スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

このビデオでは、Styro Dye FM 1 43 の光変換の手順を実演します。drosophila melanogaster のシナプス小胞プールの研究では、まずショウジョウバエの幼虫を解剖して、神経筋接合部（NMJ）標本を構成する腹側筋肉を露出させます。これらの標本を、細胞膜を染色する FM D（ここでは灰色で表示）を含むバッファー中でインキュベートします。

その後、電気的または化学的な刺激を与え、物理的な融合を誘導し、それに続く小胞膜の内部移行を引き起こします。刺激された開口放出はFM色素で染色します。次に、細胞外のFM色素を洗浄して細胞膜から除去し、高強度の光を連続的に照射しながら組織を固定します。色素は完全に脱色され、ジアミノベンジジン（DAB）の沈殿によって黒色に発色します。

この沈殿物は、透過型電子顕微鏡（TEM）で可視化することができます。こんにちは、ドイツのガオンにある欧州神経科学研究所のSylvia Olli研究室のPhilippe o Pasoです。本日は、神経筋接合部におけるFM光変換の手順をご紹介します。

当研究室では、シナプス小胞のリサイクリングを研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。解剖顕微鏡下で作業を行います。まず、Drosofilla幼虫を背側が上になるようにし、Sylgardコーティングされたディッシュにピンで固定します。

シリンジの針を用いてドロソフィラ用生理食塩水で覆い、解剖用はさみで背面を縦方向に切開します。次に、内臓を除去します。その後、試料を広げ、再びシャーレにピンで固定します。

その後、いくつかの腹側筋肉を用いて、本手順で使用されるFM染料を退色から保護することができます。この手順は低照度下で行ってください。ピンセットで固定したショウジョウバエの標本を、90 mMの塩化カリウムと10 µMのFM 1-43を含むショウジョウバエ生理食塩水で覆い、神経を化学的に刺激します。

刺激後、室温で1分間インキュベートします。刺激溶液を除去し、ピン留めしたdrosophilaを準備したビーカーに2回浸漬させます。ビーカーには100 millilitersのdrosophila salineを満たし、化学安全フード内で細胞外のFM 1 43染料を除去します。

神経筋接合部の標本を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製した2.5%グルタルアルデヒド中で、室温で45分間固定します。標本をPBSで1回洗浄し、シガーディッシュから取り出して100 millimolar塩化アンモニウムに15分間浸漬します。これにより、残存するグルタルアルデヒド固定剤の遊離アルデヒド基をクエンチします。

通常のPBSを用いて塩化アンモニウム溶液を洗浄し、神経筋接合部標本を新しいシガーディッシュに移して、ろ過済みの1.5 mg/mLのジアミノベンジジン（DAB）含有PBSに浸し、4 °Cで30分間インキュベートします。バックミラー付きのランプハウジングを備えた水銀ランプ光源搭載の蛍光顕微鏡の下にサンプルを配置し、比較的低倍率のドライ対物レンズを使用します。

サンプルを探します。次に、通常の青色励起・緑色蛍光フィルターキューブを使用して、蛍光信号にピントを合わせます。神経筋接合部は、筋肉上の明るい点として現れます。

次に、同じ蛍光フィルターセットを使用し、FM Dが完全に退色するまで最大強度でサンプルを照射します。20倍の対物レンズを使用する場合、30～45分で十分なはずです。ただし、光変換に要する時間は、照射強度、標本へのDABの浸透力、および使用する対物レンズによって異なります。

光照射後、透過光を用いてサンプルを観察します。光変換が起こっている場合、暗褐色の沈殿が確認できるはずです。解剖顕微鏡に戻り、ハサミを使用して幼虫から光変換した部位を切り出します。

解剖用顕微鏡に戻ります。次に、ハサミを使用して、幼虫から写真変換された部位を切り出します。その後、手袋や保護メガネなどの適切な安全装備を着用し、化学安全フードの下で、サンプルをPBSを含むマイクロ遠心チューブに入れます。

サンプル1つにつき、1%四酸化オスミウム溶液を300 µL用意します。次に、サンプルをプラスチック蓋付きのガラスフラスコに入れ、用意した四酸化オスミウム溶液を加えて後固定を行います。サンプルのインキュベーション中に、30%、50%、70%、90%、95%、および100%のエタノールを含む各溶液を個別に調製します。

PBSを用いて、サンプルを5分間ずつ4〜5回洗浄します。各洗浄後、ピペットにプラスチック製のPEsを取り付け、サンプルを新しいフラスコに移します。最後の洗浄後、サンプルを清潔なガラス製フラスコに移します。

次に、サンプルを段階的なエタノール溶液に浸し、脱水を行います。まず、1 mLの30%エタノールでインキュベートします。5分後、パステールピペットを用いてエタノールを除去し、1 mLの50%エタノールに置換します。

脱水処理を継続し、神経筋接合部の標本を70%、90%、次に95%の溶液で順次インキュベートします。その後、標本を95%エタノール溶液で浸漬し、脱水後には100%エタノールで3回インキュベートします。エタノールに1:1の割合でEIN樹脂を2 mL加え、標本をロータレーターに入れ、インキュベートします。

100% EINで回転させた後、室温で2〜4時間置き、さらにサンプルを開口フラスコに入れ、残りのエタノールを4〜6時間かけて蒸発させます。新しいEINを型に注ぎます。調製物を加え、60 °Cで36時間インキュベートします。

EIN埋込標本の準備が整ったら、ウルトラミクロトームとダイヤモンドナイフを用いて、厚さ50〜80 nmの薄切片を作成します。試料を薄切し、切片をナイフの水槽に浮かせてから、通常のEMグリッドで回収します。

これで、従来のEM手順を用いてイメージングを行う準備が整いました。Drosophila melanogasterから単離した神経筋接合部を高カリウムで刺激し、内在化した膜を、ここに示すようにFM 1-43で染色しました。

神経終末の蛍光は、一般的な落射型蛍光顕微鏡を用いて観察できます。連続照射下では、染料は完全に退色し、さらに照射を続けるとジノベンジンの沈殿によって黒色が現れます。この神経終末にはシナプス小胞が含まれていますが、それらが光変換されることはありません。

これは、照明が不十分であるか、組織へのDIAアミノベンジンの浸透が不十分であることが原因である可能性があります。対照的に、照明が強すぎると、全体的に暗い末端となり、小胞やオルガネラを識別できなくなります。適切な量の照明による光変換は確認可能です。この顕微鏡写真には、暗い小胞の集団が見られるシナプスボタンが示されており、FM光変換が起きていることを示しています。

Femダイで標識したシナプス小胞を光変換する方法について説明しました。この手順を行う際は、変換ステップにおける照射時間を常に慎重に校正することが重要です。以上で終了です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。