、気泡の形成を取り除き、運動性の高い細菌を準備します。化学走性実験では、GFP発現プラスミドを保持するe coli RP 4 37を、トリプトンブロスまたはTB培地を用い、32 °Cで振盪しながら一晩培養します。翌日、この一晩培養液を用いて、250 mLのエルレンマイヤーフラスコに入れた20 mLのTB培地に接種し、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が約0.05になるように調整します。細胞のOD 600が約0.35から0.45になったとき、32°Cで振盪培養します。低速遠心分離で細胞を回収し、チャネルの中央で予想される濃度の化学 effector を含むCBを用いて、OD 600が約0.35になるように細胞を再懸濁します。最後に、GFP発現生細胞に、OD 600が約0.35のRFP標識死細胞を添加します。これらの死細胞は、細胞の移動が流動の影響によるものではないことを確認するための内部コントロールとして使用します。これで、化学走性実験のためにマイクロ流体デバイスにロードする準備が整った細胞懸濁液が完成しました。化学走性実験を開始するには、細胞注入用ニードルハブからCBを一部取り除き、細胞懸濁液で満たします。再懸濁した細胞を50 µLシリンジにゆっくりと吸い込みます。鞭毛がせん断されると運動性が低下するため、この操作は慎重に行ってください。以前に示した方法に従い、シリンジの内容物を少量押し出して滴を作り、その滴をニードルハブ内の液体に接触させながら50 µLシリンジをインレットニードルハブに装着します。その後、画像取得用の高速カメラを備えた蛍光顕微鏡のステージ上にデバイスを設置します。両方の入口シリンジをシリンジポンプにセットし、グラジエントが形成され、細胞がチューブ内を流れるようにフローを開始します。細胞が化学走性チャンバーに入ったら、システムが安定するまで約20分間待ちます。イメージングを行う前に、チャンバーの長手方向に沿った異なる位置で、生存細胞の緑色蛍光および死細胞の赤色蛍光画像を収集します。通常、各位置において3秒間隔で100枚の画像を収集します。取得した蛍光画像は、Image Jやmetamorphなどの市販の画像解析プログラム、またはMATLABで記述した簡単なコードを用いて解析することが可能です。本例では、MATLABコードを使用します。まず、この閾値ピクセル強度を設定して画像内の背景ピクセルを除去し、閾値未満の強度を持つすべてのピクセルを削除します。これにより、ノイズを最小限に抑えることができます。解析では、死細胞の位置を用いて画像の中心を決定します。これは、細胞が化学走性チャンバーに進入した位置であり、遊走が全くない場合に検出される位置を表します。次に、画像内の生細胞を特定し、画像をチャンネルに分割して、各チャンネル内の生細胞数を決定します。我々の先行研究では、幅 50 µm の化学走性チャンバーを、それぞれ幅約 16 µm の 64 個のチャンネルに分割しました。すべての画像に対してこれらの手順を繰り返した後、全画像にわたる各チャネルの総細胞数を算出します。これにより、実験期間中に各チャネルで検出された総細胞数が得られます。次に、遊走方向を示す化学走性分画係数（CPC）を計算します。以下の手順に従い、死細胞の高濃度側（右側）に位置する各細胞に+1の乗数を、低濃度側（左側）に位置する各細胞に-1の乗数をそれぞれ割り当てます。これらすべての乗算値を合計し、検出された全細胞数で正規化します。これにより、細胞が移動した距離に応じて移動の重みを付ける化学走性移動係数（CMC）を算出します。最高濃度側の最も遠い位置（チャネル64）まで移動した細胞には+1の重み係数を、高濃度側へ半分まで移動した細胞には+0.5の重み係数を与えます。また、最低濃度側の最も遠い位置まで移動した細胞には-1の重み付けをします。これらすべての重み付けされた細胞数の合計を求め、それを細胞数で正規化することでCMCを算出します。このグラフは、フルオレセインイソチオシアネートを用いてマイクロ流体デバイス内に形成された線形濃度勾配またはプロファイルを示しています。この図では、青色と黄色の色素を用いて濃度勾配の形成を実証しています。細胞導入部はCAであったため、そこを通過する流れはなく、青色から黄色までの範囲の色が形成されていることがわかります。これらは、デバイス内でe coli RP 4 37を0から100 µMのL-aspartateまたは0から225 µMの硫酸ニッケルの濃度勾配にさらした、代表的な化学走性実験の擬似カラー画像です。生きた緑色の細菌がL-aspartateに向かって、あるいはニッケルから遠ざかって移動する様子を、30分間にわたって2.5秒ごとに撮影しました。赤色で示されている死菌は、デバイス内での流れによる影響を評価するためのコントロールとして使用されました。勾配がない状態におけるマイクロ流体デバイス内のRP 4 37の空間分布を、アスパラギン酸勾配および硫酸ニッケル勾配に対する応答と比較してこのグラフに示しています。ここでは、硫酸ニッケル勾配におけるe coli RP 4 37の化学走性をモニタリングする方法を説明しました。この手順を行う際は、高い運動性を有するサブポピュレーションを利用できるよう、細胞のボルテックス処理を最小限に抑えることが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロ流体チャネルおよび斑状の栄養の海の風景とせん断流内細菌の遊泳行動の中で海洋微生物の化学走性採食行動を研究するための実験で、その実装の製造が記載されている。...

マイクロスケール栄養層への海洋微生物の走化性応答

マイクロ流体を用いた細菌走化性の研究 - インタビュー

我々は明確に定義された微小環境における空間的および時間的勾配を生成することができる勾配を発生するマイクロ流体デバイスの微細加工のためのプロトコルについて説明します。このアプローチでは、勾配を発生するマイクロ流体デバイスは、指示細胞の遊走、胚形成、創傷治癒、癌の転移を研究するために使用することができます。...

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

マイクロ流体装置を用いた細菌の運動性評価

このビデオでは、オールオンチップ法を使用した好中球走化性アッセイを実演しています。この方法では、免疫磁気陰性選択とそれに続くマイクロ流体チップ上の走化性アッセイにより、全血から好中球を直接分離できます。...

全血を用いた迅速な好中球走化性分析のためのマイクロ流体チップベースの方法

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。...

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。...

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

マイクロ流体およびミリ流体のセットアップ内の光の解析による動的化学景観の生成のためのプロトコルが提示されます。この方法論は、単一細胞および集団レベルの両方で、運動行動、栄養取り込み、または微生物の化学物質への適応を含む多様な生物学的プロセスを研究するのに適している。...

微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

ここで提示される、環境中の微生物行動の研究を直接可能にする最近開発されたマイクロ流体装置であるin situ...

水生生態系における微生物行動を調べるSitu chemotaxisアッセイで

ここでは、複数の濃度応答を同時に取得しながら細菌群動性を評価するためのインデューサーグラジエントプレートの使用について説明します。...

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

学ぶマイクロ流体デバイスを用いた細菌走化性の定量化手法。E. coli RP 4 37を用いて安定した濃度勾配における細菌の移動を解析し、化学刺激応答メカニズムの理解を深める。

安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

さらに動画を探す