安定した濃度勾配で細菌走化性を定量化するためのマイクロ流体デバイス

大腸菌RP 4 37は、走化性デバイスに導入され、定義された空間集中にさらされます。チャンバーに入るグラジエント細胞は、濃度グラジエントの中点に遭遇します。シグナルが誘引剤として認識されるか、忌避性として認識されるかによって、細菌は濃度勾配を急速に上下に移動します。

こんにちは、テキサス大学とマサチューセッツ大学の分子システムバイオテクノロジー研究所および化学工学科のデレク・エングラーです。今日は、マイクロ流体デバイスで細菌の化学療法税を調査する手順を紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、大腸菌RP4 37が硫酸ニッケルの濃度勾配でどのように移動するかを研究しています。

それでは始めましょう。流動層と制御層は、SUエイトマスターのポリメチルスボキサンまたはPDMSのレプリカ成形によって作られています。この手順を開始するには、PDMSプレポリマーと架橋剤を10対1の重量比で混合します。

気泡が除去されるまで、混合物を乾燥させて1時間脱気します。PDMS混合物の準備ができたら、SU 8マスターをシャーレに入れ、SU 8マスターの上に混合物を希望の厚さまで慎重に注ぎます。PDMSとSU8マスターモールドが入ったシャーレを摂氏80度で2時間かけてPDMSを硬化させます。

2時間後、硬化したPDMSで覆われたSSU 8マスターをホットプレートから取り外し、SU 8マスターからPDMSモールドを剥がします。目的の構造は、グラジエントジェネレーター、セルインレット、およびセルアウトレットへのチューブ用のPDMSモールドの4つの穴に20ゲージの鈍いエンドニードルパンチを使用してPDMSモールドに埋め込まれます。これで、PDMSデバイスをボンディングするためのPDMSデバイスを組み立てる準備が整いました。

まず、ガラス顕微鏡スライドをイソプロパノールで洗浄し、エアストリームで試してみます。次に、PDMSの型とスライドガラスをプラズマエッチャー内の酸素プラズマに約30秒間さらします。PDMS金型をスライドガラスに接触させる:接触したスライドとPDMS金型をホットプレート上で摂氏65度に15分間加熱します。

PDMSデバイスを組み立てるには、かみそりの刃を使用して、顕微鏡のセットアップに応じて必要な正しい長さにチューブを45度の角度で切断します。次に鉗子を使用します。チューブの一方の端を、デバイスに開けられた4つの穴のいずれかに挿入します。

鈍い30ゲージのニードルハブをチューブのもう一方の端に挿入します。残りのすべての穴に対してチューブとニードルハブの挿入を繰り返します。1ミリリットルの化学療法税、バッファー、またはCBを3ミリリットルの注射器に装填します。

シリンジから空気を取り除くように注意してください。ピペットを使用してCBを出口ニードルハブに追加し、ニードルハブを軽くたたいて気泡を取り除きます。3ミリリットルのシリンジの先端からCBを少し押し出し、シリンジをニードルハブに接続します。

残りのすべてのニードルハブがcbで満たされるまで、CBをデバイスに押し込みます。これにより、気泡の大部分が除去されます。次に、2つの500マイクロリットルシリンジに、試験対象のケモエフェクターの適切な濃度を含むCBを満たします。

シリンジの内容物を少量押し出し、ニードルハブ内の液滴に触れてシリンジを取り付けて高運動性細菌を調製することで、気泡の発生を解消します。走化性実験では、GFP発現で大腸菌RP 4 37を一晩培養し、プラスミドをトリプトンブロスまたはTBで摂氏32度で翌日振とうします。一晩培養を使用して、250ミリリットルの三角フラスコに20ミリリットルの結核培養液を接種し、600ナノメートルの光学密度が約0.05になるようにします。

細胞が約0.35〜0.45のOD600にあるときに振とうしながら、摂氏32度で培養物を増殖させます。低速遠心分離により、チャネルの中央で予想される濃度のケモエフェクターを含むCB中のOD600に細胞を約0.35のODに懸濁液で回収します。最後に、約0.35のNo D 600でRFP標識死細胞をGFP発現生細胞に加えます。

これらの死細胞は、移動がフロー効果によるものではないことを確認するための内部制御になります。これで、細胞懸濁液を走化性実験のためにマイクロ流体デバイスにロードする準備が整いました。走化性実験を開始するには、細胞懸濁液を補充する細胞入口ニードルハブからCBの一部を取り外します。

50マイクロリットルのシリンジに再懸濁した細胞を静かに満たします。鞭毛が剪断され、運動性が低下する可能性があるため、これをゆっくりと行ってください。50マイクロリットルのシリンジをインレットニードルハブに取り付けます 前に示したように、シリンジの内容物の小さな滴を押し出し、ニードルハブ内の液体にその滴を触れてシリンジを取り付け、画像取得用の高速カメラを備えた蛍光顕微鏡のステージ上にデバイスを配置します。

両方のインレットシリンジをシリンジポンプにセットし、グラジエントが形成され、細胞がチューブを流れるように流れを開始します。細胞が化学療法チャンバーに入ったら、システムが安定するまで約20分待ちます。イメージングの前に、チャンバーの長さに沿ったさまざまな場所で、生きた緑と死んだ赤色の蛍光画像を収集します。

通常、各場所で 100 枚の画像を 3 秒間隔で収集します。取得した蛍光画像は、Image Jやmetamorphなどの市販の画像解析プログラム、またはmatlabで記述された簡単なコードを使用して解析できます。この例では、MATLAB コードを使用します。

まず、この設定されたしきい値ピクセル強度を使用して画像内の背景ピクセルを削除し、しきい値よりも強度が低いピクセルをすべて削除します。これにより、ノイズが最小限に抑えられます。解析では、死んだ細胞の位置を使用して画像の中心を決定します。

これは、細胞が走化性チャンバーに入った位置と、移動がない場合に細胞が検出される場所を表しています。次に、画像内の生細胞を見つけ、画像をチャネルに分割し、各チャネルの生細胞の数を決定します。以前の研究では、幅 10 マイクロメートルの 50 マイクロメートルの化学療法タックス チャンバーは、それぞれ幅が約 16 マイクロメートルの 64 チャネルに分割されていました。

すべての画像に対してこれらの手順を繰り返すと、すべての画像にわたる各チャネルの合計セル数の一部が計算されます。これにより、実験期間中に各チャンネルで検出された総細胞数が得られます。移民の方向を表す化学療法税、分配係数、またはCPCを計算します。

次の手順を実行して、死細胞の高濃度または右側と低濃度または左側にある各セルにプラス 1 とマイナス 1 の乗数を割り当てます。すべての乗算値を合計し、検出されたセルの総数に正規化します。化学療法税、移動係数、または細胞の移動を移動距離で重み付けするCMCを計算します。

最も遠い高濃度位置チャネル64に移動するセルには、プラス1の重み係数が与えられ、一方、高濃度側に半分移動するセルには、プラス0.5の重み係数とセルが与えられる。最も遠い低濃度位置に移動すると、マイナス 1 で重み付けされます。すべての重み付けされたセル数の一部と、CMCを生成するためのセル数に正規化されます。

このグラフは、フルオレセインイソチオシアネートを使用したマイクロ流体デバイスで形成された線形濃度勾配またはプロファイルを示しています。濃度勾配の形成は、この図で青色と黄色の着色料を使用して示されています。セル入口はCAであったため、そこを通る流れはなく、青と黄色の範囲

これは、大腸菌RP 4 37をデバイス内で0〜100マイクロモルのLアスパラギン酸またはゼロ〜225マイクロモルの硫酸ニッケルの勾配に曝露した代表的な走化性実験からの疑似カラー画像です。生きた緑色細菌がアルアスパラギン酸またはニッケルから離れる移動を、2.5秒ごとに30分間画像化しました。赤で示されている死んだバクテリアは、デバイス内のフロー効果の制御として機能しました。

勾配がない場合のマイクロ流体デバイスにおけるRP4 37の空間分布を、アスパラギン酸勾配および硫酸ニッケル勾配に対する応答と比較して、このグラフに示しています。私たちはちょうど硫酸ニッケルの勾配で大腸菌RP 4 37の化学療法税を監視する方法を示しました。この手順を実行するときは、細胞のボルテックスを最小限に抑えて、高い運動性亜集団を使用できるように注意することが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。