Name: 軟骨欠損のヒト間葉系幹細胞を標識Ferumoxidesの注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: 学ぶ軟骨欠損修復のためのマトリックス関連幹細胞インプラント作成法。Ferumoxidesで標識した間葉系幹細胞を7T MRスキャナーで可視化し、非侵襲的な追跡を実現します。

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この作品は、関節炎の国立研究所からの助成金と筋骨格皮膚疾患、NIH RO1AR054458によってサポートされていました。

1。 EndoremとhMSCのラベリング<ol><li>細胞は、少なくとも18時間標識の前に80％コンフルエントに増殖させる。 </li><li>この時間の間に、ラベルのメディアは、100μgの鉄/ mlの無血清培地の用量でサンプルにEndoremを加えることによって調製される。 </li><li>細胞がコンフルエントに増殖された後、培地を吸引し、細胞をPBSまたは無血清培地で1 ×洗浄する。 </li><li>次に、リンス液を吸引され、以前に作成したラベルのメディアが追加されます。次に、細胞を37℃でインキュベートする° C、4時間、5％CO 2を 。 </li><li> 4時間インキュベーションした後、メディアをラベル付けすることによって、吸引し、細胞をPBSですすぎ、いつものようにトリプシン処理されています。 </li><li>一度トリプシン、細胞をPBSで3回洗浄し、5分間400rcfで遠心分離されています。 </li><li>この洗浄ステップの後、細胞は、懸濁し数え、生存率を評価し、実験のために必要に応じて使用されています。 </li></ol> 2。アガロースの準備<ol><li>細胞が標識されている後には、アガロース溶液を準備する時間です。 </li><li>ファインスケールでは、アガロースの粉末80mgを秤量しているとPBSの2ミリリットルに追加。 </li><li>この溶液を穏やかに振とうし、オートクレーブ処理しています。 </li><li>約40分後に、流体アガロース溶液をオートクレーブから取り出すことができる。音量を測定し、予熱されたPBSで適宜調整する必要があります。 </li><li>次いで溶液を42に冷却される° C </li></ol> 3。 MASIの作成<ol><li>アガロース溶液が所望の温度に達すると、細胞は1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ内の最後の時間をカウントし、遠心分離されています。 </li><li>遠心後、上清を捨て、細胞を30 × 10 6細胞/ mlの濃度に達するようにDMEMと混合されています。 </li><li>今細胞は42℃の温かいアガロースと混合されています。 </li><li>コー​​ルドピペットチップは、アガロースが先端の内部に固化する可能性があります、したがって、それは上下ホット滅菌PBSをピペッティングすることにより予熱するためのヒントをお勧めします</li><li>今、均一な懸濁液が作成されるようにメディアが取り上げて細胞メディア懸濁液と十分に混合されているアガロースの同じボリューム。 </li><li>アガロースが固化するのに十分クールダウンしないように混合しながら予熱した水浴内部エッペンドルフチュー​​ブを保管してください。 </li><li>懸濁液が均質になると、細胞が欠損に移植されています。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1793/1793fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。軟骨欠損に移植hMSCsと膝蓋骨試料の冠状T2強調SE像（TR 4000 msに/ TE 18.27ミリ秒）。

<ol><li>Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+and+functional+maturation+of+bovine+mesenchymal+stem+cells+in+long-term+agarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Rahfoth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+allograft+chondrocytes+embedded+in+agarose+gel+into+cartilage+defects+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).</li>
<li>Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+hESCs+and+hMSCs+with+iron+oxide+nanoparticles+for+non-invasive+in+vivo+tracking+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

記述されているプロトコルは、酸化鉄ナノ粒子でのMSCラベルを付けたり、軟骨の欠損にこれらの標識MSCを移植する再現可能な方法を提供します。この手法は、MASIの障害の早期発見を可能にするMRイメージング、と軟骨欠損における幹細胞移植の非侵襲的な描写を可能にします。標識された細胞の転位または流出がMR画像上に移植のサイトからラベルの消失に基づいて診断することができます。これらのイベントの早期診断が望ましいと不必要な代替の侵襲的な診断手順から患者を防ぐことができます。 MASI成果を診断するために記載の非侵襲的方法は、変形性関節症の軟骨再生のための細胞ベースの治療法の開発に成功役立つ可能性。我々のプロトコルが現在前臨床in vivoでの研究に適用され、原理的には臨床的に適用できるだろうと臨床実践におけるMASI療法の評価のために非侵襲的なアウトカム指標となりうる。

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; free)</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.05%</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>25399-120</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td></td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Typ VII</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9045</td><td>PBSで最終濃度4%に希釈したアガロース</td></tr></tbody></table>

軟骨欠損のヒト間葉系幹細胞を標識ferumoxidesの注入

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

ティッシュエンジニアリングの分野では、特定の細胞や機能的な組織の再生に向けたエンジニアリング、細胞生物学と医学の原理を統合しています。マトリックス関連する幹細胞移植（MASI）は関節炎や外傷性関節損傷に起因する軟骨欠損を再生成することを目指しています。成体間葉系幹細胞（MSC）は、軟骨系統の細胞に分化する能力を持っていると、セルベースの​​関節軟骨の修復技術のための有望な結果が示されている。自家のMSCは、組織の様々な単離することができるが、その分化能を失うことなく、細胞培養に拡大することができる、とin vitroおよび in vivo 1、2 の軟骨細胞分化を示している。 軟骨欠損にローカル保存し、移植したMSCsの実行可能性を提供するために、足場はまた、その後の分化と増殖をサポートする、必​​要とされる。足場ガイド組織形成のアーキテクチャとは、幹細胞が産生する細胞外マトリックスは、、拡大することが可能。以前の調査では、2％アガロース足場が安定した硝子軟骨の開発をサポートする可能性がありますし、免疫応答3を誘発しないことが示されている。 MASIの移植された幹細胞の長期保存には、軟骨再生のための非常に重要です。酸化鉄ナノ粒子とMSCのラベルは、非侵襲的なMR撮像技術4をin vivoでの追跡では 、長期が可能になります。 このプレゼンテーションでは、酸化鉄ナノ粒子で標識MSCは、軟骨欠損に細胞 - アガロース構造とこれらの構造の注入を生成するためのテクニックを紹介します。標識された構造は、MRイメージングとの非侵襲的に追跡することができる。

プレゼンテーションの目的は、MRイメージングで可視化することができます軟骨欠損におけるマトリックス関連する幹細胞移植を、生成するために高度に再現可能な方法を示すことです。幹細胞は、アガロースと混合のFDA承認されたFerumoxides、、軟骨欠損に移植し、7T MRスキャナで撮像で標識されています。

軟骨欠損のヒト間葉系幹細胞を標識Ferumoxidesの注入

組織工学の分野は、特定の細胞および組織の再生に向けて、工学、細胞生物学、および医学の原理を統合したものである。

本プレゼンテーションの目的は、幹細胞療法の追跡を目的とした、パラオキシド標識HMEを用いたMASI作製の簡便かつ再現可能な手法を実証することです。MRイメージング標識では、培地を調製してT 75フラスコに加え、4時間インキュベートします。その後、細胞をトリプシン処理し、洗浄します。洗浄後、3回細胞を再懸濁させ、チューブにアグロスゲルを加えます。これで、細胞を軟骨欠損部に移植する準備が整いました。こんにちは、アレックスです。カリフォルニア大学サンフランシスコ校放射線科の造影剤研究室、High Delta Blinkの研究室から参りました。私はLydia Menです。同じく造影剤研究室に所属しております。本日は、間葉系幹細胞を酸化鉄ナノ粒子で標識し、細胞アグレゲート構造体を形成させ、これらの構造体を軟骨欠損部に移植する手順をご紹介します。当研究室では、この手法を用いて磁気共鳴画像法（MRI）による間葉系幹細胞の非侵襲的な追跡を行っています。それでは、始めていきましょう。まず、ラベル化を行う少なくとも18時間前に、細胞をコンフルエンス 80%まで増殖させます。この間に、細胞がコンフルエントになった際にすぐに使用できるよう、ラベル化用培地を調製します。調製方法は、血清不含培地 1 mLあたり 100 µg の鉄の用量で、end durumをサンプルに添加してください。細胞がコンフルエントに達した後、培地を吸引し、PBSまたは無血清培地で細胞を洗浄します。次に、洗浄液を吸引し、調製した標識培地を加えます。37 °C、5% CO2条件下で細胞を4時間インキュベートします。4時間のインキュベーション後、ラベル化培地を吸引除去します。細胞をPBSで洗浄し、その後トリプシンで処理します。トリプシン処理後、細胞をPBSで3回洗浄し、400 RCFで5分間遠心分離します。この洗浄ステップの後、細胞を再懸濁して計数し、生存率を評価し、最後に必要に応じて実験に使用します。それでは、マトリックス結合幹細胞インプラントの作製方法を見てみましょう。まず、新鮮なアガロ溶液を調製することから始めてください。Agaroseを42°Cまで冷却した後、細胞数を計測し、1.5 mLのエッペンドルフチューブで遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、細胞をDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）で懸濁して、濃度を30×10⁶ cells/mLに調整します。細胞を温めたAgaroseと混合する前に、温まった滅菌PBSをピペットで吸い上げ、出し戻すことでピペットチップを予熱してください。これにより、チップ内でのAgaroseの凝固を防ぐことができます。次に、培地と同量のagrosを採取し、気泡が生じないように注意しながら、細胞懸濁培地と十分に混合させます。懸濁液が均質になるまで、agrosが冷却されて凝固しないよう、混合中はエピーンドールチューブを予熱したウォーターバスに入れておきます。細胞を欠損部に移植し、これでMRイメージングの準備が整いました。次に、代表的な結果として、まず標識技術、次に移植技術について示します。標識後も、フラスコ内の細胞は未標識の細胞と同様の外観を維持しています。予想通り、Caspase threeテストで示されたように、標識細胞の生存率に変化はありませんでした。ラベル化された細胞とアグロースを組み合わせると、T2強調MR画像に示されるように、インプラントにおける信号消失が起こります。一方、ラベル化されていない細胞では信号は認められません。細胞アグロース構築物の切片をプルシアンブルーで染色し、細胞内への鉄蓄積を確認します。以上で、酸化鉄ナノ粒子を用いて間葉系幹細胞を標識する方法、標識細胞を用いてアガロース構築物を creating する方法、およびそれらを軟骨欠損部に移植する方法について解説しました。この手順を行う際は、温めたアガロースを細胞培地懸濁液に加える前に、ピペットチップを予熱しておくことが重要です。また、Mr.Imagingにおいて気泡の形成を避けることが極めて重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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