Name: スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぼう、FM染料の光変換法を用いてDrosophila melanogasterの神経筋接合部におけるシナプス小胞プールを可視化する手法。この方法はシナプス動態のメカニズム解明に有用です。

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キイロショウジョウバエ神経筋接合部の1）準備（NMJ） <ol><li>標準ショウジョウバエ生理食塩水を（130 mMのNaCl、36 mMスクロース、5mMのKClを、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、5mMのHepes緩衝液、pH 7.3 4準備。 </li><li>生理食塩水（1.1）の準備を細かく分析。ショウジョウバエの幼虫は、Sylgard皿に背側を上向きにしてpinedされ、背側には長手方向の切片であり、そして内臓は削除されます。準備は、引き伸ばされ、pinedれる。いくつかの腹側の筋肉は、使用することができます。 </li></ol> 2）刺激とFM染色<ol><li>漂白からFM染料を保護するために、暗い場所でもすべて、次の手順を実行することをお勧めします。 </li><li>神経の化学的刺激の場合は、高カリウムバッファーが使用されます。塩化カリウムの90 mMのとFM1 -​​ 43色素の10μMを含む（1.1参照）ショウジョウバエ生理食塩水を準備します。光から保護ソリューションをキープ。 </li><li>バス、室温で1分間、事前に準備されたバッファと準備。 </li><li>細胞外FM1 -​​ 43色素を除去するために標準のショウジョウバエ生理食塩水（1.1）で洗浄する。固定するために急速に進んでください。 </li></ol> 3）固定<ol><li>室温で45分間リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2.5％グルタルアルデヒドを有する製剤バス。形態学的特徴の良い保全のために、グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドが好ましい。 </li><li> PBSで1回洗浄し、その後NH 4 Clの100mMのに15分間水没の準備を残す。このステップは、残りのグルタルアルデヒド固定液の遊離アルデヒド基をクエンチするために行われます。 </li><li>通常のPBSでNH 4 Cl溶液を洗い流す。 </li></ol> 4）光変換<ol><li> 4℃で30分間NMJの準備をインキュベートしますPBSでCは、ジアミノベンジジン（DAB）の1.5mgのML - 1を含む。 </li><li>蛍光顕微鏡下でサンプルを置きます。比較的低倍率の水浸対物レンズ（20倍0.5 NA）を用いて蛍光シグナルを検出し、フォーカス。 </li><li> FMの染料は、（図1C）、完全に漂白されるまでの最大ランプ強度とサンプルを照らす。光変換が発生したかどうかを制御するために、FMの染料漂白段階の前後に透過光の下にサンプルで確認することをお勧めします。光変換が行われる場合、暗褐色の沈殿物が（図1C）が期待される。照明時間は、準備にDABの浸透時にも、照明の強さとに応じて、変数です。ほとんどの準備のために、我々は20倍の対物レンズを用いて時〜30〜45分の照射時間が最適であることがわかった。短いイルミネーション期間は、より高い倍率の目標（60倍）に使用されます。 </li><li>照明のために我々は、後方散乱光を収集し、そのため全体の強度を増加させるバックミラーを、含んでいるランプハウジングと、水銀ランプを使用することを好む。 </li></ol> 5）EMのサンプルを処理<ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li>水の木の量のオスミウム四酸化（サンプルあたり約300μL）の一冊で解決策を準備。四酸化オスミウムを使用して作業は手袋とアイアイの保護装置を使用して、フードの下で行う必要があります。 </li><li>室温で1時間四酸化オスミウム溶液（フードの下で）の準備をインキュベートする。 </li><li> PBSで洗う（4-5回5分）と清浄なガラスのフラスコに各サンプルを移す。 </li></ol></li><li>脱水<ol class="lalpha"><li> 30、50、70 90、95およびエタノールの100％を含む別の溶液を調製。 </li><li> 5分間、各サンプルに30％エタノール1 mlを追加します。 </li><li> 5分間の各サンプルに50％エタノール1 mlを追加します。 </li><li> 5分間、各サンプルに70％エタノール1 mlを追加します。 </li><li> 5分間、各サンプルに90％エタノール1 mlを追加します。 </li><li> （3倍を繰り返す）5分間、各サンプルに95％エタノール1 mlを追加します。 </li><li> （3倍を繰り返す）5分間、各サンプルに100％エタノール1 mlを追加します。 </li></ol></li><li>埋め込みとその後の処理<ol class="lalpha"><li>エタノールの一冊とエポン樹脂の1ボリュームを混在させる。連続回転の下準備（2-4時間）に追加します。 </li><li>オープンフラスコで100％エポンで準備を置き、残りのエタノールを蒸発させる（4-6時間）。 </li><li> 36時間60℃で金型の準備を置きます。 </li><li>電子顕微鏡の処理。標準ultramicrotomyの手順を使用して、50〜80 nmの薄いセクションで準備を処理します。 </li></ol></li><li>電子顕微鏡イメージング<ol class="lalpha"><li>製剤は、従来のEMの手順を用いて結像​​される。 </li></ol></li></ol> 6）代表結果期待した結果が図1Cと図2に概説されています。仲間の形成における照明の手続の結果蛍光と透過イメージングの両方で表示されるWNのDABの沈殿物、。照明時の最初のオカレンスは、FM色素の染色に関連付けられている蛍光の消失です。アルデヒド系固定液により誘発されるバックグラウンドの蛍光は、対照的に、実験を通して目に見えるようになります。漂白は、照明の開始後〜10〜20分で一般的に行われます。一般的には光電製品は、この時点で観察することはできません。 照明は継続すべきである、と〜10分後の製剤は、それは同時には行われませんなぜDAB降水量とFM色素が漂白不明であるDAB蓄積による茶色の色調（図1C IV）に変わります、それは、その比較的大きな可能性があります酸化DABの量は、凝集し沈殿する前に蓄積する必要があるため、この反応は、漂白工程よりも遅いということ。 DABの降水量はおそらく不完全であるとして、この段階では、しかし、準備には、電子顕微鏡の処理のための準備ができていません。我々は準備（シナプス前神経終末が）完全な変換を示す暗褐色（または黒色）の色を、想定している間に、5〜10分長く待つことを好む。準備の一般的な表面のわずかな変換（例えば、神経筋接合部における筋線維のは）この段階で観察することができます。それはおそらく自家蛍光（および/または固定液蛍光）により誘発されるDABの変換に関連して、そしてそれは、プロシージャに有害ではない。 準備をして電子顕微鏡用に処理され、そしてダーク（ラベル）小胞の有無をチェックする必要があります。我々は5,6の前に説明したように、これらの小胞は、非標識のものよりもはるかに高密度であるため、容易に（図2B）区別されます。よく小胞の異なる種類を区別する機会を増やすために、セクションのないコントラスト増強後の染色は、（無酢酸ウラニルまたはクエン酸鉛で染色）実行されるべきである。オスミウム染色は、ほとんどの携帯電話の要素を観察するのに十分である、ととしてではないDABの沈殿物として暗い。 <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：FM染料、それは光変換のために使用します 。 （A）刺激下でFM色素を使用して小胞をロードするとdistainingのための古典的な実験の手順を表します。 （ 私は ）バッファが含まれているFM色素でサンプルをインキュベートする。 （ⅱ）FM色素の存在下で小胞融合を誘導するために（電気的または化学的）刺激。 （ⅲ）刺激後のサブシーケンスのエンドサイトーシスは細胞外のバッファに残っているFM色素で、いくつかの小胞をロードします。 （ⅳ）バッファーで洗浄することにより細胞外FM色素を交換してください。 （V）新しい刺激がロードされた小胞は、エキソサイトーシスの際、FM色素を解放するために誘発される。 （B）回路図は、FM1 - 43色素のヘッド、ブリッジとテールを示している。 ショウジョウバエ NMJの光電変換実験の（C）の例。 （ⅰ）外部色素分子と固定し、洗浄、FM1 - 43でNMJをロードした後、神経末端の蛍光は、従来の落射蛍光顕微鏡（63x）で観察することができます。 （II - III）の連続照明下では色素が完全に漂白です。 （ⅳ）照明が続くと、黒い色は、ジアミノベンジジンの析出による表示されます。スケールバーは10μmを表す。 <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：photoconvertedサンプルのEMの例（A）画像はシナプス小胞を含む神経端末を示していますが、それらのphotoconvertedであり、これは組織に十分な照明や ​​貧しいジアミノベンジジンの浸透を持っていないことが原因である可能性があります。 （B）FM光変換を経ていくつかの暗い（充填）小胞とシナプスブートン。は小胞やオルガネラは区別がない全体的な暗いターミナルの照明の結果の（C）超過。スケールバーは200nmを表す。

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
<li>Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li>
<li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li>
<li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optically+determined+size+of+exo%2Fendo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li>
<li>Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li>
<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li>
<li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li>
<li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li>
<li>Lange, R. P. J. de, de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li>
<li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li>
</ol>

いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。 <ul><li> DABのインキュベーションは、準備の徹底した洗浄と急冷後に行ってください。そうでなければ非反応グルタルアルデヒドは、DABと相互作用し、（通常は高密度電子ではないフラットな結晶の形で）その降水量が発生します。この降水量が豊富に行われる準備は、電子顕微鏡のためまれに使用できます。 </li><li>照明時間は、異なる照明時間を持ついくつかの同一の準備をテストすることにより、最適化する必要があります。我々の経験では、最適な変換（図2B）は、約5分（例えば、照明の開始後35〜40分）の時間枠で達成されます。不十分な照明（図2A）は、標識された細胞小器官の欠如、および/または部分的に標識された細胞小器官（例えば、その体積の半分だけで、DABを含むように表示される小胞など）によって特徴付けられる。長い照明は、対照的に、オーバー変換の結果はDABの変換製品は、細胞質ゾル（図2C）に細胞小器官とエスケープを歪め、蓄積。準備はほとんど観察形態で、電子顕微鏡の黒い構造として表示されます。 </li></ul>我々は線虫Ca...

<table><tbody><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen</td><td>F10317</td><td></td></tr><tr><td>エポン樹脂</td><td>Plano GmbH</td><td>R1030</td><td></td></tr><tr><td>ジアミノベンジジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>50% グルタルアルデヒド</td><td>AppliChem</td><td>A3166</td><td>EMグレード</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>104186298</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x 0.5 NA 対物レンズ</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td>ドライ対物レンズ</td></tr><tr><td>100W 水銀ランプ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>背面ミラー付きランプハウジング</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>1007-980</td><td></td></tr><tr><td>MRmカメラ</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>0445-554</td><td>画像取得</td></tr><tr><td>励起フィルター (HQ 470/40)</td><td>AHF</td><td>F49-671</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー (495 DCLP)</td><td>AHF</td><td>F33-100</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター (HQ 500 LP)</td><td>AHF</td><td>F42-018</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡 (EM)</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proscan CCD HSS</td><td>Proscan Electronic Sys.</td><td></td><td>1024 x 1024</td></tr></tbody></table>

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

形質膜（エキソサイトーシス）とシナプス小胞の融合は、神経伝達物質の放出と神経細胞のコミュニケーションに必要なステップです。彼らは新しいエキソおよびエンドサイトーシスのサイクル（小胞のリサイクル）を受けるまで、小胞はその後、形質膜（エンドサイトーシス）から取得し、神経終末内の小胞の一般的なプールと一緒にグループ化されます。これらのプロセスは、電子顕微鏡、電気生理学的記録、アンペロメトリーとキャパシタンスの測定など、さまざまな手法を用いて研究されている。重要なのは、最後の二十年の間に蛍光標識したマーカーの数は、光学技術は、そのリサイクルのダイナミクスに小胞を追跡できるように、浮上した。最も一般的に使用されるマーカーの一つは、スチリルまたはFM色素1であり、構造的に、すべてのFM色素は親水性の頭部と芳香環と1つまたは複数の二重結合（図1B）を介して接続親油性尾が含まれています。小胞のプールをラベル付けするために古典的なFM色素の実験は、神経の刺激（電気的または高K +の）中に色素と（図1Ai）準備の入浴で構成されています。これは最近、エンドサイトーシス小胞（図1A I - III）に小胞のリサイクルと染料のその後のロードを誘発する。染料、色素フリーバスの刺激の第二ラウンドで小胞をロードした後にエキソサイトーシスを介してFMのリリース（図1A IV - V）、蛍光強度の減少（脱色）を監視し続けることができますプロセスの引き金となるでしょう。 FM色素が小胞のリサイクルの分野に大きく貢献しているが、それは従来の蛍光顕微鏡を使用して、個々の小胞の正確な局在や形態を決定することはできません。また、光変換を介して、電子顕微鏡を用いてエンドサイトーシスのマーカーとして使用する方法をFM色素そのため、我々はここで説明する。光電変換技術は、強烈な照明下での活性酸素種を生成する蛍光色素のプロパティを利用している。蛍光標識された調製物は、ジアミノベンジジン（DAB）を含む溶液に浸漬し、点灯されています。色素分子によって生成される反応種は暗い外観を持っているし、簡単に電子顕微鏡2,3で区別することができる安定した、不溶性の沈殿物を形成するDABを、酸化する。 DABにのみ蛍光分子（活性酸素種は短命であるため）のすぐ近くに酸化されるように、テクニックだけ蛍光標識構造は電子密度の高い沈殿物を含むとしていることを保証します。テクニックは、このように積極的に細胞内小器官のリサイクルの正確な位置と形態の研究をすることができます。

FM色素は、シナプスのダイナミクスの理解に非常に貴重な助けとなった。 FMSは、通常、異なる刺激条件の中に蛍光顕微鏡下で続いている。しかし、電子顕微鏡と組み合わせてFM色素の光変換は、シナプスboutonsで、他の超微細構造のコンポーネント間で、明確なシナプス小胞プールの可視化が可能になります。

シナプス小胞の細胞膜との融合（開口放出）は、神経伝達物質の放出およびニューロン間通信において不可欠なステップである。...

このビデオでは、Styro Dye FM 1 43 の光変換の手順を実演します。drosophila melanogaster のシナプス小胞プールを研究するために、まずショウジョウバエの幼虫を解剖し、神経筋接合部（NMJ）標本を構成する腹側筋肉を露出させます。この標本を、細胞膜を標識する FM D（ここでは灰色で表示）を含む緩衝液中でインキュベートします。その後、電気的または化学的な刺激を与えて物理的な融合を誘導し、それに続いて小胞膜を内部移行させます。刺激による開口放出はFMダイで染色します。次に、細胞外のFMダイを洗浄して細胞膜から除去し、高強度の照明を連続的に照射しながら組織を固定します。ダイは完全に退色し、ジアミノベンジジンの沈殿によって黒色に発色します。この沈殿物は、透過電子顕微鏡（TEM）で視覚化することができます。こんにちは。私はドイツのガオンにある欧州神経科学研究所のSylvia Olli研究室のPhilippe o Pasoです。本日は、神経筋接合部におけるFM光変換の手順についてご紹介します。当研究室では、シナプス小胞のリサイクルを研究するためにこの手順を用います。それでは、開始しましょう。解剖顕微鏡下で操作を行います。まず、シルガードでコーティングしたディッシュに、ショウジョウバエの幼虫を背側が上になるようにピンで固定します。シリンジの針を用いてショウジョウバエ用生理食塩水をかけ、解剖用ハサミで背面を縦方向に切開します。次に、内臓を取り除きます。その後、サンプルを広げ、再びシャーレにピンで固定します。その後、いくつかの腹側筋肉を用いて、本手順で使用するFM染料を退色から保護することができます。この手順は低照度条件下で実施してください。ピンセットで固定したショウジョウバエの標本を、90 millimolar 塩化カリウムおよび10 micromolar FM 1-43を含むショウジョウバエ生理食塩水で覆い、神経を化学的に刺激します。刺激後、室温で1分間インキュベートします。刺激溶液を除去し、化学安全フード内で、100 mLのショウジョウバエ生理食塩水を満たしたビーカーに、個体を固定したディッシュを2回浸し、細胞外のFM 1-43色素を除去します。神経筋接合部の標本を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で調製した2.5%グルタルアルデヒド中で、室温で45分間固定します。標本をPBSで1回洗浄し、シガーディッシュから取り出して100 millimolar 塩化アンモニウムに15分間浸漬します。これは、残留しているグルタルアルデヒド固定剤の遊離アルデヒド基をクエンチするためです。通常のPBSで塩化アンモニウム溶液を洗浄し、神経筋接合部の標本を新しいシガーディッシュに移して、フィルターろ過した1.5 mg/mLのジアミンベンジジン（DAB）含有PBSに浸し、4°Cで30分間インキュベートします。バックミラー付きのランプハウジングを備えた水銀ランプ光源搭載の蛍光顕微鏡の下に試料を配置し、比較的低倍率のドライ対物レンズを用いて観察します。サンプルを探します。次に、通常のブルー励起・グリーン蛍光フィルターキューブを使用して、蛍光信号に焦点を合わせます。神経筋接合部は、筋肉上の明るい点として現れます。次に、同じ蛍光フィルターセットを使用して、FM Dが完全に退色するまで最大強度でサンプルを照射します。20倍の対物レンズを使用した場合、30～45分で十分なはずです。ただし、光変換にかかる時間は、照射強度、標本へのDABの浸透強度、および使用する対物レンズによって異なります。照射後、透過光でサンプルを観察します。光変換が起こっている場合、暗褐色の沈殿が見られるはずです。解剖顕微鏡に戻り、ハサミを使用して幼虫から光変換した部位を切り出します。解剖顕微鏡に戻ります。次に、はさみを用いて、幼虫から光変換されたスポットを切り出します。その後、手袋や保護メガネなどの適切な安全装置を着用し、化学薬品用安全フード内で、サンプルをPBSの入ったマイクロ遠心チューブに移します。サンプル1個あたり300 µLの1%四酸化オスミウムを調製します。次に、サンプルをプラスチック蓋付きのガラスフラスコに入れ、調製した四酸化オスミウム溶液を加えて固定処理を行います。サンプルのインキュベーション中に、30%、50%、70%、90%、95%、および100%の各エタノール溶液を個別に調製します。サンプルをPBSで5分間ずつ、4〜5回洗浄します。洗浄ごとに、ピペットにプラスチック製PEsを使用してサンプルを新しいフラスコに移動させてください。最後の洗浄後、サンプルを清潔なガラスフラスコに移します。次に、サンプルを段階的なエタノール溶液に浸し、脱水を行います。まず、1 mLの30%ethanolでインキュベートします。5分後、パステラーピペットを用いてエタノールを除去し、1 mLの50%ethanolと置換します。脱水処理を続け、神経筋接合部の試料を70%、90%、続いて95%の溶液でインキュベートします。その後、試料を95%エタノール溶液で数回インキュベートし、脱水後、100%エタノールで3回インキュベートします。1:1のEIN樹脂を2mL加え、試料をロータトレーにセットしてインキュベートします。100% EINで回転させた後、室温で2～4時間保持し、その後サンプルを開口フラスコに入れ、残りのエタノールが蒸発するように4～6時間放置します。新鮮なEINを型に注ぎます。調製物を加え、60 °Cで36時間インキュベートします。EIN包埋試料の準備が整ったら、ウルトラミクロトームとダイヤモンドナイフを用いて、厚さ 50 to 80 nanometer の薄切片を作成します。試料を薄切します。切片はナイフの水槽上に浮遊するため、その後、通常のEMグリッドで回収することができます。これで、従来のEM手順を用いてイメージングを行う準備が整いました。Drosophila melanogasterから単離した神経筋接合部を、高カリウム濃度で刺激し、膜の内部移行を誘導しました。ここでは、FM 1-43を用いて染色した様子を示しています。神経末端の蛍光は、一般的な落射蛍光顕微鏡を用いて観察することができます。連続照射下では、色素は完全に退色し、さらに照射を続けると、ジノベンジンの沈殿により黒色が出現します。この神経末端にはシナプス小胞が含まれていますが、それらのいずれも光変換はされていません。これは、照明不足または組織へのDIAアミノベンゼンの浸透不十分が原因である可能性があります。対照的に、照明が強すぎると全体的に末端が暗くなり、小胞やオルガネラを識別できなくなります。適切な量の照明による光変換は、適切に観察可能です。この顕微鏡写真では、暗い小胞の集まりが見えるシナプスボタンが示されており、FM光変換が起こっていることがわかります。femダイで標識したシナプス小胞を光変換する方法について説明しました。この手順を行う際は、変換ステップにおける照射時間を常に注意深く校正することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この報告書は、添付されたシナプス前boutonsを保持する個々の実行可能な神経細胞の機械的な分離のためのテクニックを示しています。...

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。...

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

このビデオは、チャネルロドプシンを発現するショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でのシナプス小胞のリサイクルを蛍光色素を使用して研究するプロトコルを示しています。青色光はチャネルロドプシンを活性化し、カルシウムの流入とシナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こします。この色素は神経膜に組み込まれ、エンドサイトーシス中に内在化されるため、蛍光が増強されます。さらにブルーライト刺激を受けると、エキソサイトーシスと色素の放出が誘発され、これは蛍光の減少によって示されます。...

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

このビデオでは、リサイクルされたシナプス小胞の光学分析のために培養ニューロンを準備する手順を示しています。このプロセスには、シナプス小胞タンパク質の蛍光標識と免疫染色が含まれ、ニューロン内のリサイクルされた小胞を標識して視覚化します。...

リサイクルシナプス小胞の光学解析のための培養ニューロンの準備

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。...

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

この論文は、シナプトブレビン2-pHluorinコンストラクトと全反射蛍光顕微鏡を使用して、神経芽細胞腫細胞における神経伝達物質小胞動態を調査する方法を提供します。また、画像処理とデータ分析のために開発された戦略についても報告されています。...

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。...

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ)...

シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

シナプス小胞 (SV) 培養神経細胞におけるリサイクルの光分析について述べる。このプロトコルを組み合わせて二重トランスフェクション シナプス...

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

学ぼう、FM染料の光変換法を用いてDrosophila melanogasterの神経筋接合部におけるシナプス小胞プールを可視化する手法。この方法はシナプス動態のメカニズム解明に有用です。

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

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